Summary
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af mikroRNA-ekspression i rotte-peritoneal membran ved anvendelse af kvantitativ revers-transkriptionspolymerase-kædereaktion i realtid. Denne metode er egnet til at studere mikroRNA ekspressionsprofilen i rotte peritoneal membran i flere patologiske tilstande.
Abstract
MicroRNA'er (miRNA'er) er små ikke-kodende RNA'er, som regulerer messenger-RNA-ekspression efter transskriptionelt. MiRNA ekspressionsprofilen er blevet undersøgt i forskellige organer og væv i rotter. Standardmetoder til rensning af miRNA'er og påvisning af deres ekspression i rotteperitoneal membran har imidlertid ikke været veletablerede. Vi har udviklet en effektiv og pålidelig metode til at rense og kvantificere miRNA'er ved hjælp af kvantitativ revers-transkriptionspolymerase kædereaktion (qRT-PCR) i rotte peritoneal membran i realtid. Denne protokol består af fire trin: 1) oprensning af peritoneal membranprøve; 2) oprensning af totalt RNA inklusive miRNA fra peritoneal membranprøve; 3) revers transkription af miRNA til fremstilling af cDNA; Og 4) qRT-PCR til påvisning af miRNA-ekspression. Ved hjælp af denne protokol fastslog vi med succes, at udtrykket af seks miRNA'er (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p) stegSignifikant i peritonealmembranen af en peritoneal fibrose-model af rotte sammenlignet med dem i kontrolgrupper. Denne protokol kan bruges til at studere profilen af miRNA-ekspression i peritonealmembranen hos rotter under mange patologiske tilstande.
Introduction
MicroRNA'er (miRNA'er) er korte, ikke-kodende RNA'er, som post-transkriptionelt regulerer messenger-RNA (mRNA) -ekspression 1 . Ændringer i udtrykket af miRNA regulerer ekspressionen af mange mRNA'er, der spiller pivotale roller i forskellige patologiske tilstande, herunder kræft, betændelse, metaboliske forstyrrelser og fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Derfor har miRNA'er potentiale som nye biomarkører og terapeutiske mål 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA ekspressionsprofilen er blevet bestemt i forskellige rotterOrganer og væv, herunder lever, hjerte, lunge og nyre 9 . Standardmetoder til oprensning og påvisning af miRNA'er i rotteperitoneal membran er imidlertid ikke veletablerede.
Det overordnede mål med denne protokol er at med succes rense og detektere miRNA'er i rotteperitoneal membranen. For det første blev peritonealmembranprøven homogeniseret ved anvendelse af en glashomogenisator efterfulgt af eksponering for et biopolymer-nedbrydningssystem i en mikrocentrifugespaltkolonne 10 . Dernæst blev total RNA inklusive miRNA oprenset fra peritonealmembranprøven under anvendelse af en silicium-membranbaseret spin-søjle 10 . Derefter blev cDNA syntetiseret fra det oprensede totale RNA under anvendelse af revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer 11 . Endelig blev udtrykket af miRNA bestemt ved hjælp af qRT-PCR under anvendelse af et interkalerende farvestof 11 . Begrundelsen for denne protokol er bAsed på tidligere undersøgelser, der viste signifikant oprensning og påvisning af miRNA i væv ved en simpel proces 8 , 10 , 11 . Det er blevet rapporteret, at anvendelsen af et biopolymer-shredding-system i en mikropentrifugespaltkolonne og silikamembranbaseret spin-søjle kan rense højkvalitets total RNA fra væv 10 . Fremgangsmåden til syntetisering af cDNA fra oprenset total RNA under anvendelse af revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer og fremgangsmåden til påvisning af miRNA ekspression ved hjælp af qRT-PCR under anvendelse af interkalerende farvestof i denne protokol er blevet rapporteret at vise høj nøjagtighed og Følsomhed 11 . Derudover er dette en simpel proces, hvilket sparer tid og forhindrer teknisk fejl. Derfor er denne protokol nyttig i studier, der kræver meget præcis og følsom påvisning af miRNA i rotteperitoneal membran i en bred vifte af patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøgsprotokoller blev godkendt af dyreetiske udvalg ved Jichi Medical University og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for anvendelse og pleje af eksperimentelle dyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Peritoneumprøveindsamling
- Saml følgende emner: 50 ml centrifugerør med bomuld drenket i isofluran, korkplade, petriskål med fosfatbufret saltvand (PBS), kirurgiske saks og tang.
- Euthanize en rotte med en overdosis isofluoran, derefter spray rottens abdominal hud med 70% ethanol, og monter rotten på korkpladen på ryggen.
- Lav et langsgående snit i abdominal hud, muskel og peritoneal membran ved hjælp af saks og tang.
- Pick up peritoneal membranen ved hjælp af tang og lav horisontale indsnit på sin øvre del langs den laveste ribbenben under membranen og på dens lSide på den laterale region ved hjælp af kirurgiske saks. Derefter laves laterale langsgående snit for at fjerne peritoneal membranen fra kroppen ved hjælp af kirurgiske saks. Derefter vaskes det med PBS i en petriskål.
- Klipp ud og trim 20 mg (3-5 mm 2 ) peritoneal membranprøver, som er en passende størrelse til de følgende trin ved hjælp af kirurgiske saks og tang.
2. Rensning af totale RNA'er fra peritoneale membranprøver
OBS: Her homogeniseres peritoneale membranprøver, der vejer 20 mg, ved hjælp af en glashomogenisator og et biopolymer-shredding-system i en mikrocentrifugespaltkolonne. Derefter isoleres det totale RNA fra peritonealmembranprøven under anvendelse af en silikamembranbaseret spin-søjle.
- Saml følgende punkter: 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugerør, 100% ethanol, chloroform, glashomogenisator, is, biopolymer-nedbrydningssystem i en mikrocentrifugerspids kolonne 10 10 , phenol / guanidinbaseret lysereagens, vaskebuffer, der indbefatter guanidin og ethanol (vaskebuffer 1) og vaskebuffer indeholdende ethanol (vaskebuffer 2).
- Sæt en 20 mg peritoneal membranprøve i en glashomogenisator og tilsæt 700 μL af phenol / guanidinbaseret lysereagens.
- Homogeniser peritoneal membranprøven ved langsomt at trykke pestlen på prøven med vridning. Gentag denne proces adskillige dusin gange på is, indtil peritonealmembranprøven er fuldstændigt opløst i det phenol / guanidinbaserede lysisreagens.
- Til yderligere homogenisering overføres homogeniseret lysat til biopolymer-shredding-systemet i en mikrocentrifugespaltkolonne i et 2,0 ml opsamlingsrør. Derefter centrifugeres den ved 14.000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Overfør det homogeniserede lysat til et nyt mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 140 μL chloroform til det homogeniserede lysat og luk karretE sikkert. Derefter blandes røret ved inversion i 15 s.
- Inkuber prøverne i 2-3 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger dem derefter ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (sædvanligvis 300 μL) til et nyt mikrocentrifugerør uden at forstyrre bundfaldet, og tilsæt 1,5 gange dets volumen (normalt 450 μL) 100% ethanol. Derefter blandes prøven ved vortexing i 5 s.
- Pipetter op til 700 μL af prøven i en silikamembranbaseret spin-kolonne anbragt i et 2,0 ml opsamlingsrør. Luk kolonnen til kolonnen. Derefter centrifugeres den ved 15.000 xg i 15 s. Efter centrifugering kasseres gennemstrømningen i opsamlingsrøret.
- Tilsæt 700 μl vaskebuffer 1 til den silikamembranbaserede spin-kolonne for at vaske prøven strengt. Luk kolonnen til kolonnen. Derefter centrifugeres den ved 15.000 xg i 15 s. Efter centrifugering kasseres gennemstrømningen i opsamlingsrøret.
- Tilsæt 500 μl vaskebuffer 2 til silicium-membranenRane-baseret spin kolonne for at fjerne noget spor af salt. Luk kolonnen til kolonnen. Derefter centrifugeres den ved 15.000 xg i 15 s. Efter centrifugering kasseres gennemstrømningen i opsamlingsrøret.
- Gentag 2.11.
- Centrifug den silikamembranbaserede spin-kolonne igen ved 15.000 xg i 1 min. Efter centrifugering kasseres gennemstrømningen i opsamlingsrøret.
- Anbring den silikamembranbaserede spin-søjle i et nyt 1,5 ml opsamlingsrør. Derefter overføres 25 μl RNase-frit vand ind i søjlen. Luk kolonnen til kolonnen. Forlad prøven ved stuetemperatur i 5 minutter. Derefter centrifugeres den ved 15.000 xg i 1 min.
- Overfør 25 μL eluatet indeholdende totalt RNA til et nyt mikrocentrifugerør. Derefter opbevares ved -80 ° C før brug.
3. Reverse transkription af total RNA
BEMÆRK: Reference og overholdelse af minimumsoplysninger til offentliggørelse af kvantitativ real-time PCR-ekspertIMS (MIQE) retningslinjer tilskynder til bedre praksis og hjælp til opnåelse af pålidelige og utvetydige resultater 12 .
BEMÆRK: Her er i alt 1,0 μg isoleret RNA revers-transkriberet under anvendelse af revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer.
- Saml følgende punkter: 1,5 ml mikrocentrifugerør; Otte-brønds strimmelrør; RNase-frit vand; is; Reverse transkriptase kit (se materialetabellen) 11 .
- Forbered en master mix løsning, der indeholder 2,0 μL 10x nukleinsyre blanding, 2,0 μL reverse transkriptase mix (fra kit) og 4,0 μL 5x hi-spec buffer for i alt 8,0 μL per rør.
- Dispense 8,0 μL master mix-opløsning (fra sættet) i hvert rør.
- Mål mængden af totale RNA'er ved hjælp af et spektrofotometer. Tilsæt 1,0 μg isolerede totale RNA'er oprenset fra peritoneal membranprøven til hvert rør.
BEMÆRK: qRT-PCR kan udføres usiNg totale RNA'er som en skabelon uden omvendt transkription til kvalitetskontrollen af rensede totale RNA'er. Hvis noget DNA er forurenet, observeres uventede amplifikationsprodukter ved hjælp af qRT-PCR. - Tilsæt RNase-frit vand til hvert rør til i alt 20 μl. Bland derefter grundigt ved pipettering og centrifuger det i 15 s.
- Inkuber prøverne i 60 minutter ved 37 ° C. Inkubér straks i 5 minutter ved 95 ° C.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres i en termisk cykler. - Overfør cDNA til et nyt mikrocentrifugerør og fortynd ti gange (1:10) med RNase-frit vand.
- Opbevar det fortyndede cDNA på is midlertidigt og ved -80 ° C i længere tid før brug.
4. qRT-PCR af miRNA
BEMÆRK: qRT-PCR af miRNA udføres under anvendelse af interkalerende farvestof. Her primere for RNA, U6 lille nukleare 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p blev brugt.
- Saml følgende punkter: 1,5 ml mikrocentrifugerør, 96-brønd reaktionsplade til qRT-PCR, klæbende film til 96-brønds reaktionsplade, miRNA-specifikke primere, grønt farvestofbaseret PCR kit (se materialetabel) 11 og en Real-time PCR instrument.
- Forbered en master blanding indeholdende 12,5 μL 2x PCR master mix, 2,5 μL 5 μM hver miRNA primer opløst i nuklease-frit vand og 1,25 μL 10x universal primer for hver brønd.
- Dispense 22,5 μL master mix i hver brønd på 96-brøndspladen.
- Tilsæt 2,5 μl template cDNA til hver brønd.
- Pak pladen med klæbende film til 96-brønds reaktionspladen. Centrifuger derefter pladen ved 1.000 xg i 30 s.
- Kør PCR-cyklusprogrammet med real-time PCR Instrument og software som følger.
- Indstil pladen i realtid PCR instrumentet. I realtids-PCR-softwaren defineres eksperimentelle egenskaber (input eksperimentelleNavn, vælg "96 brønde" for den eksperimentelle type instrument, vælg "2 - ΔΔCT metode" til kvantificeringsmetoden, vælg "SYBR green reagents" for reagenset til at detektere målsekvensen, vælg "standard rampehastighed" for Instrumentkørsel).
- Derefter tildele navne til prøverne og mål miRNA'er i hver brønd. Prøver testes altid i to eksemplarer eller tre eksemplarer for at opnå tilstrækkelige data til validering af resultaterne. Vælg referenceprøve og endogen kontrol. Vælg "none" for farvestoffet til brug som den passive reference.
- Indlæs et reaktionsvolumen på "20 μL" og de følgende PCR-cykliske forhold i realtids-PCR-softwaren i overensstemmelse med instruktionerne: forinkubation ved 95 ° C i 15 minutter og derefter 40 cykler af denaturering ved 94 ° C i 15 s , Annealing ved 55 ° C i 30 s og forlængelse ved 70 ° C i 30 s.
- Analysér qRT-PCR data uSyng software af real-time PCR instrument. Bekræft, at tærsklen og basislinjen, der automatisk bestemmes af software, er passende i hver brønd.
- Kontroller tærskelcyklussen for mål-miRNA'er i hver prøve. Tærskelcyklussen er skæringspunktet mellem en amplifikationskurve og en tærskellinie. Dernæst normaliserer ekspressionsniveauet for mål-miRNA'er mod RNU6-2 som en endogen kontrol og beregner det relative ekspressionsniveau for mål-miRNA'er ved anvendelse af 2 -ΔΔCT- metoden 13 .
BEMÆRK: Det skal bemærkes, at stabiliteten af ekspressionsniveauet for endogen kontrol miRNA skal verificeres. I dette forsøg blev RNU6-2 bekræftet at blive udtrykt på højt niveau og forholdsvis invariant på tværs af hver gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultater, der præsenteres her, er baseret på vores tidligere rapporterede undersøgelse 8 . Vi undersøgte miRNA ekspressionsprofilen i peritoneal fibrose. Peritoneal fibrose er en vigtig komplikation ved peritoneal dialyse. Det er karakteriseret ved tab af mesothelialcelle-monolaget og den overskydende akkumulering af ekstracellulære matrixkomponenter og er forbundet med peritoneal membranfejl 14 , 15 . En peritoneal fibrose rotte model blev fremstillet ved intraperitoneal injektion af 100 ml / kg peritonealdialysevæske (2,5% glucose, 100 mM NaCl, 35 mM natriumlactat, 2 mM CaCl2 og 0,7 mM MgCl2 indeholdende 20 mM methylglyoxal) i 5 Dage i ugen i 3 uger til hanrotter i alderen 12 uger og med kropsvægt på 230-250 g 16 . Følgende grupper fungerede som kontroller: rotter uden behandling (mock rotter) og rotter injiceretMed peritonealdialysevæske uden methylglyoxal (kontrolrotter). Baseret på miRNA microarray screening fandt vi, at niveauerne af seks miRNA'er (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p) Signifikant øget i peritonealmembranen hos peritoneale fibrose rotter sammenlignet med dem i mock rotter og kontrol rotter ved anvendelse af qRT-PCR efter protokollen præsenteret i dette manuskript ( figur 1 ) 8 .
Figur 1: Opregulerede miRNA'er i peritoneal membran af peritoneale fibrose rotter. QRT-PCR-bestemmelse af ekspressionen af miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p i mock rotter (n = 6) , Kontrolrotter (n = 6) og peritoneale fibrose rotter (n = 6). Værdier er den gennemsnitlige ± standardfejl (fejlfelter). Variansanalyse(ANOVA) blev ansat for at undersøge forskelle mellem grupper. Hvis statistisk signifikans blev påvist af ANOVA, blev Tukeys test udført som en post-hoc-analyse for at sammenligne midlerne fra to forskellige grupper. Forskelle med en p-værdi <0,05 blev betragtet som signifikante. Forkortelser: qRT-PCR, kvantitativ revers-transkriptionspolymerase kædereaktion i realtid; MiRNA'er, mikroRNA'er; NS, ikke signifikant; *, P <0,05. Denne figur er blevet modificeret fra Morishita et al. 8 (med tilladelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved anvendelse af protokollen, der er præsenteret i dette manuskript, blev miRNA'er i rotteperitoneal membran renset med succes og detekteret under anvendelse af qRT-PCR. Pålideligheden af qRT-PCR-dataanalyse afhænger af kvaliteten af rensede miRNA'er. Derfor kan renheden af miRNA'er kontrolleres før qRT-PCR ved forholdet mellem absorbans ved 260 nm og det ved 280 nm, der kan måles under anvendelse af et spektrofotometer. Når signifikant amplifikation af miRNA ikke kan opnås ved anvendelse af qRT-PCR, kan koncentrationen af template cDNA forøges. Koncentrationen af hver miRNA-specifik primer kan også øges.
Der er flere alternative metoder til bestemmelse af niveauet af miRNA-ekspression, herunder mikroarray, Northern blotting og ribonuclease protection assay. QRT-PCR er en følsom, høj gennemstrømningsprocedure, der kræver en minimal mængde prøve sammenlignet med Northern Blotting eller Ribonuclease Protection Assay. Microarrays muliggør undersøgelse af expRession af mange miRNA'er samtidigt, og dataene viser generelt en stærk korrelation med data opnået ved qRT-PCR 17 ; Der er imidlertid ikke opnået enighed om en metode, som kan bekræfte validiteten af sammenligninger af mikroarray data mellem forskningsgrupper 18 .
Denne protokol har følgende begrænsninger. For det første er validering af miRNA-detektion ved denne protokol ikke blevet verificeret i andre organer såsom lever, lunge og nyre. For det andet er det heller ikke blevet verificeret i andre forsøgsdyr, herunder mus, hamster, hund og svin. Platformen for denne protokol til rensning af miRNA'er ved anvendelse af en biopolymer-shredding-spids-søjle og en silicagembranbaseret spidssøjle og påvisning af miRNA'er ved anvendelse af qRT-PCR er blevet rapporteret at være i stand til at rense høj kvalitet RNA fra væv og Viser høj nøjagtighed og følsomhed til påvisning af miRNA-ekspression 10, 11 . Vi viste også, at detekteringen af miRNA-ekspression i rotteperitoneal membran kan udføres med denne protokol. Denne protokol kan anvendes til undersøgelser, der undersøger profilen af miRNA-ekspression i peritonealmembranen hos rotter i en bred vifte af patologiske tilstande. Derudover kan mange prøver behandles sammen ved hjælp af denne protokol, fordi det indebærer en simpel proces. Derfor er denne protokol nyttig til studier, der kræver analyse af ekspressionsprofilen for mange miRNA'er i forskellige patologiske tilstande af peritonealmembranen.
Der skal tages hensyn til flere kritiske punkter, når du følger denne protokol. Først skal prøver indeholdende rensede RNA'er placeres på is for at undgå nedbrydning. Hertil kommer, at homogeniseringssteget skal udføres på is for at beskytte RNA'er mod varmedbrydning. Desuden bør peritoneale membranprøver være tilstrækkeligt homogeniserede, indtil de har coMpletely opløst i lysisreagens, og brugen af en søjlefjerner til yderligere homogenisering anbefales, fordi peritoneale membranprøver indeholder væsentligt bindevæv, som er resistent over for opløsning ved homogenisering. For det andet skal stabiliteten af ekspressionsniveauet for endogent kontrol miRNA verificeres over den eksperimentelle opstilling i qRT-PCR. Dette er nødvendigt, fordi forskellige patologiske tilstande, hvor denne procedure kan anvendes, kan påvirke ekspressionsniveauerne for endogene kontrol miRNA'er, hvilket kan kompromittere resultaterne.
Som konklusion har vi beskrevet en protokol til oprensning og påvisning af mikroRNA-ekspression i rotte-peritoneal membran under anvendelse af qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Miyako Shigeta for hendes fremragende teknisk support. Dette arbejde blev delvist støttet af JSPS KAKENHI (bevillingsnummer 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
