Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro og i Vivo vurdering av T, B og myeloide celler undertrykkende aktivitet og humorale svar fra transplantasjon mottakere

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å indusere toleranse i transplantasjon, og vurdere i vitro og i vivo undertrykkende kapasiteten til forskjellige celle undergrupper fra mottakeren og immunsystemet status mottakeren mot donor eller eksogene antigener.

Abstract

Den største bekymringen i transplantasjon er å oppnå bestemte toleransegrenser gjennom induksjon av regulatoriske celler. Forståelsen av toleranse mekanismer krever pålitelig modeller. Her beskriver vi modeller toleranse til hjerte allograft i rotte, indusert blokade av costimulation signaler eller oppregulering av immunoregulatory molekyler gjennom genoverføring. Hver av disse modellene tillatt i vivo generasjon av regulatoriske celler som regulatoriske T-celler (Tregs), regulatoriske B-celler (Bregs) eller regulatoriske myeloide celler (RegMCs). I dette manuskriptet beskrive vi to utfyllende protokoller som er brukt til å identifisere og definere i vitro og vivo regulatoriske celle aktivitet for å finne deres ansvar i toleranse induksjon og vedlikehold. Først i vitro undertrykkende analysen tillatt rask identifikasjon av celler med undertrykkende kapasitet på effektor immunreaksjoner i en dose avhengige måte, og kan brukes for videre analyse som cytokin måling eller cytotoksisitet. Andre markert adoptivforeldre overføring av celler fra en tolerant behandlet mottaker til en nylig bestrålt podet mottaker, tolerogenic egenskapene til disse cellene i kontrollere pode regissert immunreaksjoner og/eller konvertering av nye regulatoriske celler ( kalt smittsomme toleranse). Disse metodene er ikke begrenset til celler med kjente fenotypiske markører og kan utvides til enhver celle befolkningen. Videre rettet donor allospecificity av regulatoriske celler (et viktig mål innen) kan vurderes ved hjelp av tredjeparts giver celler eller pode i vitro eller i vivo. Til slutt, for å finne bestemte tolerogenic kapasiteten på disse regulatoriske celler, vi gir for å vurdere humoral anti-giver antistoff svarene og kapasiteten til mottakeren å utvikle humoral svar mot nye eller tidligere kjent antigener. Modeller av toleranse beskrevet kan brukes til å karakterisere ytterligere regulatoriske celler, for å identifisere nye biomarkers og immunoregulatory molekyler, og kan tilpasses andre transplantasjon modeller eller autoimmune sykdommer i gnagere eller menneskelig.

Introduction

CARDIAC allograft i rotte er en pålitelig organ transplantasjon modell å vurdere toleranse induksjon behandlinger, dechiffrere mekanismer for toleranse induksjon og vedlikehold, og har potensial til å indusere funksjonelt kompetente og dominerende regulatoriske celler. Protokollene nedenfor beskriver en fullt feil heterotopic hjerte pode fra Lewis 1W donor rotte (LEW.1W, RT1u) i en Lewis 1A mottaker rotten (LEW.1A, RT1en). I denne pode kombinasjon, akutt avvisning skjer raskt (i ca 7 dager) og kan lett bli vurdert av pode slo måling gjennom palpasjon over magen. Her foreslår vi tre protokoller for å indusere toleranse av cardiac allograft i rotte. I disse modellene, toleranse indusert og/eller vedlikeholdes av forskjellige regulatoriske celletyper. Første, blokkering av CD40-CD40L vekselsvirkningene med en adenovirus koding CD40Ig (AdCD40Ig) indusert generering av CD8+ Tregs kan indusere toleranse når adoptively overføres til podet mottakere1. Videre uttømming av CD8+ celler (med anti-CD8α antistoffer) i AdCD40Ig-behandlet mottakere genereres Bregs og RegMCs2. Analysering av CD8+ Tregs egenskaper valgte nøkkel flere immunoregulatory molekyler definert som interleukin-34 (IL-34) og Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mens overuttrykte IL-34 (med en AAV vektor) indusert Tregs gjennom generasjon av RegMCs, indusert overuttrykte FGL-2 Bregs, underliggende komplekse nettverk av regulatoriske celler.

Fordi kronisk avvisning langsomt og er langsiktig, kreves en grundig analyse å skille toleranse mot kroniske avvisning. Pode er vanligvis vurdert for cellen infiltrasjon, fibrose, fortykkelse av vaskulære veggen og utfyller C4d deponering av immunohistology7. Mens histology metoder krever dyr offer eller pode biopsi, her beskriver vi en enkel metode for å vurdere ulike funksjonene i tolerert allograft: fremveksten og funksjon av regulatoriske celler og anti-giver spesifikt antistoff svar fra blod eksempel av flowcytometri (her, vi brukte fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)).

Vedlikehold av toleranse i allograft etter arrestasjonen av behandling er vanligvis forbundet med induksjon av regulatoriske celler8. I de siste tiårene, studier fokuserte på CD4+Tregs enstemmig preget dem ved de sentrale Foxp3+CD25høyog CD127-9,10,11. Tilsvarende flere markører ble tilskrevet CD8+ Tregs, som CD122+, CD28-, CD45RClav, PD1+, og Helios1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over år, uttrykk for GITR og CTLA4 cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var i tillegg knyttet til en Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Imidlertid nye regulatoriske celle populasjoner, som Bregs, RegMCs eller NKTregs, mangle relevante bestemte markører. Faktisk Bregs er hovedsakelig ferdigmeldt av umoden CD24+ celler, med tvetydig CD27 uttrykk og noen ganger produksjon av IL-10, TGFβ eller granzyme B22,23,24. Kompleksiteten i myelogen celle avstamning krever en kombinasjon av flere indikatorer som definerer sin regulerende eller proinflammatory profil som CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Endelig noen markører er rapportert å identifisere NKTregs som CD11b+, CD27+, TGFβ+, men flere studier trengs for å fremme svært beskrive dem27,28,29 ,30,31,32. Dermed bevis undertrykkende aktivitet må legitimere ytterligere fenotypiske beskrivelse for identifisering av nye biomarkers, nye immunoregulatory meglere, og å utvide omfanget til ny cellen terapi.

Vi foreslår to utfyllende metoder for å evaluere undertrykkende aktiviteten til cellene. Først i vitro metoden består av dyrking undertrykkende celler med merket effektor T celler stimulert av allogene donor antigen presentere celler (APCs) på forskjellige forhold over 6 dager, og analysere effektor T celle spredning som gjenspeiler donor-rettet uimottakelig undertrykkelse. Celler fra behandlet rotter kan sammenlignes direkte til celler fra naiv rotter og ikke-behandlet podet rotter undertrykkende aktivitet (eller andre regulerende celle befolkningen), i en rekke suppressor: effektor prosenter. Videre er denne metoden krever ikke noen transplantasjon, og får resultater innen 6 dager. Andre består metoden i vivo av overføre beregnet regulatoriske cellene fra rotte behandlet til en nylig bestrålt podet mottaker. Mens B celler, myeloide celler eller T celler fra ikke-behandlet naiv rotter er vanligvis hemme akutt avvisning og forlenge pode overlevelse ved adopsjon overføring, celler med kraftig undertrykkende aktivitet fra behandlet-mottakere har disse attributtene 1,2,3,4,33. Lymphopenia av bestråling av mottakeren bør la adoptively overførte celler forblir upåvirket av blod homeostase og mestre lettere immunreaksjoner anti-donor. For begge metoder, i vitro utnyttelsen av allogene tredjeparts APCs eller i vivo adoptivforeldre overføring av undertrykkende at cellene i mottakere podet med tredjeparts hjerte analyse av anti-giver spesifisitet. Mens metoden i vivo krever et betydelig antall celler, dårlig representert kan celle subpopulasjoner vurderes lettere for undertrykkende aktivitet i vitro33.

Humoral svar kan også måles for å vurdere tilstanden til toleranse og kontroll av regissert antistoff Svar å donor antigener. Faktisk kan toleranse være preget av fravær av humoral respons mot giveren men bevaring av kapasiteten for mottakerne å utvikle humoral respons til nye antigener og bevaring av minne svar. Først er prinsippet om alloantibody påvisning basert på anerkjennelse av donor cellene av mottakeren antistoffer etter inkubasjon av donor celle type med serum fra en podet mottaker. Andre, humoral respons til eksogene antigener kan være vurdert følgende stimulering av tolerant langtidsmottakere med nøkkelhullet albuskjell Hemocyanin (KLH) emulgert med komplett Freund's adjuvant. Tilstedeværelsen av bestemte IgM og IgG-antistoffer mot antigener kan oppdages 4 og 13 dager, henholdsvis etter immunisering, med enzym koblede ImmunoSorbent analysen (ELISA)34. Tredje kan bevaring av immun minne svar vurderes ved injeksjon av xenogeneic røde blodlegemer (RBCs) dager -7 og 3 transplantasjon og RBCs farging med mottaker serum samlet dager 8 og +17 etter transplantasjon. Alle disse metodene tillater identifikasjon av immunglobulin subtyper med bestemte sekundære antistoffer, og raske oppkjøp av resultater i mindre enn 1,5 t av FACS flekker eller noen timer med ELISA.

Til slutt, disse protokollene er utviklet for karakteristikk av transplantasjon modeller, og kan, i noen grad, gjelder autoimmun sykdom modeller. Prinsippene for metoden kan transponeres til alle arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle protokoller her er godkjent av en etisk komité og skal utføres i et sterilt måte.

1. generasjon av toleranse i en modell av Cardiac Allograft i rotte

  1. Lew.1W LEW.1A allograft prosedyren
    1. Bedøve en donor mannlige LEW.1W rotte bruker isoflurane-O2 innånding, supplert med 1% N2O etter 5 min. sted dyr i dorsal liggesår, og desinfisere magen med betadine å utføre en thoracotomy (dvs., snitt inn i den pleural plass i brystet).
      1. Klemme mindreverdig og overlegen venae cavae, ligature dem og skjær dem. Deretter kuttet lungearterien og aorta og lagre graftet i kalde 0,9% NaCl.
    2. Bedøve 250 g mannlige LEW.1A mottaker rotte (av 8-12 uker) ved hjelp av isoflurane-O2 innånding, supplert med 1% N2O etter 5 min. plassere dyret i dorsal liggesår, og desinfisere magen med betadine å utføre en xyphopubic laparotomy (dvs.store snitt fra xiphoid prosessen til skam symphysis).
      1. Externalize tarmen, klemme abdominal blodkar, utføre en termino-lateral anastomose (dvs. tilkobling mellom slutten på én kanal og veggen av andre) mellom pode aorta og abdominal aorta og mellom den lunge arterie og abdominal vena cava, og fjern klemmer.
    3. Sutur muskel flyet og hud, og disinfect med betadine.
    4. Sett inn nalbuphine (smertestillende) 6 mg/kg subcutaneously (SC) og oxytetracycline (antibiotika) intramuskulært (IM), og plassere dyret under en varmelampe til dyret våkner. Injisere buprenorfin (opioid) (50 µg/kg) im og har meloksikam (nonsteroidal anti-inflammatorisk narkotika) (0,3 mg/kg) SC transplantasjon, og dagen etter.
  2. Induksjon av toleranse av blokaden av costimulatory interaksjoner
    1. Fremgangsmåten 1.1.1. til 1.1.2.
    2. I et klassifisert A2 område av dyr, fortynne 2 x 1010 smittsomme partikler av AdCD40Ig (en adenovirus koding CD40Ig, et chimeric molekyl som blokkerer CD40-CD40L vekselsvirkningene) i Ringer i laktat løsning å nå et endelig antall 150 µL og injisere i 3 poeng (3 x 50 µL) i ventrikkel veggen av toppen av graftet.
    3. Fremgangsmåten 1.1.3 til 1.1.4.
      Merk: AdCD40Ig behandling kan være assosiert med anti-CD8α, anti-ICOS eller anti-CD28 antistoff injeksjoner2,35,36.
  3. Induksjon av toleranse av overuttrykte et rekombinant protein
    1. Fortynne 1 x 1012 viral genomet av rotte IL34-rekombinant AAV i Ringer i laktat løsning å nå et siste volum på 100 µL. bedøve rotte 150 g LEW.1A med isoflurane-O2 innånding og injisere intravenøst (IV) i penile blodåre.
    2. En måned etter AAV-IL34 injeksjon, Utfør en LEW.1W pode LEW.1A mottakeren i henhold til protokollen 1.1.

2. i Vitro vurdering av celler undertrykkende aktivitet av blandet lymfocytter reaksjoner (MLRs)

Merk: Undertrykkende aktivitet av celler fra behandlet tolerant rotter skal sammenlignes med tilsvarende befolkningen fra syngeneic podet mottakere eller naiv rotter.

  1. Isolering av allogene APCs: presenterer antigener dendrittiske celler (PDC)
    1. Bedøve en mannlig LEW.1W naiv donor rotten bruker isoflurane-O2 innånding, supplert med 1% N2O etter 5 min. plassere dyret i dorsal liggesår, og desinfisere magen med betadine å utføre en splenectomy. Fjerne milten av transecting fartøyene, lagre milten i kalde 1 X fosfat-bufret saltvann (PBS) og Sutur dyret.
    2. Overføre milten i parabol, fjerne 1 X PBS og perfuse med 5 mL 0,2% collagenase D. For å forbedre fordøyelsen enzym, kuttet milten i små biter og Inkuber 15 min på 37 ° C.
    3. Legge til 500 µL av 0.1 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), overføre milt bitene i en sil og knuse milten med en sprøyte stempel å dissociate cellene. Overføre til et rør og vask cellene med 15 mL 1 X PBS. Sentrifuger 10 min på 430 x g. forkaste nedbryting.
    4. For å eliminere RBCs og blodplater, resuspend splenocyte pellets i 10 mL hypotonisk løsning og ruge 5 min ved romtemperatur (RT). Vask med 1 X PBS og sentrifuge 10 min på 190 x g. Forkast nedbryting.
    5. Fjerne kollagenfibre ved å filtrere på en 100 µm vev filter. Telle celler for å justere celle konsentrasjon til 5 x 107 celler/mL 1 X PBS/2% fosterets kalv serum (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Merk: Antall splenocytes bør være mellom 4 x 10-8 og 7 x 108 celler.
    6. Berike for cellene rundt etter negative merking før cellen sortering. Inkuber 15 min på 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer spesifikke for T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klone og anti-TCRγδ, V65 klone), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klone) og NK celler (anti CD161, 3.2.3 klone), vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og sentrifuge 10 min 430 x g . Kast nedbryting.
    7. Vask med magnetiske perler 3 ganger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Bruke 3,5 µL perler/106 splenocytes, vask ved å legge 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, sted for 1 min på magnet, og forkaste nedbryting. Gjenta to ganger. Resuspend perler i 10 mengder 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (for eksempel 35 µL perler er utvannet i 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Fjerne uønskede celler ved å blande splenocytes med magnetiske perler i 10 min på 4 ° C under omrøring, sett røret på magnet for 1 min og overføre nedbryting til en ny tube. Gjenta to ganger. Telle celler og justere til celle konsentrasjonen til 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Merk: Hvor beriket splenocytes burde omfang imellom 5 x 107 og 9 x 107.
    9. Stain cellene med merket antistoffer for ytterligere sortering av PDC: utelate gjenværende T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klone) eller B-celler (anti-CD45RA, OX33 klone) og sortere CD4+ (anti-CD4, OX35 klone) CD45R+ celler (anti-CD45R, His24 klone). Etiketten perler med hver Ab å etablere en kompensasjonsmatrise på FACS. Inkuber 15 min på 4 ° C og vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 5 x 107 celler/mL, filter på 60 µm vev filter, og Merk døde celler ved å legge DAPI på en siste konsentrasjon av 0,1 µg/mL. Sortere celler med 70 µm munnstykke celle sortering, etter gating på DAPI-TCR-CD45RA-CD4+CD45R+ som vist i figur 1.
  2. Isolering av responder effektor T celler (CD4 + CD25 - T celler)
    1. Høste milten fra rotte ikke behandlet ikke podet naive LEW.1A og lagre den i kaldt 1 X PBS.
    2. Overføre milten i en sil i et fat og legge 10 mL 1 X PBS. Knuse milten med en sprøyte stempel å dissociate cellene. Overføre cellene til en 50 mL tube, vask med 1 X PBS og sentrifuge 10 min på 430 x g. Forkast nedbryting.
    3. Eliminere RBCs og blodplater, resuspend splenocyte pellets i 10 mL hypotonisk løsning for 5 min på RT, deretter vask i 1 X PBS og sentrifuger på 10 min 190 x g. forkaste nedbryting.
    4. Fjerne kollagen fibrene ved å filtrere på en 100 µm vev filter. Telle celler for å justere til celle konsentrasjonen til 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Merk: Antall splenocytes bør være mellom 3 x 10-8 og 5 x 108 celler.
    5. Berike cellene rundt før du sorterer. Inkuber 15 min på 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer spesifikke for CD8 celler (anti-CD8α, OX8 klone), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klone), NK celler (anti CD161, 3.2.3 klone), myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klone), gamma delta T celler (anti-TCRγδ, V65 klone). Deretter vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og sentrifuger 10 min på 430 x g. kast nedbryting.
      Merk: Sortere naturlig CD8+ Tregs fra naiv rotter samtidig som CD4+ celler effektor T, ikke legge anti-CD8α Ab i uttømming.
    6. Vask de magnetiske perlene 3 ganger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trinn 2.1.7.
    7. Fjerne uønskede celler ved å blande splenocytes med magnetiske perler i 10 min på 4 ° C under omrøring, og sett røret på magnet for 1 min og overføre nedbryting til en ny tube. Gjenta to ganger. Telle celler og justere til celle konsentrasjonen til 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Merk: Hvor splenocytes skal variere mellom 5 x 107 og 8 x 107 celler.
    8. Legg til merket antistoffer Sorter CD4+CD25- T celler: anti-TCRαβ (R7/3 klone), anti CD4 (OX35 klone), anti-CD25 (OX39 klone) og Inkuber 15 min på 4 ° C. Samtidig sortere CD8+CD45RClav Tregs, legge til anti-CD45RC Ab (OX22 klone). Etiketten perler med hver Ab angi en kompensasjonsmatrise for videre behandling på flowcytometri. Vask cellene med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og forkaste nedbryting.
    9. Resuspend celler til 5 x 107 celler/mL, filter på 60 µm vev filter, og Merk døde celler ved å legge DAPI på en siste konsentrasjon av 0,1 µg/mL. Sortere cellene med 70 µm munnstykke celle sortering etter gating på DAPI -TCR+CD4+CD25- celler som responder celler (og om nødvendig DAPI -TCR+CD4-CD45RClav som CD8+ Tregs undertrykkende celler) som vist i figur 2.
  3. Isolering av undertrykkende celler
    Merk: Dele milten i to dele: sortere på B celler, myeloide celler, og NK celler, og den andre på CD4+ og CD8+ CD45RClav T celler, for å vurdere deres undertrykkende funksjon.
    Merk: For adopsjon celle overføring, lagre 1 x 108 splenocytes å tjene som kontrollen positiv toleranse ved adopsjon, hvis nødvendig.
    1. Sortering av B-celler og myeloide Celler NK celler
      1. Følg protokollen 2.1.1 til 2.1.5.
      2. Inkuber 15 min på 4 ° C med 2 µg/mL T celle-spesifikke umerkede antistoffer (anti-TCRαβ, R7/3 klone og anti-TCRγδ, V65 klone), vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og sentrifuge 10 min på 430 x g. Forkast nedbryting.
      3. Vask med magnetiske perler 3 ganger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trinn 2.1.7.
      4. Bland i splenocytes med magnetiske perler å fjerne uønsket celler og ruge i 10 min på 4 ° C under omrøring, og sett røret på magnet for 1 min og overføre nedbryting til en ny tube. Gjenta to ganger. Telle celler og justere til celle konsentrasjonen til 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Legge til merket antistoffer splenocytes sortere celler med mistanke om undertrykkende aktivitet som myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klone), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klone) eller NK celler (anti-CD161, 3.2.3 klone). Etiketten perler med hver Ab å etablere en kompensasjonsmatrise på FACS. Inkuber 15 min på 4 ° C og vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 5 x 107 celler/mL, filter på 60 µm vev filter, og Merk døde celler ved å legge DAPI på en siste konsentrasjon av 0,1 µg/mL. Sortere cellene med 70 µm munnstykke celle sortering etter gating på DAPI-CD11b/c+ for myeloide celler, CD45RA+ B celler og CD161+ for NK cellene som vist i Figur 3.
    2. Sortering av CD4 + og CD8 + CD45RC lav . T celler
      1. Følg protokollen 2.2.1 til 2.2.4.
      2. Negativ velges på en magnetisk kolonne, ruge cellene 15 min på 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer spesifikke for B-celler (anti-CD45RA, OX33 klone), NK celler (anti CD161, 3.2.3 klone), myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klone), gamma delta T celler ( anti-TCRγδ, V65 klone), vask dem med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og sentrifuge 10 min på 430 x g. Forkast nedbryting.
      3. Vask de magnetiske perlene 3 ganger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trinn 2.1.7.
      4. Fjerne uønskede celler ved å blande splenocytes med magnetiske perler i 10 min på 4 ° C under omrøring, og sett røret på magnet for 1 min og overføre nedbryting til en ny tube. Gjenta to ganger. Telle celler og justere til celle konsentrasjonen til 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Legg merket antistoffer til cellene sortere Tregs: anti-TCRαβ (R7/3 klone), anti-CD4 (OX35 klone), anti-CD45RC (OX22 klone). Etiketten perler med hver Ab å etablere en kompensasjonsmatrise på FACS. Inkuber 15 min på 4 ° C og vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 5 x 107 celler/mL, filteret på en 60 µm vev, og Merk døde celler ved å legge DAPI på en siste konsentrasjon av 0,1 µg/mL. Sortere cellene med 70 µm munnstykke celle sortering etter gating på DAPI-TCR+CD4+CD45RClav som CD4+Tregs og DAPI-TCR+CD4-CD45RC lav som CD8+Tregs ( Figur 4).
        Merk: Anti-CD8α Ab (OX8 klone) kan brukes i stedet for anti-CD4 Ab hvis T celler er diskriminert fra CD4+ikke-T celler av anti-TCR merking. Et overskudd av CD4+Tregs skal sorteres i påvente av celledød på grunn av celle spredning fargestoff (CPD) merkingen.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) merking av responder celler å måle spredning
    1. Vaskes dobbelt cellene med 1 X PBS responder cellen sortering.
    2. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS og ruge med 0,5 µM CFSE for 5 min på RT i mørket. Stoppe reaksjonen ved å legge til FCS 1,5 X volumet og sentrifuge 10 min 430 x g på 4 ° C. Kast nedbryting.
    3. Vask dobbelt cellene med komplett medium, og telle celler.
      Merk: Forvent 30% av celler død på dette trinnet.
  5. CPD merking av CD4 + Tregs for undertrykkende analysen på CD4 + Effektor celler
    Merk: Dette trinnet er nødvendig å diskriminere CFSE-CD4+Tregs fra CFSE- voksende responder CD4+T-celler på dag 6 av coculture av gating på CPD- celler.
    1. Etter CD4+ Tregs celle sortering, vask dobbelt cellene med 1 X PBS.
    2. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS og ruge med 10 µM av CPD V450 etter 20 min på RT i mørket.
    3. Vask dobbelt cellene med komplett medium, og telle celler.
      Merk: Forvent 30% av celler død på dette trinnet.
  6. Råd for coculture
    1. Bruke kultur i middels bestående av: RPMI 1640 medium supplert med beta-mercaptoethanol (5 x 10-5 M), penicillin (100 U/mL), streptomycin (0,1 mg/mL), natrium pyruvate (1 mM), glutamin (2 mM), HEPES buffer (1 mM), ikke-essensielle aminosyrer (1 X), FCS ( 10%).
    2. Kultur celler i 96-brønnen U bunnplater.
    3. Legge til celler i følgende rekkefølge: undertrykkende celler, responder celler og allogene celler.
    4. Holder konstant antall responder T celler og allogene APCs og teste noen utvalg av Tregs. For eksempel forholdet 4:4:1, 5 x 104 undertrykkende celler, 5 x 104 responder celler og 1,25 x 104 allogene celler og forholdet 2:4:1, 2,5 x 104 undertrykkende celler, 5 x 104 responder celler og 1,25 x 104 allogene celler.
    5. Opprettholde andelen 5 x 104 responder celler for 200 µL medium/godt.
    6. For kontroller Inkluder noen brønner med responder T celler uten allogene APCs (negativ kontroll) og responder T celler med allogene APCs uten regulatoriske celler (positiv kontroll) for CFSE gating på dag 6 (se trinn 2.7.6.).
  7. FACS flekker og analyse etter 6 dager av coculture
    Merk: Spredning av Effektor celler kan vurderes på flere tidspunkt. Spredning er eksponentiell: som celledeling øker, flere forskjeller mellom undertrykkende forhold og negativ kontroll kan observeres.
    1. Overføre cellene fra 96-brønns U bunnplater til 96-brønns V bunnplater og sentrifuge 1 min på 1200 x g på 4 ° C.
    2. Lagre nedbryting i en ny plate på 20 ° C for å måle cytokin nivåer, hvis nødvendig.
    3. Vask cellene med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per godt og sentrifuger 1 min på 1200 x g på 4 ° C.
    4. Legge til antistoffer til cellene til ytterligere gate på responder T celler: anti-TCRab (R7/3 klone) og anti-CD4 (OX35 klone). Inkuber 15 min på 4 ° C og vask to ganger med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per brønn. Kast nedbryting.
    5. Legg 100 µL av DAPI utvannet på 0,1 µg/mL i 1 X PBS og lese platen med en FACS analysator.
    6. Analysere CFSE profilen av gating på DAPI negative (levende celler) CPD negative (ikke-CD4+Tregs) TCR+CD4+ celler. Unstimulated responder celler har maksimal CFSE lysstyrke som vist i figur 5 nederste venstre histogram. I nærvær av allogene APCs har responder cellene maksimal spredning og minimal CFSE lysstyrke (nederst, midten). I nærvær av allogene APCs og regulatoriske celler har Effektor celler middels spredning og CFSE lysstyrke (nederst, til høyre).

3. i Vivo vurdering av celler undertrykkende aktivitet ved adopsjon cellen i et hjerte podet mottaker

Merk: Bestråling er nødvendig for å eliminere verten cellene og favoriserer donoren cellen engraftment og spredning.

  1. Irradiate pode mottakerne tidlig på dagen før skal precondition mottakeren. Bedøve rotter med im. injeksjon for xylazine (8 mg/kg)-ketamin (80 mg/kg) og irradiate dem på en dose 4,5 Gy med X-stråler.
  2. Følg protokollen 2.3 isolere celler av interesse.
    Merk: Lagre 1 x 108 splenocytes å tjene som en positiv toleranse ved adopsjon, hvis nødvendig.
  3. 12 h etter bestråling (dagen før graftet, om kvelden), bedøve rotter ved inhalasjon av 4% isoflurane-O2 og fyller cellene (5.0 x 107 T-celler, 3.0 x 107 B celler, 3.0 x 107 myeloide celler eller 1,50 x 108 splenocytes som kontrollen positiv toleranse ved adopsjon) IV i penile blodåre.
    Merk: Antall celler kreves for toleranse ved adopsjon, avhenger av undertrykkende aktiviteten til cellene.
  4. Neste dag, følg protokollen 1.1 til å utføre allograft. Følg pode evolusjon ved palpasjon gjennom magen.

4. donor spesifikt antistoff gjenkjenning

Merk: IgG svar rettet mot pode donor er målt ved rugende cellene fra donor med serum til mottakeren. Trekk bakgrunnen av direkte flekker LEW.1W B celler av rugende cellene med syngeneic LEW.1W serum.

  1. Høste blod fra rotter og sentrifuge 15 min 1200 x g på 4 ° C. Lagre serum. Serum kan lagres på 20 ° C eller brukes umiddelbart. Deaktiver et supplement i sera av rugende i 30 min på 56 ° C.
  2. Høste milten fra rotte donor LEW.1W og lagre den i kaldt 1 X PBS. Fremgangsmåten 2.2.1. til 2.2.4. Legge til 2 x 105 celler/godt i en 96-brønns V bunnplaten. Sentrifuge 1 min på 1200 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
  3. Fortynne sera serielt fra 1/10 til 1/270 i 1 X PBS (4 fortynninger/sampling). Inkuber celler for 1 h på 4 ° C med 25 µL utvannet serum/godt. Forutse hvor mange donor-spesifikke IgG undertyper (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) immunreaksjoner analysere per prøve (1 serum x 4 fortynninger x 4 IgG subtyper). Vask cellene med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og forkaste nedbryting.
  4. Inkuber cellene med hver musen anti-rotte IgG undertype Ab fluorochrome-merket i 30 min ved 4 ° C, en undertype/brønn.
    Merk: Hvis fluorochrome-merket anti-rotte Ig Ab er tilgjengelige, er det mulig å bruke renset umerkede musen anti-rotte IgG underordnet Ab og fluorochrome-merket sekundære anti-mus Ab. avhengig av tilgjengelig fluorochromes og konfigurasjon av cytometer flere anti-rotte IgG subtyper kan testes i en brønn med riktige innstillinger.
  5. Vask cellene med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA to ganger og forkaste nedbryting.
  6. Legg 100 µL av DAPI utvannet på 0,1 µg/mL i PBS og lese platen med en FACS analysator.
  7. Les mener fluorescens intensiteten (MFI) med anti-rotte IgG undertypen Ab merket med fluorochrome på alle DAPI- -celler. Trekke MFI oppnådd med naive LEW.1A serum på LEW.1W cellene (bakgrunn flekker, nederst til venstre) fra MFI oppnådd med til sera fra hver mottaker på de LEW.1W cellene på tilsvarende fortynning (bunnen midten for ubehandlet avvise mottakere som vise maksimal MFI og bunnen rett for behandlet tolerant mottakere som viser mellomliggende MFI) (figur 6).

5. vurdering av Humoral Svar å eksogene antigener (Naive og minne)

Merk: Serum fra rotter før transplantasjon behandling og immunisering bør brukes som negative kontroller av humoral svar. Ellers brukes ikke vaksineres naiv rotter. Serum fra immunkompetente mottakere, dvs, transplantert exoantigen-vaksinert og avvise mottakere, brukes som positive kontroller av humoral svar.

  1. Kapasitet til å utvikle humoral respons til en ny antigen (figur 7)
    Merk: Denne metoden er en relativ kvantifisering av humoral svar som det ikke inkluderer en standard. En absolutt Ig kvantifisering vil være mulig ved å legge en rekke fortynninger av rotte IgG eller IgM anti-KLH Ab med kjente konsentrasjon i trinn 5.1.6.
    1. Emulsify 50 µg av KLH i 200 µL av komplett Freund's adjuvant og injisere på halen av lang-overlevende/tolerant mottakere, kontrollere ubehandlet avvise mottakere eller naiv rotter som positive kontroll av humoral svar.
    2. Høste blodprøver 4 og 13 dager etter immunisering og sentrifuge 15 min 1200 x g på 4 ° C. Lagre den øvre fasen som serum. Høste serum fra ikke-vaksineres rotter i en negativ kontroll. Serum kan være frosset om 20 ° C til ELISA-analysen.
    3. Pels ELISA plater (flat bunn) med 50 µL/vel KLH utvannet på 10 µg/mL i 1 X PBS overnatting på 4 ° C. Kontroller at belegg løsningen dekker alle brønnene.
    4. Fjern de overskytende ubestrøket KLH ved vask. For å vaske, legger du til 150 µL/godt av vaskebuffer (1 X PBS 0,1 prosent mellom) og bla.
    5. Blokk uspesifikke binding av mottakerens Ig av rugende 1t på 37 ° C med 100 µL/godt av vaskebuffer inneholder 10% FCS. Vask en gang.
    6. Serielt fortynne de mottakeren sera i vaskebuffer fra 1/40 til 1/512, legge til 50 µL/godt i duplikater av føljetong fortynning av belagt platen og ruge 2 h på 37 ° C. Holde noen brønner gratis serum for en negativ kontroll. Vask to ganger.
    7. Legge til 50 µL av 1 µg/mL av biotin-konjugerte anti-rotte IgM Ab i brønner som inneholder serum høstes ved dag 4 i mottakere eller 50 µL av biotin-konjugerte anti-rotte IgG i brønner som inneholder serum høstes ved dag 13 og ruge 1t på 37 ° C. Vask to ganger.
    8. Legge til 50 µL/godt av HRP-konjugerte streptavidin på 1 µg/mL for 45 min på 37 ° C. Vask 3 ganger.
    9. Legge til 50 µL av 3, 3, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat for < 30 min på RT og stoppe reaksjon med 25 µL av 2 M svovelsyre når positiv kontroller er mettet.
    10. Lese absorbansen ved 405 nm. Sammenligne optisk densitet med mottakerens serum til den med naiv rotte kontroll serum.
  2. Vurdering av humoral respons minnekapasitet (Figur 8)
    1. 7 dager før transplantasjon, injisere IV 109 av xenogeneic RBCs fortynnet i 800 µL av 1 X PBS i naiv rotter. RBCs kan være fra sau, hesten eller andre arter.
    2. Utføre transplantasjon og administrere tolerogenic behandling.
    3. 3 dager etter graftet, injisere igjen i.v.109 RBC fortynnet i 800 µL av 1 X PBS i pode mottakere og ikke-podet rotter.
    4. Høste blod prøver 5 og 14 dager etter andre immunisering og sentrifuger 15 min 1200 x g på 4 ° C til å gjenopprette den øvre serum-fasen. Serum kan lagres på 20 ° C eller brukes umiddelbart. Deaktiver et supplement i rotte sera av rugende 30 min ved 56 ° C før bruk.
    5. Legge til 2 x 105 RBC/godt av en 96-brønns V bunnplaten. Sentrifuge 1 min på 1200 x g på 4 ° C og kast nedbryting nøye av aspirasjon.
    6. Serielt fortynne sera 2-fold fra 1/10 til 1/1280 i 1 X PBS (8 fortynninger/sampling). Inkuber celler for 1 h på 4 ° C med 25 µL utvannet serum/godt. Vask cellene med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og forkaste nedbryting.
    7. Inkuber cellene med RBC arter-adsorbert anti-rotta IgG eller IgM subtyper merket med fluorochrome i 30 min ved 4 ° C, en undertype/brønn. Vurdere rotta IgM og IgG anti-RBC i serum høstet 5 til 14 dager etter immunisering, henholdsvis. Vask cellene med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA to ganger og forkaste nedbryting.
      Merk: Hvis fluorochrome-merket anti-rotte Ig Ab er tilgjengelige, er det mulig å bruke renset umerkede musen anti-rotte IgG underordnet Ab og fluorochrome-merket sekundære anti-mus Ab.
    8. Legg 100 µL av DAPI utvannet på 0,1 µg/mL i 1 X PBS og analysere cellene med en FACS analysator.
    9. Representere MFI som en funksjon av fortynning for hver gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering av undertrykkende aktivitet etter sortering av APCs (figur 1), responder celler og Tregs samtidig (figur 2), eller individuelt (Figur 4), og alle andre mulige regulatoriske celler (Figur 3), kan være gjort i vivo ved direkte injeksjon av regulatoriske celler og i vitro ved måling av CFSE lysstyrke (figur 5). Statusen for humoral respons til mottakeren mot donor (figur 6) eller eksogene antigener (tall 7 og 8) kan også være vurdert i vitro i vivo immunisering som avbildet.

Figure 1
Figur 1 . Gating strategi for å sortere PDC.
Cellene ble valgt på morfologi størrelse og tetthet (SSC-A/FSC-A), doublets ble utelatt av FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H parametere, lever celler ble valgt av gating på DAPI- celler, og PDC ble valgt på TCR-CD45RA-CD4 + CD45R+ uttrykk. Renhet ble vurdert ved å legge DAPI til sorterte celler og kjører på den cellen sorter med sortering parametere. Renhet av sjeldne sorterte innbyggere (mindre enn 2%) må være større enn 95%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Gating strategi Sorter CD4+CD25- responder T celler og CD8+CD45RClav Tregs.
Cellene ble valgt på morfologi, dvs. størrelse og tetthet (SSC-A/FSC-A), doublets ble utelatt av FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H parametere, lever celler ble valgt av gating på DAPI- celler, og responder celler ble valgt på TCR + CD4+CD25- uttrykk. CD8+Tregs har vært samtidig sortert etter gating på TCR+CD4-CD45RClav celler. Renhet ble vurdert ved å legge DAPI til sorterte celler og kjører på den cellen sorter med sortering parametere. Renhet må være større enn 95%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi for å sortere B celler, myeloide celler og celler NK.
Cellene ble valgt på morfologi størrelse og tetthet (SSC-A/FSC-A), doublets ble utelatt av FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H parametere, levende celler ble valgt av gating på DAPI- celler, og B-celler ble valgt på CD45RA+ uttrykk myeloide celler på CD11b/c+ uttrykk og NK celler på CD45RA-CD11b/c-CD161høy uttrykk. Renhet ble vurdert ved å legge DAPI til sorterte celler og kjører på den cellen sorter med sortering parametere. Renhet må være større enn 95%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Gating strategi Sorter CD8+CD45RClav og CD4+CD45RClav Tregs.
Cellene ble valgt på morfologi størrelse og tetthet (SSC-A/FSC-A), doublets ble utelatt av FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H parametere, bodde celler ble valgt av gating på DAPI- celler og CD4+Tregs ble valgt på TCR + CD4+CD45RClav uttrykk og CD8+Tregs på TCR+CD4-CD45RClav uttrykk. Renhet ble vurdert ved å legge DAPI til sorterte celler og kjører på den cellen sorter med sortering parametere. Renhet må være større enn 95%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Representant analyse av den i vitro undertrykkende analysen.
Svareren celle spredning ble analysert utvalg på morfologi størrelse og tetthet (SSC-A/FSC-A), utelukkelse av doublets av FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H, utelukkelse av døde celler og CD4+ Tregs av gating på DAPI-CPDV450 - celler, utvalg av TCR+CD4+ celler og CFSE profil analyse. CFSE porten var basert på unstimulated CFSE-merket responder celler. CFSEhøy celler er ikke-voksende celler og CFSElav er celler ≥ 1 divisjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Representant analyse av donor bestemte alloantibody svaret.
Splenocytes fra donor rotta ble inkubert med en rekke utvannet inaktivert serum fra behandlet eller ubehandlet mottakere eller naiv rotte, og deretter med anti-rotte IgG-FITC. Alloantibodies oppdages ved å analysere MFI av FITC på DAPI- z celler etter SSC og FSC doublets eksklusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Prinsippet om anti-KLH oppdagelsen metoden.
Ble vaksineres 120 dager etter transplantasjon med KLH supplert med CFA og blodprøver ble høstet 4 og 13 dager etter immunisering. KLH proteiner var belagt på 96-flat bunnplater brønner, og inkubert med serumprøver fra vaksineres rotter. Biotinylated geit anti-rotte IgG eller IgM tillatt påvisning av anti-KLH Ab stede i serum høstet 4 eller 13 dager etter immunisering. HRP-kombinert streptavidin forvandlet TMB-substratet en blå farget produkt som blir gult når reaksjonen ble stoppet med svovelsyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 . Ordningen av metoden anti-RBC gjenkjenning.
Ble vaksineres 7 dager før og 3 dager etter transplantasjon med xenogeneic røde blodlegemer (RBCs) og blodprøver ble høstet fra vaksineres mottakere 5 og 14 dager etter siste immunisering. RBCs ble inkubert med serumprøver fra vaksineres rotter. Tilstedeværelse av anti-RBCs antistoffer på RBCs ble oppdaget av flekker med merket geit anti-rotte IgG eller IgM antistoffer og FACS Canto analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adopsjon overføringen av totale splenocytes i en nylig podet mottaker er en effektiv måte å oppdage tilstedeværelsen av regulatoriske celler indusert eller kraftig av behandling. Verten bestråling-indusert forbigående lymphopenia fremmer celle overlevelse etter overføring og etablering av toleranse. Videre gir sub dødelige bestråling tid for celler med tolerogenic egenskaper til å konvertere til nye regulatoriske celler under immune rekonstituering, et fenomen som kalles smittsomme toleranse34. Vanligvis godt beskrevet CD4+CD25høyFoxp3+CD127lavt Tregs studerte er først når toleranse er observert. Men overføring av negativ brøken (splenocytes utarmet i CD4+Tregs) kan noen ganger forlengelsen utover allerede kjent regulatoriske celler og identifisering av nye celle populasjoner1,2, 3,4. I AdCD40Ig-indusert toleranse, overføring av CD4+T celler-utarmet splenocytes avslørt oppdagelsen av CD8+CD45RClav Tregs1. Videre påfølgende overføring av totale CD8+ T celler og deretter begrenset til CD45RClav celler, viste potensialet i slik metode å stadig identifisere nye innbyggere regulatoriske celler. Dessuten, denne strategien kan analyse av alle populasjoner. Faktisk har vi vist at mange regulatoriske celler kan eksistere sammen og med sannsynlig, og at kompenserende mekanismer finnes2,4. I rotter behandlet med CD40Ig, nedbryting av CD8+ tillatt fremveksten av B-celler og myeloide celler med regulatoriske egenskaper og overført toleranse av cardiac allograft i rotte i henhold til protokollen beskrevet ovenfor2. I en modell av toleranse av overuttrykte IL34, begge CD4+ og CD8+Tregs kunne overføre toleranse4.

Donor-rettet spesifisitet behandling-indusert toleranse kan vurderes på cellulære og humorale nivåer. Første, adopsjon overføring av regulatoriske celler til mottakerne av en tredjepart pode vil ikke lykkes i å overføre toleranse hvis cellene er spesifikke for de første donor pode33. Andre, undertrykkende celler skal effektivt hemmer spredning av responder celler svar på stimulering av APCs fra første giveren av graftet men ikke fra en tredje part donor2. Endelig kan humoral svar mot giveren av graftet skilles fra total Ig produksjon i mottakeren ved hjelp av protokollen som beskrevet ovenfor. Videre, i tilfelle toleranse bestemt til første pode donor mottakeren skal kunne utvikle en ny humoral respons mot en sekundær tredjeparts pode, en ny antigen eller en tidligere kjent antigen16.

Collagenase D behandling av milten er foretrukket og tilrådelig å trekke ut alle celle populasjoner fra orgelet. Til slutt, når fenotypen av regulatoriske celler er så tett at cellene er dårlig representert (< 1% av splenocytes), overføring av negativ brøken forhold til overføring av den totale befolkningen kan hjelpe skille undertrykkende aktiviteten til denne lille befolkningen. For eksempel CD40Ig-indusert CD8+Tregs gjelder for en allogene peptid kunne FACS farget med tetramers, men deres lave antall tillot ikke positiv adoptivforeldre overføring33,38. Men adopsjon overføring av tetramer-utarmet CD8+CD45RClav . T celler ikke overføre toleranse i forhold til totalt Tregs, fremhever potensialet i denne subpopulasjon. Dette resultatet ble bekreftet av et i vitro undertrykkende eksperiment. Faktisk var undertrykkende eksperimentet også en overbevisende måte å vise kapasiteten til Du51-spesifikke Tregs å undertrykke immunreaksjoner33.

Undertrykkende protokollen beskrevet ovenfor er begrenset til mottakeren effektor CD4+T celle svar på PDC fra donor. Denne protokollen kan tilpasses ved å erstatte PDC ved cDCs eller totale APCs, men at effektor: stimulator forholdstallene er hensiktsmessige for å oppnå en moderat spredning håndterlig av undertrykkende cellene. Faktisk forholdet CD4+CD25-T celler: PDC bør være 4:1, mens CD4 forholdet+CD25- T celler: cDCs bør være 8:1 og CD4+CD25- T celler: APCs, 1:1 eller 1:2. Forholdstallene avhenger alloreactivity mellom giver og mottaker. de over er passende for en LEW.1W:LEW.1A kombinasjon med en akutt avvisning på dag 7, men omfanget av responder: stimulator prosenter bør testes før ofringen av dyr. Til slutt, CFSE er foretrukket å thymidine å analysere undertrykkende aktivitet, for sikkerhet og pålitelighet bekymringer. Men sikre mulig skillet mellom undertrykkende celler og responder celler for CFSE analyse på dag 6 om effektor CD4+CD25- T-celler blir erstattet av totalt splenocytes. Likeledes, sikre at de gjenværende T-cellene blant stimulator celler ikke sprer etter 35 Gy bestråling.

Utformingen av den FACS flekker er basert på tilgjengeligheten av antistoffer oppført i tabell 3. Like protokoller kan tilpasses for mus modeller, sikre målet verdi (for eksempel myeloide celler er ulikt beskrevet i musen og rotten).

Den heterotopic hjerte allograft i rotte er en solid organ transplantasjon modell med store muligheter for pode utfallet overvåking. Mens nyre allograft modellen er preget av en plutselig død av mottakeren, informerer palpasjon av beat styrken av cardiac graft gjennom bukveggen pode utviklingen39,40. Samtidig hud pode eller en andre cardiac pode kan realiseres på hjerte allograft mottakeren å studere minne svar41. Videre er biomolecular engineering og biologiske eller kjemiske verktøy for uttømming av spesifikke celletyper som B-celler (IgM KO), CD8 celler (anti-CD8α antistoffer) eller myeloide celler (clodronate liposomer), nyttige verktøy for å måle betydningen av slike celle befolkninger i induksjonen eller vedlikehold av toleranse avhengig innlegg transplantasjon der tappe behandling administreres til mottakeren1,2,3,4.

Til dato, rotte Bregs myeloide celler og CD8+Tregs er ikke godt beskrevet. Protokoller av toleranse induksjon ovenfor er foreslått som referanse for karakterisering av rotte regulatoriske celler1,2,3,4. Ytterligere kan fenotypiske beskrivelse av disse cellene og sammenligning med andre modeller av allotransplantation og andre arter bidra til å diskriminere markører av stor interesse. Faktisk, sammenligning av Bregs fra musen modeller av toleranse og operativt tolerant pasienter markere overvekt av CD5 eller CD24 markør uttrykket som biomarkers Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . I vår modell av toleranse av AdCD40Ig kombinert med CD8α utarming, CD24 er overexpressed sammenlignet med B-celler mangler undertrykkende aktivitet2. Høy gjennomstrømning digital gene expression RNA sekvensering nylig dukket opp som en nyskapende verktøy for å karakterisere ytterligere regulatoriske celler46.

Til slutt, protokoller for å oppdage tilstedeværelsen av regulatoriske celler forårsaket av en tolerogenic behandling kan tilpasses andre modeller. Her brukte vi LEW.1W til LEW.1A kombinasjon av allograft, preget av en pode avvisning i ca 7 dager. Inverter kombinasjonen, som har blitt beskrevet som strengere og hvor akutt avvisning skjer raskere og sterkere, kan brukes. Autoimmun sykdom modeller også nytte av vår erfaring i transplantasjon for tyde mekanismer for toleranse induksjon med behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med Labex IGO prosjektet (n ° ANR-11-LABX-0016-01) som en del av "Investissements d'Avenir" franske regjering programmet administreres av ANR (ANR-11-LABX-0016-01) og IHU-Cesti prosjektet finansiert også av den " Investissements d'Avenir"franske regjering program, administrert av den franske National Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Métropole og Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Tags

Immunologi problemet 126 celle sortering regulatoriske celler Tregs Bregs RegMCs transplantasjon genterapi undertrykkende analysen cardiac allograft alloantibody adopsjon celle overføring rotte
<em>In Vitro</em> og <em>i Vivo</em> vurdering av T, B og myeloide celler undertrykkende aktivitet og humorale svar fra transplantasjon mottakere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bézie, S., Usal, C.,… More

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter