Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro och In Vivo bedömning av T, B och myeloida celler suppressiv aktivitet och humorala svar från transplantation mottagare

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att inducera tolerans vid transplantation, och bedöma in vitro och i vivo immunstatus hos mottagaren mot givaren eller exogena antigen och distinkta cell delmängder av mottagaren suppressiv kapacitet.

Abstract

Viktigaste vid transplantation är att uppnå specifika tolerans genom induktion av regulatoriska celler. Förståelsen av tolerans mekanismer kräver pålitliga modeller. Här beskriver vi modeller av tolerans mot hjärt transplantatavstötning hos råtta, inducerad av blockad av costimulation signaler eller av uppreglering av immunoregulatoriska molekyler genom genöverföring. Var och en av dessa modeller gjort i vivo generation av regulatoriska celler såsom regulatoriska T-celler (Tregs), regulatoriska B-celler (Bregs) eller reglerande myeloida celler (RegMCs). I detta manuskript beskriver vi två kompletterande protokoll som har använts för att identifiera och definiera in vitro- och in-vivo reglerande cellsaktivitet för att avgöra deras ansvar i toleransutveckling och underhåll. Först ett in vitro- suppressiv test får snabb identifiering av celler med suppressiv kapacitet på effektor immunsvar på ett dosberoende sätt, och kan användas för vidare analys såsom cytokin mätning eller cytotoxicitet. För det andra, adoptiv överföringen av celler från en tolerant behandlade mottagare till en nyligen bestrålade ympade mottagare, belyst tolerogena egenskaperna av dessa celler i kontroll av transplantat regisserad immunsvar och/eller konvertera ny regulatoriska celler ( kallas smittsamma tolerans). Dessa metoder är inte begränsad till celler med kända fenotypiska markörer och kan förlängas till någon cell befolkningen. Dessutom riktade givare allospecificity av regulatoriska celler (ett viktigt mål i fältet) kan bedömas med hjälp av tredje part donatorcellerna eller transplantat antingen in vitro eller in-vivo. Slutligen, för att fastställa specifika tolerogena kapaciteten av dessa reglerande celler, vi tillhandahåller protokoll för att bedöma de humorala antikroppssvar mot givaren och mottagaren förmåga att utveckla humorala svar mot nya eller tidigare kända antigener. Modeller av tolerans som beskrivs kan användas för att ytterligare karakterisera regulatoriska celler, för att identifiera nya biomarkörer och immunoregulatoriska molekyler, och kan anpassas till andra transplantation modeller eller autoimmuna sjukdomar i gnagare eller människa.

Introduction

Hjärt transplantatavstötning hos råtta är en pålitlig organ transplantation modell att bedöma tolerans induktion behandlingar, för att dechiffrera mekanismerna av toleransutveckling och underhåll, och har potential att inducera funktionellt behöriga och dominerande regulatoriska celler. Protokollen nedan beskriver ett fullt mismatch heterotopisk hjärt transplantat från en Lewis 1W givare råtta (LEW.1W, RT1u) till en Lewis 1A mottagarens råtta (LEW.1A, RT1en). I denna transplantat kombination, akut avstötning sker snabbt (i ca 7 dagar) och lätt kan bedömas av transplantat slog mätning genom palpation av buken. Här föreslår vi tre protokollen för att inducera tolerans mot den kardiella transplantatavstötning hos råtta. I dessa modeller, tolerans inducerad eller underhålls av olika reglerande celltyper. Första, blockering av CD40-CD40L interaktioner med ett adenovirus som kodning CD40Ig (AdCD40Ig) inducerad generering av CD8+ Tregs kan inducera tolerans när adoptively överförs till sekundära ympade mottagare1. Dessutom utarmning av CD8+ celler (med anti-CD8α antikroppar) i AdCD40Ig-behandlade mottagare genererade Bregs och RegMCs2. Djupgående analys av CD8+ Tregs boenden belyste nyckelroll som flera immunoregulatoriska molekyler definieras som interleukin-34 (IL-34) och Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Medan överuttryck av IL-34 (med en AAV vektor) inducerad Tregs genom generering av RegMCs, inducerad överuttryck av FGL-2 Bregs, underliggande det komplexa nätverket av regulatoriska celler.

Eftersom kronisk avstötning utvecklas långsamt och är långsiktiga, krävs en fördjupad analys för att skilja tolerans mot kronisk avstötning. Transplantat bedöms vanligtvis för cell infiltration, fibros, förtjockning av vaskulära väggen och komplement C4d nedfall av immunohistology7. Medan histologi metoder kräver djuroffer eller ympa biopsi, här beskriver vi en enkel metod för att bedöma olika funktioner av tolererade transplantatavstötning: uppkomst och funktion av regulatoriska celler och anti givare specifika antikroppen svaren från blod urvalet av flödescytometri (här, vi använde fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS)).

Underhåll av tolerans till transplantatavstötning efter gripandet av behandling är allmänt associerade med induktion av regulatoriska celler8. I de sista årtiondena, studier fokuserat på CD4+Tregs enhälligt kännetecknas dem genom de viktiga markörerna Foxp3+, CD25högoch CD127–9,10,11. Likaså flera markörer tillskrevs CD8+ Tregs, som CD122+, CD28-, CD45RClåg, PD1+, och Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. under de åren, uttryck för GITR, CTLA4 och cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var dessutom associerade till en Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Dock saknar framväxande reglerande cellpopulationer, såsom Bregs, RegMCs eller NKTregs, relevanta specifika markörer. Bregs redovisas faktiskt oftast omogna CD24+ celler, med tvetydiga CD27 uttryck och ibland produktion av IL-10, TGFβ eller granzym B22,23,24. Komplexiteten av myeloida cell härstamning kräver en kombination av flera markörer att definiera deras reglerande eller proinflammatoriska profil såsom CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Slutligen, vissa markörer har rapporterats att identifiera NKTregs såsom CD11b+, CD27+, TGFβ+, men fler studier behövs för att ytterligare fenotypiskt beskriva dem27,28,29 ,30,31,32. Således, bevis av suppressiv aktivitet krävs att legitimera ytterligare fenotypisk beskrivning för identifiering av nya biomarkörer, nya immunoregulatoriska medlare, och utvidga tillämpningsområdet till ny cellterapi.

Vi föreslår två kompletterande metoder för att utvärdera celler suppressiv aktivitet. Först in vitro- metoden består av odlingsskålar suppressiv celler med märkta effektor T-celler stimuleras av allogena givare antigenpresenterande celler (APC) vid olika förhållanden under 6 dagar och analysera effektor T cell spridning som återspeglar givare-riktat immunsystemet. Celler från behandlade råttor kan jämföras direkt till celler från naiva råttor och icke behandlat ympade råttor för suppressiv aktivitet (eller någon annan rättslig cell befolkningen), i en rad suppressor: effektor nyckeltal. Dessutom denna metod kräver inte någon transplantation och resultat inom 6 dagar. Det andra består metoden i vivo av överföring de avsedda regulatoriska cellerna från en behandlade råtta till en nyligen bestrålade ympade mottagare. Medan B-celler, myeloida celler eller T-celler från icke-behandlade naiva råttor är vanligtvis att hämma akut avstötning och förlänga Transplantatöverlevnaden vid överföring, celler med potentierade suppressiv aktivitet från behandlade-mottagare har attributen 1,2,3,4,33. Lymfopeni induceras av bestrålning av mottagaren rekommenderas att tillåta adoptively överförda celler att förbli opåverkad av blod homeostas och behärska lättare immunsvaret mot givaren. För båda metoderna, in vitro- utnyttjande av allogena tredje part trupptransportfordon eller i vivo överföring av suppressiv möjliggöra celler till mottagare som ympats med en tredje part hjärta analys av anti givare specificitet. Metoden i vivo kräver ett betydande antal celler, dåligt representerade kan cellen subpopulations bedömas mer enkelt för suppressiv aktivitet in vitro-33.

Humorala svar kan också mätas för att bedöma tillståndet för tolerans och kontroll av riktad antikroppssvaret mot givaren antigener. Tolerans kan faktiskt kännetecknas av avsaknad av humorala svar mot givaren men bevarande av kapacitet för mottagarna att utveckla humorala svar på nya antigener och bevarandet av minnet svaren. Första är principen om alloantikropp upptäckt baserad på erkännande av donatorcellerna av mottagarens antikroppar efter inkubering av givare celltyp med serum från en ympade mottagare. Andra, humorala svar riktas mot exogena antigen kan vara bedömda följande stimulering av långsiktiga tolerant mottagare med Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulgerade med komplett Freund's adjuvans. Förekomst av specifika IgM och IgG antikroppar mot antigen kan påvisas 4 och 13 dagar, respektive, efter immunisering, med enzym länkade ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. För det tredje, bevarandet av immunologiskt minne Svaren kan bedömas genom injektion av xenogena röda blodkroppar (RBC) dagar -7 och + 3 av transplantation och röda blodkropparna färgning med mottagarens serum insamlade dagar + 8 och + 17 efter transplantation. Alla dessa metoder möjligt för identifiering av immunglobulin subtyper med specifika sekundära antikroppar, och snabb förvärv av resultat i mindre än 1.5 h av FACS färgning eller ett par timmar med ELISA.

Slutligen, dessa protokoll är utformade för karaktärisering av transplantation modeller, och kan vara, delvis, tillämpas på autoimmun sjukdomsmodeller. Principerna för metoden kan överföras till alla arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Alla protokoll här har godkänts av en etisk kommitté och bör utföras på ett sterilt sätt.

1. generation av tolerans i en modell av hjärt transplantatavstötning hos råtta

  1. Lew.1W LEW.1A transplantatavstötning förfarandet
    1. Söva en givare hane LEW.1W råtta med isofluran-O2 inandning, kompletterad med 1% N2O efter 5 min. plats djuret i dorsala decubitus, och desinficera buken med betadine att utföra en torakotomi (dvs, snitt i den pleural utrymme i bröstet).
      1. Klämma den underlägsna och överlägsna venae cavae, ligatur dem och skär dem. Sedan skär lungartären och aorta och spara transplantat i kalla 0,9% NaCl.
    2. Söva en 250 g manliga LEW.1A mottagarens råtta (av 8-12 veckor) med isofluran-O2 inandning, kompletterad med 1% N2O efter 5 min. Placera djuret i dorsala decubitus och desinficera buken med betadine att utföra en xyphopubic laparotomi (dvs.stora snitt från xiphoid process att blygdbenssammanfogningen).
      1. Yttre tarmarna, klämma buken blodkärlen, utföra en Término-laterala anastomos (dvs anslutning mellan slutet på en kanal och väggen i den andra) mellan graft aorta och bukaorta och mellan den pulmonell artär och buken vena cava, och ta bort klämmorna.
    3. Sutur muskulös planet och huden, och desinficera med betadine.
    4. Injicera nalbuphine (smärtstillande medel) 6 mg/kg subkutant (s.c.) och oxytetracyklin (antibiotikum) intramuskulärt (i.m.), och placera djuret under en värmelampa tills djuret vaknar. Injicera buprenorfin (opioid) (50 µg/kg) i.m. och meloxikam (icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel) (0,3 mg/kg) s.c. dagen av transplantation och en dag efter.
  2. Induktion av tolerans genom blockad av costimulatory interaktioner
    1. Följ steg 1.1.1. till 1.1.2.
    2. I ett sekretessbelagda A2 område i djuranläggningen, späd 2 x 1010 smittsamma partiklar av AdCD40Ig (ett adenovirus som kodning CD40Ig, en chimär molekyl som blockerar de CD40-CD40L interaktionerna) i laktat lösning att nå en slutlig volym av 150 µL och injicera i 3 Poäng (3 x 50 µL) i ventrikulära väggen i spetsen av graften.
    3. Följ steg 1.1.3 till 1.1.4.
      Obs: AdCD40Ig behandling kan vara associerade med anti-CD8α, anti-ICOS eller anti-CD28 antikropp injektioner2,35,36.
  3. Induktion av tolerans av överuttryck av ett rekombinant protein
    1. Späd 1 x 1012 virala genomet hos råtta IL34-rekombinant AAV i laktat lösning att nå en slutlig volym av 100 µL. söva en 150 g LEW.1A råtta med isofluran-O2 inandning och injiceras intravenöst (IV) i penis anda.
    2. En månad efter AAV-IL34 injektion, utföra en LEW.1W transplantat LEW.1A mottagaren enligt protokollet 1.1.

2. in Vitro -bedömning av celler suppressiv aktivitet av blandade lymfocyter reaktioner (MLRs)

Obs: Suppressiv aktivitet av celler från behandlade tolerant råttor ska jämföras med motsvarande befolkningen från syngena ympade mottagare eller naiva råttor.

  1. Isolering av allogena trupptransportfordon: dess dendritiska celler (PDC)
    1. Söva en manlig LEW.1W naiv givare råtta med isofluran-O2 inandning, kompletterad med 1% N2O efter 5 min. Placera djuret i dorsala decubitus och desinficera buken med betadine att utföra en splenektomi. Ta bort mjälten genom transecting fartyg, spara mjälten kallt 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sutur djuret.
    2. Överföra mjälte i en maträtt, ta bort 1 X PBS och BEGJUTA med 5 mL 0,2% kollagenas D. För att förbättra enzym matsmältningen, mjälte, skuren i små bitar och inkubera 15 min vid 37 ° C.
    3. Tillsätt 500 µL 0,1 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), överföra mjälte bitarna i en sil och krossa mjälte med en spruta kolv att separera celler. Överför till en tub och tvätta cellerna med 15 mL 1 X PBS. Centrifug 10 min vid 430 x g. Kassera supernatanten.
    4. För att eliminera röda blodkroppar och trombocyter, återsuspendera pelleten splenocyte i 10 mL hypoton lösning och inkubera 5 min i rumstemperatur (RT). Tvätta med 1 X PBS och centrifugera 10 min vid 190 x g. Kassera supernatanten.
    5. Ta bort kollagenfibrer genom filtrering på ett 100 µm vävnad filter. Räkna cellerna om du vill justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% fetalt kalvserum (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Obs: Numrera av splenocytes bör vara mellan 4 x 108 och 7 x 108 celler.
    6. Berika för celler av intresse av negativa val innan cellen sortera. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C med 2 µg/mL renat antikroppar specifika för T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klon och anti-TCRγδ, V65 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon) och NK-celler (anti CD161, 3.2.3 klon), tvätta med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och centrifugera 10 min vid 430 x g . Kassera supernatanten.
    7. Tvätta med magnetiska pärlor 3 gånger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Använda 3,5 µL pärlor/106 splenocytes, tvätta genom att lägga till 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, plats för 1 min på magneten, och kasta bort supernatanten. Upprepa två gånger. Återsuspendera pärlorna i 10 volymer 1 X PBS/2% FCS/0,5 mm EDTA (exempelvis 35 µL pärlor är utspätt i 350 μl 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Ta bort oönskade celler genom att blanda splenocytes med magnetiska pärlor under 10 minuter vid 4 ° C under agitation, placera röret på magneten för 1 min och överför supernatanten till en ny tub. Upprepa två gånger. Räkna cellerna och justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Anmärkning: Antalet berikade splenocytes bör ligga mellan 5 x 107 och 9 x 107.
    9. Färga celler med märkta antikroppar för ytterligare sortering av PDC: undantar återstående T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klon) eller B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon) och sortera CD4+ (anti-CD4, OX35 klon) CD45R+ celler (anti-CD45R, His24 klon). Etiketten pärlor med varje Ab att etablera en kompensationsmatris på FACS. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C och tvätta med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm vävnad filter, och etiketten döda celler genom att lägga till DAPI med en slutlig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortera celler med en 70 µm munstycke cell sorterare, efter gating på DAPI–TCR–CD45RA–CD4+CD45R+ som visas i figur 1.
  2. Isolering av responder effektor T-celler (CD4 + CD25 – T-celler)
    1. Skörda mjälte från en icke-behandlade icke-ympade naiva LEW.1A råtta och spara den i kallt 1 X PBS.
    2. Överför mjälte i en sil som placeras i en skål och tillsätt 10 mL av 1 X PBS. Krossa mjälte med en spruta kolv att separera celler. Överför cellerna till en 50 mL tub, tvätta med 1 X PBS och centrifugera 10 min vid 430 x g. Kassera supernatanten.
    3. Att eliminera röda blodkroppar och trombocyter, återsuspendera pelleten splenocyte i 10 mL hypoton lösning för 5 min på RT, sedan tvätta i 1 X PBS och centrifugera vid 10 min 190 x g. Kassera supernatanten.
    4. Ta bort kollagenfibrer genom filtrering på ett 100 µm vävnad filter. Räkna cellerna om du vill justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Obs: Numrera av splenocytes bör vara mellan 3 x 108 och 5 x 108 celler.
    5. Berika cellerna av intresse innan du sorterar. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C med 2 µg/mL renat antikroppar specifika CD8 celler (anti-CD8α, OX8 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon), NK-celler (anti CD161, 3.2.3 klon), myeloida celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), gamma delta T celler (anti-TCRγδ, V65 klon). Tvätta sedan med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och centrifug 10 min vid 430 x g. Kassera supernatanten.
      Obs: för att sortera naturliga CD8+ Tregs från naiva råttor samtidigt som CD4+ effektor T-celler, Lägg inte till anti-CD8α Ab under utarmning.
    6. Tvätta de magnetiska pärlorna 3 gånger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrivs i steg 2.1.7.
    7. Ta bort de oönskade cellerna genom att blanda splenocytes med magnetiska pärlor under 10 minuter vid 4 ° C under agitation, sedan placera röret på magneten för 1 min och överför supernatanten till en ny tub. Upprepa två gånger. Räkna cellerna och justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Obs: Antalet splenocytes bör ligga mellan 5 x 107 och 8 x 107 celler.
    8. Lägg till märkt antikroppar mot typ CD4+CD25– T-celler: anti-TCRαβ (R7/3 klon), anti CD4 (OX35 klon), anti-CD25 (OX39 klon) och inkubera 15 min vid 4 ° C. Samtidigt sortera CD8+CD45RClåg Tregs, lägga till anti-CD45RC Ab (OX22 klon). Etikett pärlor med varje Ab att ställa in en kompensationsmatris för vidare bearbetning på flödescytometri. Tvätta cellerna med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och Kassera supernatanten.
    9. Återsuspendera cellerna till 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm vävnad filter, och etiketten döda celler genom att lägga till DAPI med en slutlig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortera cellerna med en 70 µm munstycke cell sorterare av gating på DAPI –TCR+CD4+CD25– celler som responder celler (och vid behov DAPI –TCR+CD4–CD45RClåg som CD8+ Tregs suppressiv celler) som visas i figur 2.
  3. Isolering av suppressiv celler
    Obs: Dela upp mjälten i två portioner: sortera en på B-celler, myeloida celler, och NK-celler och den andra på CD4+ och CD8+ CD45RClåg T celler, för att bedöma deras undertryckande funktion.
    Obs: För adoptivföräldrar cell överföring, spara 1 x 108 splenocytes att fungera som den positiva kontrollen av tolerans av överföring, om det behövs.
    1. Sortering av B-celler, myeloida celler och NK-celler
      1. Följ protokoll 2.1.1 till 2.1.5.
      2. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C med 2 µg/mL T-cell-specifika omärkt antikroppar (anti-TCRαβ, R7/3 klon och anti-TCRγδ, V65 klon), tvätta med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och centrifugera 10 min vid 430 x g. Kassera supernatanten.
      3. Tvätta med magnetiska pärlor 3 gånger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrivs i steg 2.1.7.
      4. Blanda i splenocytes med magnetiska pärlor att ta bort oönskade celler och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C under agitation, sedan placera röret på magneten för 1 min och överför supernatanten till en ny tub. Upprepa två gånger. Räkna cellerna och justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Lägga till märkt antikroppar i splenocytes att sortera celler med misstänkta suppressiv aktivitet såsom myeloida celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon) eller NK-celler (anti-CD161, 3.2.3 klona). Etikett pärlorna med varje Ab att etablera en kompensationsmatris på FACS. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C och tvätta med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm vävnad filter, och etiketten döda celler genom att lägga till DAPI med en slutlig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortera cellerna med en 70 µm munstycke cell sorterare av gating på DAPI–CD11b/c+ för myeloida celler, CD45RA+ för B-celler och CD161+ för NK-celler som visas i figur 3.
    2. Sortering av CD4 + och CD8 + CD45RC låg T celler
      1. Följ protokoll 2.2.1 till 2.2.4.
      2. För negativa urval på en magnetisk kolumn, inkubera cellerna 15 minuter vid 4 ° C med 2 µg/mL renat antikroppar specifika för B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon), NK-celler (anti CD161, 3.2.3 klon), myeloida celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), gamma delta T celler ( anti-TCRγδ, V65 klon), tvätta dem med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och centrifugera 10 min vid 430 x g. Kassera supernatanten.
      3. Tvätta de magnetiska pärlorna 3 gånger med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrivs i steg 2.1.7.
      4. Ta bort de oönskade cellerna genom att blanda splenocytes med magnetiska pärlor under 10 minuter vid 4 ° C under agitation, sedan placera röret på magneten för 1 min och överför supernatanten till en ny tub. Upprepa två gånger. Räkna cellerna och justera cellkoncentrationen till 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Lägga till märkt antikroppar i cellerna att sortera Tregs: anti-TCRαβ (R7/3 klon), anti-CD4 (OX35 klon), anti-CD45RC (OX22 klon). Etikett pärlorna med varje Ab att etablera en kompensationsmatris på FACS. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C och tvätta med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm vävnad, och etiketten döda celler genom att lägga till DAPI med en slutlig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortera cellerna med en 70 µm munstycke cell sorterare av gating på DAPI–TCR+CD4+CD45RClåg som CD4+Tregs och DAPI–TCR+CD4–CD45RC låg som CD8+Tregs ( figur 4).
        Obs: Det anti-CD8α Ab (OX8 klon) kan användas i stället för den anti-CD4 Ab om T-celler diskrimineras från CD4+icke-T-celler av anti-TCR märkning. Ett överskott av CD4+Tregs ska sorteras i väntan på celldöd på grund av Cell spridning färgämne (CPD) märkning.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) märkning av responder celler att mäta spridning
    1. Efter responder cell sortering, tvätta två gånger cellerna med 1 X PBS.
    2. Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS och inkubera med 0,5 µM CFSE för 5 min på RT i mörkret. Stoppa reaktionen genom att lägga till FCS 1,5 X volymen och centrifugera 10 min vid 430 x g vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    3. Tvätta två gånger cellerna med komplett medium, och räkna cellerna.
      Obs: Räkna 30% av cellerna döden på detta steg.
  5. CPD märkning av CD4 + Tregs för suppressiv test på CD4 + effektor celler
    Obs: Detta steg krävs att diskriminera CFSE–CD4+Tregs från CFSE– prolifererande responder CD4+T-celler på dag 6 av coculture av gating på CPD– celler.
    1. Efter CD4+ Tregs cellen sortering, tvätta två gånger cellerna med 1 X PBS.
    2. Att resuspendera cellerna vid en koncentration på 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS och inkubera med 10 µM av CPD V450 i 20 min på RT i mörkret.
    3. Tvätta två gånger cellerna med komplett medium, och räkna cellerna.
      Obs: Räkna 30% av cellerna döden på detta steg.
  6. Råd för coculture
    1. Använda kultur i medelstora bestående av: RPMI 1640 medium kompletteras med beta-merkaptoetanol (5 x 10-5 M), penicillin (100 U/mL), streptomycin (0,1 mg/mL), natrium pyruvat (1 mM), glutamin (2 mM), HEPES buffert (1 mM), icke-essentiella aminosyror (1 X), FCS () 10%).
    2. Kultur celler i 96 brunnar U bottenplåt.
    3. Lägga till celler i följande ordning: suppressiv celler, responder celler och allogena celler.
    4. Hålla konstant antalet responder T celler och allogen trupptransportfordon och testa ett utbud av Tregs nummer. Till exempel, baserat på 4:4:1, 5 x 104 suppressiv celler, 5 x 104 responder celler och 1,25 x 104 allogena celler och förhållande 2:4:1, 2.5 x 104 suppressiv celler, 5 x 104 responder celler och 1,25 x 104 allogen celler.
    5. Upprätthålla andelen av 5 x 104 responder celler för 200 µL medium per brunn.
    6. För kontroller, inkludera några brunnar med responder T utan allogen trupptransportfordon (negativ kontroll) och responder T celler med allogen trupptransportfordon utan regulatoriska celler (positiv kontroll) för CFSE gating på dag 6 (se punkt 2.7.6.).
  7. FACS färgning och analys efter 6 dagar av coculture
    Obs: Spridningen av effektor celler kan bedömas vid flera tidpunkter. Observera att spridning är exponentiell: när celldelningen ökar, fler skillnader mellan suppressiv villkor och negativ kontroll kan observeras.
    1. Överföra cellerna från 96 brunnar U bottenplåtar 96 brunnar v bottenplåt och centrifugera 1 min på 1,200 x g vid 4 ° C.
    2. Spara supernatanten i en ny platta vid-20 ° C för att mäta cytokin nivåer, om det behövs.
    3. Tvätta cellerna med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per brunn och centrifugera 1 min vid 1200 x g vid 4 ° C.
    4. Lägga till antikroppar i cellerna att ytterligare gate på responder T celler: anti-TCRab (R7/3 klon) och anti-CD4 (OX35 klon). Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C och tvätta två gånger med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per brunn. Kassera supernatanten.
    5. Tillsätt 100 µL av DAPI utspätt till 0,1 µg/mL i 1 X PBS och läsa plattan med en FACS analyzer.
    6. Analysera CFSE profilen av gating på DAPI negativa (levande celler) CPD negativ (icke-CD4+Tregs) TCR+CD4+ celler. Ostimulerade responder celler har maximal CFSE ljusstyrka som visas i figur 5 nedre vänstra histogram. I närvaro av allogena trupptransportfordon har responder cellerna maximal spridning och minimal CFSE ljusstyrka (nedre, mellersta). I närvaro av allogena trupptransportfordon och regulatoriska celler har effektor cellerna medellång spridning och CFSE ljusstyrka (nedre, högra hörnet).

3. in Vivo bedömning av aktiviteten celler suppressiv av adoptiv Cell överföring i ett hjärta ympade mottagaren

Obs: Bestrålning behövs för att eliminera värdcellerna och gynna givaren cell engraftment och spridning.

  1. Bestråla transplantat mottagarna tidigt på dagen innan graften till förutsättning mottagaren. Söva råttor med i.m. injektion av xylazin (8 mg/kg)-ketamin (80 mg/kg) och bestråla dem vid en dos på 4,5 Gy med röntgen.
  2. Följ protokoll 2.3 att isolera cellerna av intresse.
    Obs: Spara 1 x 108 splenocytes att fungera som en positiv kontroll av tolerans av överföring, om det behövs.
  3. 12 h efter bestrålning (dagen innan transplantat, på kvällen), söva råttorna vid inandning av 4% isofluran-O2 och ingjuta cellerna (5,0 x 107 T celler, 3.0 x 107 B celler, 3.0 x 107 myeloida celler eller 1,50 x 108 splenocytes som den positiva kontrollen av tolerans av överföring) i.v. i penis anda.
    Anmärkning: Antalet celler krävs för tolerans av överföring beror av suppressiv aktiviteten i cellerna.
  4. Nästa dag Följ protokollet 1.1 att utföra transplantatavstötning. Följ transplantat evolution genom palpation via buken.

4. givare påvisande av specifika antikroppar

Obs: IgG Svaren riktad mot transplantat givaren mäts av ruva celler från givare med serum av mottagaren. Subtrahera bakgrunden induceras av direkt färgning av LEW.1W B-celler av ruvning cellerna med syngena LEW.1W serum.

  1. Skörda blod från råttor och centrifugera 15 min vid 1200 x g vid 4 ° C. Spara serum. Serum kan förvaras vid-20 ° C eller användas omedelbart. Inaktivera ett komplement i sera genom ruvning i 30 min vid 56 ° C.
  2. Skörda mjälte från en givare LEW.1W råtta och spara den i kallt 1 X PBS. Följ stegen 2.2.1. till 2.2.4. Lägg 2 x 105 celler per brunn i en 96-väl V bottenplatta. Centrifugera 1 min på 1,200 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
  3. Späd med referensserum seriellt från 1/10 till 1/270 i 1 X PBS (4 utspädningar/prov). Inkubera cellerna för 1 h vid 4 ° C med 25 µL utspädda serum per brunn. Räkna antalet givare-specifika IgG subtyper (IgG, IgG1, IgG2a IgG2b.) immunsvaret att analysera per prov (1 serum x 4 utspädningar x 4 IgG subtyper). Tvätta cellerna med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och Kassera supernatanten.
  4. Inkubera cellerna med varje mus anti råtta IgG subtyp Ab fluorokrom-märkt under 30 minuter vid 4 ° C, en subtyp per brunn.
    Obs: Om fluorokrom-märkt anti råtta Ig Ab inte är tillgängliga, är det möjligt att använda renat omärkt musen anti råtta IgG subtyp Ab och en fluorokrom-märkt sekundära antimus Ab. beroende på tillgängliga fluorokromer och cytometer konfiguration, flera anti råtta IgG undertyper kan testas i en brunn med lämpliga inställningar.
  5. Tvätta cellerna med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA två gånger och Kassera supernatanten.
  6. Tillsätt 100 µL av DAPI utspätt till 0,1 µg/mL i PBS och läsa plattan med en FACS analyzer.
  7. Läs genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) av anti råtta IgG subtyp Ab märkt med fluorokrom på alla DAPI– celler. Subtrahera MFI erhålls med naiva LEW.1A serum i LEW.1W celler (bakgrundsfärgning, nederst till vänster) från MFI erhålls med sera från varje mottagare i LEW.1W celler med motsvarande utspädning (nedre mitten för obehandlade kasserande mottagare som Visa maximal MFI och botten rätt för behandlade tolerant mottagare som visar mellanliggande MFI) (figur 6).

5. bedömning av humorala svar på exogena antigen (Naive och minne)

Obs: Serum från råttor före transplantation, behandling och immunisering bör användas som negativa kontroller av humorala svar. Annars, icke-immuniserade naiva råttor kan användas. Serum från immunkompetenta mottagare, dvs., transplanterade exoantigen-immuniserade och kasserande mottagare, används som positiva kontroller av humorala svar.

  1. Kapacitet att utveckla humorala svar till en nya antigen (figur 7)
    Obs: Denna metod är en relativ kvantifiering av humorala svar eftersom det inte innehåller en standard. En absolut Ig kvantifiering skulle vara möjligt genom att lägga till en rad utspädningar av råtta IgG eller IgM anti-KLH Ab med känd koncentration i steg 5.1.6.
    1. Emulgera 50 µg KLH i 200 µL komplett Freund's adjuvans och injicera i svanen av lång-efterlevande/tolerant mottagare, styra obehandlad kasserande mottagare eller naiva råttor som positiv kontroll av humorala svar.
    2. Skörda blodprov 4 och 13 dagar efter immunisering och centrifugera 15 min på 1,200 x g vid 4 ° C. Spara den övre fasen är det serum. Skörda serumet från icke-immuniserade råttor för en negativ kontroll. Serum kan frysas vid-20 ° C tills ELISA-testet.
    3. Päls ELISA-plattorna (platt botten) med 50 µL per brunn KLH utspätt till 10 µg/mL i 1 X PBS över natten vid 4 ° C. Kontrollera beläggning lösningen omfattar alla brunnarna.
    4. Ta bort den överskjutande obestruket KLH genom tvättning. För att tvätta, tillsätt 150 µL per brunn av tvättbuffert (1 X PBS som innehåller 0,1% Tween) och flick.
    5. Blockera ospecifik bindning av mottagarens Ig genom inkubation för 1 h vid 37 ° C med 100 µL per brunn av tvättbuffert innehållande 10% FCS. Tvätta en gång.
    6. Seriellt späd mottagarens serum i tvättbuffert från 1/40 till 1/512, tillsätt 50 µL per brunn i dubbletter av seriell utspädning till belagda plattan och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C. Hålla några brunnar som är gratis hos serum för en negativ kontroll. Tvätta två gånger.
    7. Tillsätt 50 µL av 1 µg/mL biotin-konjugerad anti råtta IgM Ab i brunnar som innehåller serumet skördas på dag 4 i mottagare eller 50 µL av biotin-konjugerad anti råtta IgG i brunnar som innehåller serumet skördas på dag 13 och inkubera 1 h vid 37 ° C. Tvätta två gånger.
    8. Tillsätt 50 µL per brunn av HRP-konjugerad streptividin på 1 µg/mL för 45 min vid 37 ° C. Tvätta 3 gånger.
    9. Tillsätt 50 µL av 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametylbensidin (TMB) substrat för < 30 min på RT och stoppa reaktionen med 25 µL 2 M svavelsyra när positiva kontroller är mättade.
    10. Läs av absorbansen vid 405 nm. Jämför den optiska densiteten som erhållits med mottagarens serum med den som erhålls med det naiva råtta kontrollserumet.
  2. Bedömning av humorala svar minneskapacitet (figur 8)
    1. 7 dagar före transplantation, injicera i.v. 109 i xenogena RBC utspätt i 800 µL av 1 X PBS i naiva råttorna. Röda blodkropparna kan vara från får, häst eller någon annan art.
    2. Utföra transplantationen och administrera tolerogena behandling.
    3. 3 dagar efter injicera igen i.v.109 RBC utspätt i 800 µL av 1 X PBS i transplantat mottagare och icke-ympade råttor.
    4. Skörda blod prover 5 och 14 dagar efter den andra immunisering och centrifugera 15 min vid 1200 x g vid 4 ° C till återvinna den övre serum-fasen. Serum kan förvaras vid-20 ° C eller användas omedelbart. Inaktivera ett komplement i råtta sera av ruvning 30 min vid 56 ° C före användning.
    5. Lägg till 2 x 105 RBC/väl av en 96-väl V bottenplatta. Centrifugera 1 min vid 1200 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten noggrant av aspiration.
    6. Seriellt späd sera 2-faldigt från 1/10 till 1/1280 i 1 X PBS (8 utspädningar/prov). Inkubera cellerna för 1 h vid 4 ° C med 25 µL utspädda serum per brunn. Tvätta cellerna med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA och Kassera supernatanten.
    7. Inkubera cellerna med RBC arter-adsorberat anti råttan IgG eller IgM subtyper märkt med fluorokrom under 30 minuter vid 4 ° C, en subtyp per brunn. Bedöma råtta IgM och IgG anti-RBC i serum skördas 5 och 14 dagar efter immunisering, respektive. Tvätta cellerna med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA två gånger och Kassera supernatanten.
      Obs: Om fluorokrom-märkt anti råtta Ig Ab inte är tillgängliga, är det möjligt att använda renat omärkt musen anti råtta IgG subtyp Ab och en fluorokrom-märkt sekundära antimus Ab.
    8. Tillsätt 100 µL av DAPI utspätt till 0,1 µg/mL i 1 X PBS och analysera cellerna med en FACS analyzer.
    9. Representera MFI som en funktion av utspädning för varje grupp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bedömningen av suppressiv aktivitet efter sortering av trupptransportfordon (figur 1), responder celler och Tregs samtidigt (figur 2), eller individuellt (figur 4), och eventuella andra förmodade regulatoriska celler (figur 3), kan vara gjort i vivo genom direkt injektion i regulatoriska celler och in vitro- genom mätning av CFSE ljusstyrka (figur 5). Status för den humorala Svaren till mottagaren mot givaren (figur 6) eller exogena antigen (figur 7 och 8) kan också vara bedömda i vitro efter i vivo immunisering som skildras.

Figure 1
Figur 1 . Gating strategi för att sortera PDC.
Cellerna var utvalda på Morfologi storlek och granularitet (SSC-A/FSC-A), midjekort jacka har undantagits av FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H parametrar, levande celler valdes genom gating på DAPI– celler, och PDC valdes på TCR–CD45RA–CD4 + CD45R+ uttryck. Renhetsgrad bedömdes genom att lägga till DAPI sorterade celler och körs på cell Sorteraren med parametrarna för sortering. Renhet av en sällsynt sorterade befolkningen (mindre än 2%) bör vara större än 95%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Gating strategi att sortera CD4+CD25– responder T celler och CD8+CD45RClåg Tregs.
Cellerna var utvalda på morfologi, dvs storlek och granularitet (SSC-A/FSC-A), midjekort jacka har undantagits av FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H parametrar, levande celler valdes genom gating på DAPI– celler, och responder celler valdes på TCR + CD4+CD25– uttryck. CD8+Tregs har sorterats samtidigt med gating på TCR+CD4–CD45RClåg celler. Renhetsgrad bedömdes genom att lägga till DAPI sorterade celler och körs på cell Sorteraren med parametrarna för sortering. Renhetsgrad bör vara större än 95%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi att sortera B celler, myeloida celler och NK-celler.
Cellerna var utvalda på Morfologi storlek och granularitet (SSC-A/FSC-A), midjekort jacka har undantagits av FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H parametrar, levande celler valdes genom gating på DAPI– celler, och B-celler valdes på CD45RA+ uttryck, myeloida celler på CD11b/c+ uttryck och NK-celler på CD45RA–CD11b/c–CD161hög uttryck. Renhetsgrad bedömdes genom att lägga till DAPI sorterade celler och körs på cell Sorteraren med parametrarna för sortering. Renhetsgrad bör vara större än 95%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Gating strategi att sortera CD8+CD45RClåg och CD4+CD45RClåg Tregs.
Cellerna var utvalda på Morfologi storlek och granularitet (SSC-A/FSC-A), midjekort jacka har undantagits av FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H parametrar, levde celler valdes genom gating på DAPI– celler och CD4+Tregs valdes på TCR + CD4+CD45RClåga uttryck och CD8+Tregs på TCR+CD4–CD45RClåga uttryck. Renhetsgrad bedömdes genom att lägga till DAPI sorterade celler och körs på cell Sorteraren med parametrarna för sortering. Renhetsgrad bör vara större än 95%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Representativ analys av den in vitro- suppressiv assay.
Proliferation av responder analyserades genom val på Morfologi storlek och granularitet (SSC-A/FSC-A), utslagning av dubletter av FSC-W FSC- och SSC-W/SSC-H parametrar, utestängning av döda celler och CD4+ Tregs av gating på DAPI–CPDV450 – celler, urval av TCR+CD4+ celler och CFSE profil analys. CFSE grinden var baserad på ostimulerade CFSE-märkt responder celler. CFSEhög celler är celler som icke-frodas och CFSElåg är celler med ≥ 1 division. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Representativ analys av givare specifika alloantikropp svar.
Splenocytes från givare råtta inkuberades med ett utbud av utspädda Värmeinaktiverade serum från behandlade eller obehandlade mottagare eller från naiva råtta, och sedan med anti råtta IgG-FITC. Alloantikroppar upptäcks genom att analysera MFI i FITC på DAPI– z celler efter SSC och FSC midjekort jacka uteslutning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 . Principen om metoden för detektion av anti-KLH.
Mottagare var immuniserade 120 dagar efter transplantation med KLH kompletteras med CFA, och blodprov skördades 4 och 13 dagar efter immunisering. KLH proteiner var belagd på 96-platt brunnar bottenplåtar och inkuberas med serumprov från immuniserade råttor. Biotinylerade get anti råtta IgG eller IgM tillåtna detektion av anti-KLH Ab närvarande i serum skördas 4 eller 13 dagar efter immunisering. HRP-kopplade streptividin förvandlas på TMB-substratet till en blå färgad produkt som blir gul när reaktionen stoppades med svavelsyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 . Systematiken i den anti-RBC detektionsmetoden.
Mottagare var immuniserade 7 dagar före och 3 dagar efter transplantation med xenogena röda blodkroppar (RBC) och blodprov skördades från immuniserade mottagare 5 och 14 dagar efter den senaste immunisering. Röda blodkropparna inkuberades med serumprov från immuniserade råttor. Närvaron av anti-röda blodkropparna antikroppar på de röda blodkropparna upptäcktes genom färgning med märkta get anti råtta IgG eller IgM-antikroppar och FACS Canto analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Överföring av totala splenocytes till en nyligen ympade mottagare är ett effektivt sätt att upptäcka förekomsten av regulatoriska celler induceras eller förstärkte genom en behandling. Värd bestrålning-inducerad övergående lymfopeni främjar cellöverlevnad efter överföring och inrättandet av tolerans. Dessutom lämnar subletala bestrålning tid för celler med tolerogena egenskaper att konvertera till nya regulatoriska celler under immun beredning, ett fenomen som kallas smittsamma tolerans34. Vanligtvis är väl beskrivna CD4+CD25högFoxp3+CD127låg Tregs studeras först när tolerans observeras. Dock överföring av den negativa fraktionen (splenocytes utarmat i CD4+Tregs) tillåter ibland tillägg utöver de redan kända regulatoriska celler och identifiering av nya cell populationer1,2, 3,4. I AdCD40Ig-inducerad tolerans, överföring av CD4+T celler-utarmat splenocytes avslöjade upptäckten av CD8+CD45RClåg Tregs1. Dessutom successiva överföringen av totala CD8+ T celler och sedan begränsat till CD45RClåga celler, visade en sådan metod potential att gradvis identifiera en ny population av regulatoriska celler. Dessutom tillåter denna strategi analys av alla populationer. Vi har faktiskt visat att många regulatoriska celler kan samexistera och är även sannolika kompensationsmekanismer finns och2,4. Hos råttor som behandlades med CD40Ig, utarmning av CD8+ celler tillåts uppkomsten av B-celler och myeloida celler med reglerande egenskaper och överförs tolerans mot den kardiella transplantatavstötning råtta enligt protokollet beskrivs ovan2. I en modell av tolerans som induceras av överuttryck av IL34, både CD4+ och CD8+Tregs kunde överföra tolerans4.

Givare-regisserad specificitet behandling-inducerad tolerans kan bedömas på cellulära och humorala nivåer. Första, adoptiv överföring av regulatoriska celler till mottagare av en tredje part transplantat kommer inte lyckas överföra tolerans om cellerna är specifika för den första givare transplantat33. Andra, suppressiv celler bör effektivt hämmar spridningen av responder celler som svar på stimulering av trupptransportfordon från den första givaren av graften men inte från en tredje part givare2. Slutligen kan humorala svar mot givaren av graften skiljas från totalt Ig produktion i mottagaren med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. Dessutom i ett fall av tolerans specifika första kneg givaren bör mottagaren kunna utveckla en ny humorala svar mot en sekundär tredje part transplantat, ett nytt antigen eller en tidigare känd antigen16.

Kollagenas D behandling av mjälten är rekommenderad och tillrådligt att extrahera alla cellpopulationer från orgeln. Slutligen, när fenotypen av regulatoriska celler är så snäva att cellerna är dåligt representerade (< 1% av splenocytes), överföring av den negativa bråkdel jämfört med överföring av den totala befolkningen kan hjälpa skilja denna lilla suppressiv aktivitet befolkningen. Till exempel CD40Ig-inducerad CD8+Tregs specifika för en allogen peptid kan vara FACS målat med tetramers men deras låga antal tillät inte positiv överföring33,38. Dock överföring av den tetramer-utarmat CD8+CD45RClåg T celler inte överföra tolerans jämfört till totala Tregs, lyfta fram potentialen i denna subpopulation. Detta resultat bekräftades av ett in vitro- suppressiv experiment. Suppressiv experimentet var faktiskt också ett övertygande sätt att Visa Du51-specifika Tregs förmåga att undertrycka immunsvaret33.

Suppressiv protokollet beskrivs ovan är begränsad till mottagarens effektor CD4+T-cell svar på PDC: er från givaren. Detta protokoll kan anpassas genom att ersätta PDC: er av cDCs eller totala trupptransportfordon, men att de effektor: stimulator nyckeltal är lämpliga för att uppnå en måttlig proliferation hanterbart av suppressiv celler. Faktiskt, ett förhållande av CD4+CD25–T celler: PDC bör vara 4:1, medan förhållandet av CD4+CD25– T celler: cDCs bör vara 8:1 och CD4+CD25– T celler: trupptransportfordon, 1:1 eller 1:2. Nyckeltalen beror på alloreaktivitet mellan givare och mottagare; de ovanstående nyckeltal är lämpliga för en LEW.1W:LEW.1A kombination med en akut avstötning inträffar vid dag 7, men utbudet av responder: stimulator nyckeltal bör testas innan offrandet av djur. Slutligen föredras CFSE tymidin att analysera suppressiv aktivitet, för säkerhet och tillförlitlighet. Men se till möjliga distinktionen mellan suppressiv celler och responder celler för CFSE analys på dag 6 om effektor CD4+CD25– T-celler ersätts av totala splenocytes. På samma sätt säkerställa att de återstående T-cellerna bland stimulator celler inte kan föröka sig efter 35 Gy bestrålning.

Utformningen av FACS färgningen är baserat på tillgänglighet av antikroppar som anges i tabell 3. Liknande protokoll kan anpassas för möss-modeller, att säkerställa målet valör (till exempel myeloida celler är differentially beskrivs i mus och råtta).

Den heterotopisk hjärt transplantatavstötning hos råtta är en solida organtransplantation modell med stora möjligheter för transplantat resultat. Medan njurtransplanterade modellen kännetecknas av en plötslig död av mottagaren, informerar palpation av beat styrkan i hjärt transplantatet genom bukväggen på transplantat evolution39,40. Samtidig hudtransplantation eller en andra kardiella transplantat kan realiseras på hjärt transplantatavstötning mottagaren att studera minne Svaren41. Dessutom är Biomolekylär teknik och biologiska eller kemiska verktyg för utarmning av specifika celltyper som B-celler (IgM KO), CD8 celler (anti-CD8α antikroppar) eller myeloida celler (clodronate liposomer), användbara verktyg för att mäta vikten av sådan cell populationer i induktion eller underhåll av toleransen beroende på tiden efter transplantation där nedbrytande behandling administreras till mottagare1,2,3,4.

Till datum, råtta Bregs, myeloida celler och CD8+Tregs är inte väl beskrivna. Protokoll av toleransutveckling ovan föreslås som referens för karakterisering av råtta regulatoriska celler1,2,3,4. Fenotypisk Beskrivning av dessa celler och jämförelse med andra modeller av allotransplantation och andra arter kan ytterligare bidra till att diskriminera markörer av stort intresse. Faktiskt, jämförelse av Bregs från mus-modeller av tolerans och operativt tolerant patienter Markera dominans av CD5 eller CD24 markör uttryck som biomarkörer för Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . I vår modell av tolerans som induceras av AdCD40Ig kombinerat med CD8α utarmning, CD24 är ökad utsträckning jämfört med B-celler saknar suppressiv aktivitet2. Hög genomströmning digital gen uttryck RNA-sekvensering nyligen uppstått som ett innovativt verktyg att ytterligare karakterisera regulatoriska celler46.

Slutligen, protokoll för att upptäcka förekomsten av regulatoriska celler induceras av en tolerogena behandling kan anpassas till andra modeller. Här använde vi LEW.1W in LEW.1A kombination av transplantatavstötning, kännetecknas av en transplantatavstötning i cirka 7 dagar. Invertera kombinationen, som har beskrivits som strängare och där akut avstötning sker snabbare och starkare, kan användas. Autoimmun sjukdomsmodeller kan också nytta av vår erfarenhet av transplantation för att dechiffrera mekanismerna av toleransutveckling med behandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete genomfördes inom ramen för projektet Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) som ingår i programmet ”Investissements pris” franska regeringen förvaltas av ANR (ANR-11-LABX-0016-01) och av IHU-Cesti projektet finansieras också av den ” Investissements pris ”franska regeringen program, förvaltas av den franska nationella Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti projektet stöds även av Nantes Métropole och Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Tags

Immunologi fråga 126 Cell sortering regulatoriska celler Tregs Bregs RegMCs transplantation genterapi suppressiv assay hjärt transplantatavstötning alloantikropp adoptiv cell överföring råtta
<em>In Vitro</em> och <em>In Vivo</em> bedömning av T, B och myeloida celler suppressiv aktivitet och humorala svar från transplantation mottagare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bézie, S., Usal, C.,… More

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter