Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro и In Vivo Оценка T, B и миелоидных клеток подавляющих активность и гуморальные ответы от пересадки получателей

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

Summary

Здесь мы представляем протокол стимулировать толерантность в трансплантации, и оценить в пробирке и в естественных условиях подавляющей потенциала отдельных клеток подмножеств от получателя и иммунный статус получателя донора или Экзогенные антигены.

Abstract

Основной проблемой в трансплантации является достижение конкретных терпимости путем индукции регуляторных клеток. Понимание механизмов толерантности требует надежных моделей. Здесь мы описываем модели толерантности к сердечной аллотрансплантата в крыса, вызванных блокадой костимуляции сигналов или upregulation иммунорегуляторное молекул через перенос генов. Каждая из этих моделей позволило в естественных условиях поколения регуляторных клеток таких нормативных Т-клетки (Tregs), регулирующих клетки B (Bregs) или регулирования миелоидных клеток (RegMCs). В этой рукописи мы описываем две дополнительные протоколы, которые были использованы для выявления и определения in vitro и in vivo регулирования клеточной активности, чтобы определить их ответственность в терпимости индукция и поддержание. Во-первых в пробирке подавляющих assay допускается быстрой идентификации клеток с подавляющей мощностью на эффекторные иммунные реакции образом зависит от дозы и могут быть использованы для дальнейшего анализа, например измерение цитокинов или цитотоксичности. Во-вторых приемные переноса клеток от терпимая(ый) обработанных получателей недавно облученного привитые получателю, подчеркнул tolerogenic свойства этих клеток в Управление трансплантата направлены иммунных реакций и/или преобразовании новых регуляторных клеток ( назвать инфекционных толерантности). Эти методы не ограничиваются клетки с известными фенотипические маркеры и может быть расширен для любой популяции клеток. Кроме того доноров направлены allospecificity регуляторных клеток (важной целью в области) можно оценить с помощью сторонних доноров клеток или взяточничество в vitro или в естественных условиях. Наконец чтобы определить конкретные tolerogenic потенциала этих регуляторных клеток, мы предоставляем протоколы для оценки реакции гуморального антитела анти доноров и получателя способность развивать гуморальные ответы против новых или бывших известных антигенов. Модели терпимости описал могут использоваться для дальнейшей характеризации регуляторных клеток, для идентификации нового биомаркерами и иммунорегуляторное молекул и могут быть адаптированы для других трансплантации модели или аутоиммунных заболеваний в грызунов или человека.

Introduction

Аллотрансплантата сердца крыс представляет собой надежный орган трансплантации модель для оценки лечения индукции толерантности, чтобы расшифровать механизмы индукции толерантности и обслуживания и имеет потенциал, чтобы побудить функционально компетентным и доминирующей регуляторных клеток. Протоколы ниже описывают полностью несоответствие heterotopic сердечного трансплантата из крыса доноров 1W Льюис (LEW.1W, RT1u) в Льюис 1A получателей крысу (LEW.1A, RT1). В этом сочетании трансплантата острый отказ происходит быстро (около 7 дней) и может быть легко оценены трансплантата, победив измерения посредством пальпации живота. Здесь мы предлагаем три протокола, чтобы стимулировать толерантность к аллотрансплантата сердца крыс. В этих моделях терпимость является индуцированных или поддерживаемых типов различных регулирующих клеток. Во-первых, блокирование CD40-CD40L взаимодействий с аденовирус кодирования CD40Ig (AdCD40Ig) индуцированной поколения CD8+ Tregs, способны индуцировать толерантность когда восприимчивую переданы вторичных получателей привитые1. Кроме того истощение CD8+ клеток (с антител анти CD8α) в AdCD40Ig-лечение получателей генерируется Bregs и RegMCs2. Глубокий анализ CD8+ Tregs свойства подчеркнул ключевую роль несколько иммунорегуляторное молекул определяется как интерлейкин-34 (IL-34) и Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . В то время как гиперэкспрессия Ил-34 (с вектора AAV) индуцированных Tregs через поколения RegMCs, гиперэкспрессия FGL-2 индуцированных Bregs, лежащие в основе сложной сети регуляторных клеток.

Потому что хронический отказ развивается медленно и долгосрочные, углубленный анализ требуется различать терпимость против хронического отказа. Трансплантата обычно оценивается для клеток инфильтрата, фиброз, утолщение сосудистой стенки и дополнения C4d осаждения immunohistology7. Хотя гистология методы требуют жертвоприношения животных или графт биопсии, здесь мы опишем простой метод для оценки различных характеристик переносится аллотрансплантата: Эмерджентность и функция регуляторных клеток и ответы специфическое антитело против доноров крови Образец подачей cytometry (здесь, мы использовали активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS)).

Поддержание толерантности к аллотрансплантата после ареста лечения обычно ассоциируется с индукции регуляторных клеток8. В последние десятилетия, исследования фокусировались на CD4+Tregs единогласно характеризуется их ключевых маркеров Foxp3+, CD25высокийи CD127–9,10,11. Аналогичным образом, несколько маркеров были приписаны CD8+ Tregs, как CD122+, CD28-, CD45RCнизкий, PD1+и Гелиос+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. за годы, выражение ГИТР, CTLA4 и цитокинов (Ил-10, TGFβ, Ил-34, IL-35, FGL-2) были дополнительно подключены к Treg профиль3,4,6,13, 18,19,,2021. Однако новые нормативные клеточных популяций, например Bregs, RegMCs или NKTregs, отсутствие соответствующих конкретных маркеров. Действительно, Bregs главным образом помечаются как незрелые CD24+ клеток, с неоднозначной CD27 выражение, а иногда и производства Ил-10, TGFβ, или Гранзим B22,23,24. Сложность линии миелоидных клеток требуется сочетание нескольких маркеров, чтобы определить их регулирования или провоспалительных профиль например CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a или CD16325,26. Наконец, были зарегистрированы некоторые маркеры для выявления NKTregs например CD11b+, CD27+, TGFβ+, но больше исследования необходимы для дальнейшего фенотипически описания их27,28,29 ,30,,3132. Таким образом, для дальнейшей легитимизации фенотипического описания для идентификации нового биомаркерами, требуются свидетельства подавляющих деятельность новых иммунорегуляторное посредников и расширить сферу для новой клеточной терапии.

Мы предлагаем два взаимодополняющих методов оценки подавляющих активность клеток. Во-первых, в пробирке метод состоит из культивирования подавляющие клетки с метками эффекторных T клеток стимулируется аллогенной доноров антиген представляющих клеток (БТР) в различных соотношениях более 6 дней, и анализируя эффекторные T мобильных распространения, отражает доноров направленных иммуносупрессия. Клетки из очищенных крыс можно сравнить непосредственно на клетки от крыс наивными и не лечить привитые крыс для подавляющих активность (или любой другой популяции регулирования клеток), в диапазоне соотношений подавитель: эффекторные. Кроме того этот метод не требует каких-либо трансплантации, и результаты будут получены в течение 6 дней. Во-вторых метод в vivo состоит из передачи предполагаемой регуляторных клеток из обработанных крыса недавно облученного привитые получателю. В то время как клетки B, миелоидные клетки или Т-клеток от крыс-лечение наивно обычно не в состоянии препятствовать острый неприятие и продлить трансплантата выживание после приемных передачи, клетки с потенцируется подавляющих активность от лечение получатели имеют эти атрибуты 1,-2,-3,-4,-33. Лимфопения, индуцированных облучением получателя рекомендуется разрешить восприимчивую передаваемых клетки остаются незатронутыми гомеостаз крови и освоить более легко анти доноров иммунных реакций. Для обоих методов, в пробирке использования аллогенной сторонние БТРы или в естественных условиях приемных передачи подавляющие клетки в получателей, привитый сердцем сторонних позволяют анализ специфики анти доноров. В то время как в естественных условиях метода требуется значительное количество клеток, слабо представлены подавляющих активность в vitro33субпопуляции клеток может оцениваться более легко.

Гуморальные ответы также может быть измерена оценить состояние терпимости и управления направленной антитела ответов доноров антигены. Действительно терпимость может характеризоваться отсутствие гуморального иммунного ответа сторону доноров, но сохранение потенциала для получателей разрабатывать гуморальный ответ на новые антигены и сохранение памяти ответов. Во-первых принцип обнаружения alloantibody основана на признании клеток донора получателей антител после инкубации типа клеток донора с сывороткой от привитых получателя. Во-вторых, гуморальные ответы, направленные Экзогенные антигены может быть начисленных следующие стимуляции долгосрочных терпимая(ый) получателей с Keyhole Гемоцианин магнитные (KLH), эмульсии с полным Фройнд в адъювантной. Присутствие специфических IgM и IgG антител против антигенов могут быть обнаружены 4 и 13 дней, соответственно, после иммунизации, с фермента связанных Assay иммуносорбента (ELISA)34. В-третьих сохранение иммунной памяти ответов можно оценить путем инъекций культивированная красных кровяных телец (эритроцитов) дней -7 и + 3 RBCs, окрашивание с получателя сыворотки, собранных в дни + 8 и + 17, после пересадки и трансплантации. Все эти методы позволяют для выявления иммуноглобулинов подтипы, используя вторичные антитела и быстрое приобретение результаты в менее чем 1,5 h СУИМ пятнать или через несколько часов по ELISA.

Наконец эти протоколы предназначены для характеризации трансплантации модели и может быть, в некоторой степени, применяемые к моделям аутоиммунных заболеваний. Принципы метода может быть перенесен на всех видов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Здесь все протоколы были одобрены этического Комитета и должны выполняться на основе стерильной.

1. поколение толерантности в модели аллотрансплантата сердца крыс

  1. Lew.1W LEW.1A аллотрансплантата процедуры
    1. Анестезировать доноров мужского LEW.1W крыса, используя изофлюрановая O2 ингаляции, дополненные 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения торакотомии (то есть, разрез в плевральной полости грудной клетки).
      1. Зажим cavae уступает и Улучшенный полых, лигатура их и сократить их. Затем вырежьте аорты и легочной артерии и сохранить трансплантата в холодных 0,9% NaCl.
    2. Анестезировать 250г мужской LEW.1A получателя крыса (из 8-12 недель) с помощью изофлюрановая O2 ингаляции, дополненные 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения xyphopubic лапаротомия (то есть, большой разрез от мечевидного отростка лобковой симфиза).
      1. Воплощать кишечника, зажим брюшной кровеносных сосудов, выполняют термино боковое анастомоза (т.е. связь между концом одного канала и стену другого) между Аорта Трансплантат и брюшной аорты и легочной артерии и брюшной верхней полой вены и удалить зажимы.
    3. Шовные мышечной плоскости и кожи и лечить с Бетадин.
    4. Придать налбуфин (обезболивающее) 6 мг/кг подкожно (с.к.) и окситетрациклину (антибиотик) внутримышечно (и.м.) и поместите животное под тепла лампы до тех пор, пока животное просыпается. Бупренорфин (опиоиды) и.м. (50 мкг/кг) и мелоксикам (нестероидные противовоспалительные препараты) (0,3 мг/кг) s.c. день трансплантации и один день после.
  2. Индукции толерантности блокадой костимуляторных взаимодействий
    1. Выполните шаги 1.1.1. до 1.1.2.
    2. В секретной A2 площади животных фонда развести 2 x 1010 инфекционные частицы AdCD40Ig (аденовирусы, кодирование CD40Ig, химерных молекула которая блокирует взаимодействие CD40-CD40L) в раствор рингера лактата достичь окончательный объем 150 мкл и вставляют в 3 очка (3 x 50 мкл) в стенке желудочка верхушки трансплантата.
    3. Выполните шаги 1.1.3 до 1.1.4.
      Примечание: Лечение AdCD40Ig может быть связан с анти CD8α, анти ИКО или анти CD28 антитела инъекции2,35,36.
  3. Индукции толерантности, гиперэкспрессия рекомбинантных белков
    1. Разбавьте 1 x 1012 вирусного генома крысы IL34-рекомбинантных AAV в раствор рингера лактата достичь окончательный объем 100 мкл. анестезировать крыса LEW.1A 150 г с изофлюрановая O2 ингаляции и вводить внутривенно (и.в.) в духе полового члена.
    2. Один месяц после инъекции AAV-IL34, выполняют LEW.1W лоскута на LEW.1A получателя согласно протоколу 1.1.

2. в Vitro оценки подавляющих активности клеток, смешанных лимфоцитов реакций (РСЗО)

Примечание: Подавляющих активность клеток от обработанной терпимая(ый) крыс следует сравнить с эквивалентной населения от сингенных привитые получателей или наивно крыс.

  1. Изоляция аллогенной БТР: плазмоцитарная дендритных клеток (PDC)
    1. Анестезировать мужской LEW.1W наивно доноров крыс с помощью изофлюрановая O2 ингаляции, дополнен с 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения спленэктомия. Удаление селезенки, transecting сосуды, сохраните селезенки в холодную 1 X фосфат амортизированное saline (PBS) и шовные животного.
    2. Передача селезенки в блюдо, удалить ПБС и perfuse с 5 мл 0,2% d. коллагеназы Чтобы улучшить пищеварение энзима, мелко нарезать селезенки и инкубировать 15 мин при температуре 37 ° C.
    3. 500 мкл 0,1 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), передача части селезенки в сито и раздавить селезенки с поршень шприца разбить ячейки. Передача в трубку и вымыть клетки с 15 мл ПБС. Центрифуга 10 мин на 430 x g. отбросить супернатант.
    4. Чтобы устранить эритроцитов и тромбоцитов, Ресуспензируйте гранулы splenocyte в 10 мл гипотонический раствор и инкубировать 5 мин при комнатной температуре (RT). Вымойте с ПБС и центрифуги 10 мин на 190 x g. удалить супернатант.
    5. Удалите коллагеновые волокна, фильтрация на фильтр ткани 100 мкм. Подсчет ячеек для регулировки концентрации клеток до 5 x 107 кл/мл в 1 X PBS/2% сыворотке крови плода теленка (FCS) / 0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Количество splenocytes должно составлять 4 x 10-8 и 7 x 108 клеток.
    6. Обогатить для клетки интереса, негативный выбор до сортировки клеток. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к Т-клетки (анти TCRαβ, R7/3 клон и анти TCRγδ, V65 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон) и НК-клеток (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), промойте 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g . Выбросите супернатант.
    7. Вымойте с магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА. Используйте 3,5 splenocytes6 бусин/10 мкл, мыть, добавив 30 мл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА, место за 1 мин на магните и отбросить супернатант. Повторите дважды. Ресуспензируйте бисер в 10 томах 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА (например, 35 мкл бусины разбавляется в 350 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА).
    8. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при 4 ° C при агитации, поместите трубку на магните за 1 мин и передать новой трубки супернатант. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Номер обогащенного splenocytes должен колеблется в пределах 5 x 10-7 и 9 x 10-7.
    9. Запятнать клетки, используя обозначенные антитела для дальнейшей сортировки pDCs: исключить оставшиеся ячейки T (анти TCRαβ, R7/3 клон) или B (анти CD45RA, OX33 клон) и сортировать CD4+ (анти CD4, клон OX35) CD45R+ клеток (анти CD45R, His24 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
    10. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик, стробирования на CD45RA TCR–DAPI––CD4+CD45R+ , как показано на рисунке 1.
  2. Изоляции клеток-эффекторов T ответчика (CD4 + CD25 – Т-клеток)
    1. Урожай хандры от крыс LEW.1A-лечение не привитые наивными и сохранить его в холодную 1 X PBS.
    2. Передача селезенки в сито, помещаются в блюдо и добавляют 10 мл ПБС. Раздавить селезенки с поршень шприца разбить ячейки. Перевести клетки в 50 мл трубки, мыть с ПБС и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
    3. Чтобы устранить эритроцитов и тромбоцитов, Ресуспензируйте гранулы splenocyte в 10 мл гипотонический раствор для 5 мин на RT, затем промыть в 1 ПБС и центрифуги в g. 190 x 10 мин отбросить супернатант.
    4. Удалите коллагеновые волокна, фильтрация на фильтр ткани 100 мкм. Подсчет ячеек для регулировки концентрации клеток до 5 x 107 кл/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Количество splenocytes должно составлять 3 x 108 и 5 x 108 клеток.
    5. Обогатить клетки интереса до сортировки. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к CD8 клетки (анти CD8α, OX8 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон), НК-клетки (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), Гамма Дельта T клетки (анти TCRγδ, V65 клон). Затем промойте 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      Примечание: Для сортировки природных CD8+ Tregs от наивного крыс в то же время как CD4+ клеток-эффекторов T, не добавляйте анти CD8α Ab во время истощения.
    6. Вымойте магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
    7. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при температуре 4 ° C под агитации, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передачи супернатант новой трубки. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Splenocytes номер должна варьироваться от 5 x 10-7 и 8 x 107 клеток.
    8. Добавьте обозначенные антитела для сортировки CD4+CD25– Т-клеток: анти TCRαβ (клон R7/3), анти-CD4 (OX35 клон), анти CD25 (OX39 клон) и инкубировать 15 мин при 4 ° C. Чтобы одновременно сортировать CD8+CD45RCнизкой Tregs, добавить анти CD45RC Ab (OX22 клон). Метки бисер с каждой Ab создать матрицу компенсации для дальнейшей обработки на проточной цитометрии. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
    9. Ресуспензируйте клетки клетки 5 x 10- 7/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать стробирования на TCR DAPI –+CD4 клеток с сортировщик клеток сопла 70 мкм+CD25– клетки как ответчик клетки (и при необходимости TCR DAPI –+CD4–CD45RCнизкой как CD8+ Подавляющие клетки Tregs) как показано на рисунке 2.
  3. Изоляция подавляющие клетки
    Примечание: Разделить селезенки в двух аликвоты: сортировать один на клетки B, миелоидных клеток и НК-клеток, а другой на CD4+ и CD8 клетки+ CD45RCнизкой T, оценить их блокирующая функция.
    Примечание: Для передачи приемным клеток, сохраните splenocytes8 1 x 10 в качестве позитивного управления терпимости приемных переводом, при необходимости.
    1. Сортировка клетки B, миелоидных клеток и NK клеток
      1. Следуйте протоколу 2.1.1 до 2.1.5.
      2. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл Т клеток конкретных без маркировки антител (анти TCRαβ, R7/3 клон и анти TCRγδ, V65 клонировать), промойте с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      3. Вымойте с магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
      4. Смешайте splenocytes с магнитной бусины удалить ненужные клетки и проинкубируйте втечение 10 мин при температуре 4 ° C под психомоторное возбуждение, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передать новой трубки супернатант. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      5. Добавьте обозначенные антитела splenocytes для сортировки клеток с подозрением подавляющих активность, например миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон) или НК-клеток (анти CD161, 3.2.3 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      6. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик стробирования на DAPI–CD11b/c+ для миелоидных клеток CD45RA+ для клетки B и CD161+ для НК-клеток, как показано на рисунке 3.
    2. Сортировка CD4 + и CD8 + CD45RC низкой T клетки
      1. Следуйте протоколу 2.2.1 по 2.2.4.
      2. Для негативный выбор на магнитной столбца, инкубировать 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к B клеток (анти CD45RA, OX33 клон), НК-клетки клетки (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), клетки (Гамма Дельта T анти TCRγδ, V65 клон), вымыть их с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      3. Вымойте магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
      4. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при температуре 4 ° C под агитации, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передачи супернатант новой трубки. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      5. Добавьте обозначенные антитела к клеткам для сортировки Tregs: анти TCRαβ (клон R7/3), анти CD4 (OX35 клон), анти CD45RC (OX22 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      6. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр на 60 мкм ткани и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик стробирования на DAPI–TCR+CD4+CD45RCнизкой как CD4+Tregs и DAPI–TCR+CD4–CD45RC низкой как CD8+Tregs ( рис. 4).
        Примечание: Анти CD8α Ab (OX8 клон) может использоваться вместо анти CD4 Ab если T-клетки подвергаются от CD4+-T клетки, снабдив анти TCR. Избыток CD4+Tregs должны быть отсортированы в ожидании смерти клетки за счет маркировки краситель распространения клеток (ДСП).
  4. Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) маркировки ответчика клеток для измерения распространения
    1. После сортировки клеток ответчика мыть дважды клетки с ПБС.
    2. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 x 10-7 кл/мл в 1 X PBS и проинкубируйте с 0,5 мкм CFSE 5 мин на RT в темноте. Остановить реакции, добавив FCS в 1,5 раза объем и центрифуги 10 мин на 430 x g при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    3. Мыть дважды клетки с полного среднего и подсчитать количество ячеек.
      Примечание: Ожидаете 30% гибели клеток на этот шаг.
  5. ДСП маркировки CD4 + Tregs для супрессивной assay на CD4 + эффекторных клеток
    Примечание: Этот шаг необходим для дискриминации CD4 CFSE–+Tregs CFSE– пролиферирующих ответчика CD4+Т-клеток в день 6 coculture, строб на ДСП– клетки.
    1. После CD4+ Tregs ячейку Сортировка, мыть дважды клетки с ПБС.
    2. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 x 10-7 кл/мл в 1 X PBS и проинкубируйте с 10 мкм V450 ДСП для 20 минут RT в темноте.
    3. Мыть дважды клетки с полного среднего и подсчитать количество ячеек.
      Примечание: Ожидаете 30% гибели клеток на этот шаг.
  6. Советы для coculture
    1. Использование культуры в составе средних: RPMI 1640 среднего дополнена FCS (бета меркаптоэтанол (5 x 10-5 М), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл), пируват натрия (1 мм), глютамин (2 мм), HEPES буфера (1 мм), несущественные аминокислот (1 X), 10%).
    2. Культура клетки в U 96-луночных нижней плиты.
    3. Добавление ячеек в следующем порядке: подавляющие клетки, клетки ответчика и аллогенных клеток.
    4. Держите постоянное количество клеток ответчика Т и аллогенной БТР и проверить диапазон Tregs номер. Например, соотношение 4:4:1, 5 x 104 подавляющие клетки, клетки 5 х 104 ответчика и 1,25 х 104 аллогенных клеток и соотношение 2:4:1, 2.5 x 104 подавляющие клетки, клетки 5 х 104 ответчика и 1,25 х 104 аллогенной клетки.
    5. Сохранить долю 5 х 104 ответчика клеток для 200 мкл среднего/хорошо.
    6. Для элементов управления включают несколько скважин с ответчика T клетки без аллогенной БТР (отрицательный контроль) и ответчик T клетки с аллогенной БТР без регуляторных клеток (положительный контроль) для CFSE стробирования на день 6 (см. шаг 2.7.6.).
  7. Пятнать СУИМ и анализ после 6 дней coculture
    Примечание: Распространение эффекторных клеток может быть оценена в нескольких точках времени. Обратите внимание, что распространение является Экспоненциальная: как деление клеток увеличивается, может наблюдаться более различия между подавляющих условий и отрицательного контроля.
    1. Клетки перехода от U 96-луночных нижней пластины-96-луночных V дно тарелки и центрифуги 1 мин на 1200 x g при 4 ° C.
    2. Сохраните супернатант в новой пластины при-20 ° C для измерения уровни цитокина, при необходимости.
    3. Вымыть клетки с 200 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА в колодец и центрифуге 1 мин на 1200 x g при 4 ° C.
    4. Добавить антитела к клеткам для дальнейшего ворот на ответчика T клетки: анти TCRab (клон R7/3) и анти CD4 (OX35 клон). Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть дважды с 200 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА в хорошо. Выбросите супернатант.
    5. Добавьте 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в 1 X PBS и читать пластину с помощью анализатора СУИМ.
    6. Анализировать профиль CFSE, строб на DAPI отрицательной (живые клетки) ДСП отрицательный (не CD4+Tregs) TCR+CD4+ клеток. Кератоз ответчика клетки имеют максимальную яркость CFSE, как показано на рисунке 5 нижней левой гистограммы. Присутствии аллогенной БТР ответчик клетки имеют максимальное распространение и минимальной яркости CFSE (нижний, средний). Присутствии аллогенной БТР и регуляторных клеток эффекторные клетки имеют средний распространения и CFSE яркость (внизу, справа).

3. в естественных условиях оценки подавляющих активности клеток путем передачи приемным клетки в сердце привитые получателя

Примечание: Облучение необходимо ликвидировать клетки хозяина и пользу доноров клеток приживления и распространения.

  1. Облучить трансплантата получателей рано на день раньше трансплантата для предварительных условий получателя. Анестезировать крыс с i.m. инъекции Ксилазина (8 мг/кг)-кетамин (80 мг/кг) и облучать их в дозе 4,5 гр с Х-лучей.
  2. Следуйте протоколу 2.3 изолировать клетки интереса.
    Примечание: Сохраните splenocytes8 1 x 10 в качестве позитивного управления толерантности приемных переводом, при необходимости.
  3. 12 ч после облучения (накануне трансплантата, вечером), анестезировать крыс при вдыхании 4% изофлюрановая O2 и наполнить клетки (5,0 x 107 Т-клеток, 3.0 x 107 B клеток, 3.0 x 107 миелоидных клеток или 1,50 x 108 splenocytes как положительный контроль терпимости приемных переводом) и.в. в духе полового члена.
    Примечание: Количество клеток, необходимых для терпимости приемных переводом зависит подавляющих активность клеток.
  4. Следующий день, следуйте протокол 1.1 для выполнения аллотрансплантатом. Проследить эволюцию имплантата при пальпации через живот.

4. доноров специфическое антитело обнаружения

Примечание: IgG ответы, направленные донор трансплантата измеряются инкубации клеток от донора с сывороткой получателя. Вычитание фона, вызванных прямым пятная клетки LEW.1W B по инкубации клеток с сингенной LEW.1W сыворотки.

  1. Сбор крови от крыс и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C. Сохраните сыворотки. Сыворотки можно хранить при-20 ° C или используется сразу. Инактивирует дополнением в sera, инкубации на 30 минут при 56 ° C.
  2. Урожай хандры от крыс LEW.1W доноров и сохранить его в холодную 1 X PBS. Следуйте указаниям 2.2.1. для 2.2.4. Добавьте 2 x 105 клеток/колодец в 96-луночных V нижней пластине. Центрифуга 1 мин на 1200 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  3. Разбавить sera последовательно от 1/10 до 1/270 в 1 X PBS (4 разведений/образец). Инкубируйте клетки за 1 час при температуре 4 ° C с 25 мкл разбавленного сыворотка/хорошо. Предвидеть количество доноров конкретных IgG подтипы (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) иммунного ответа для анализа на сэмпл (1 сыворотки x 4 разведения x 4 IgG подтипов). Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
  4. Инкубируйте клетки с каждого анти крысы мыши IgG подтипа Ab помечены флюрохром за 30 мин при 4 ° C, один подтип/хорошо.
    Примечание: Если флюрохром помечены анти крыса Ig Ab недоступны, это можно использовать очищенный немеченого мыши анти крыса IgG подтип Ab и флюрохром меченых вторичных анти мышь Ab. в зависимости от имеющихся флуорохромов и цитометр конфигурации, несколько подтипов IgG против крыс может испытываться в одной скважине с соответствующими параметрами.
  5. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА дважды и удалить супернатант.
  6. Добавьте 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в PBS и читать пластину с помощью анализатора СУИМ.
  7. Читайте интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) подтипа IgG против крыс, которое Ab помечены флюрохром на всех DAPI– клетки. Вычесть МФО, полученные с наивным LEW.1A сыворотки на LEW.1W клетки (окрашивания фона, внизу слева) от МФО, полученные с sera от каждого получателя на LEW.1W клетки на соответствующий разрежения (нижний средний для необработанных отвергая получателей, отображения максимального МФО и нижней право для очищенных терпимая(ый) получателей, которые отображаются промежуточные МФО) (рис. 6).

5. Оценка гуморальные ответы на экзогенные антигены (наивный и памяти)

Примечание: Сыворотка от крыс до трансплантации, лечение и иммунизации должны использоваться как негативный контроль гуморальные ответы. В противном случае может использоваться крысы-прививки наивными. Сыворотка от иммунокомпетентных получателей, то есть, пересаженные exoantigen прививки и отвергая получателей, используются в качестве позитивных элементов гуморальные ответы.

  1. Потенциал для разработки гуморальный ответ на новый антигена (рис. 7)
    Примечание: Этот метод является относительной количественную оценку гуморальные ответы, как он не включает стандарт. Абсолютной Ig количественной можно, добавив ряд разведения крыса IgG и IgM анти KLH Ab с известной концентрацией на шаге 5.1.6.
    1. Эмульсию 50 мкг KLH в 200 мкл полного адъюванта 's Фройнд и привнести в хвост длинные выжившие/терпимая(ый) получателей, управления необработанными отвергая получателей или наивно крыс как положительный контроль гуморальные ответы.
    2. Собрать образцы крови на 4 и 13 дней после вакцинации и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C. Сохранить верхний этап это сыворотки. Урожай сыворотки от крыс прививки для отрицательного контроля. Сыворотке крови могут быть заморожены при-20 ° C до анализа ELISA.
    3. Слой ELISA плиты (плоское дно) с 50 мкл/хорошо KLH разводят в 10 мкг/мл в 1 X PBS на ночь при 4 ° C. Убедитесь, что решение покрытие охватывает все скважины.
    4. Удалите избыток немелованной KLH промывкой. Мыть, добавить 150 мкл/хорошо мыть буфера (ПБС, содержащие 0,1% анимации) и Флик.
    5. Блок неспецифических привязка получателя Ig, инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C с 100 мкл/хорошо мыть буфера, содержащий 10% FCS. Мыть раз.
    6. Серийно разбавить получателя sera в буфере мыть, начиная с 1/40 1/512, добавьте 50 мкл/хорошо в дубликаты серийный разрежения на пластину с покрытием и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C. Держите некоторые скважины бесплатно сыворотки для отрицательного контроля. Мыть дважды.
    7. Добавьте 50 мкл 1 мкг/мл конъюгированных биотина анти крысы IgM Ab в скважинах содержащих сыворотку собирают на 4 день в получателей, или 50 мкл конъюгированных биотина анти крыса IgG в скважинах содержащих сыворотки, найденным на 13 день и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Мыть дважды.
    8. Добавьте 50 мкл/колодец HRP-конъюгированных стрептавидина на 1 мкг/мл в течение 45 минут при 37 ° C. Вымойте 3 раза.
    9. Добавьте 50 мкл 3, 3 ', 5, 5 ' тетраметилбензидина (ТМБ) субстрат для < 30 мин на RT и остановить реакции с 25 мкл 2м серной кислоты при положительном, что контроль насыщения.
    10. Читайте поглощения в 405 нм. Сравните полученные с получателя сыворотки для одного, полученные с наивными крысы управления сыворотки оптической плотности.
  2. Оценка потенциала реагирования гуморального памяти (рис. 8)
    1. 7 дней до трансплантации, придать и.в. 109 культивированная RBCs, разбавленных в 800 мкл ПБС в наивной крыс. Эритроцитов может быть от овцы, лошади или любых других видов.
    2. Выполните трансплантации и управлять tolerogenic лечение.
    3. через 3 дня после трансплантата, снова придать i.v.109 РБК, разбавленных в 800 мкл ПБС в трансплантата получателей и не привитые крыс.
    4. Урожай после второй иммунизации и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C для восстановления этапа верхней сыворотки крови образцы 5 и 14 дней. Сыворотки можно хранить при-20 ° C или используется сразу. Инактивирует дополнением в крыса сера, инкубировать 30 мин при 56 ° C перед использованием.
    5. Добавьте 2 x 105 РБК/хорошо 96-луночных V нижней плиты. Центрифуга 1 мин на 1200 x g при 4 ° C и тщательно удалить супернатант стремлением.
    6. Серийно разбавить sera вдвое от 1/10 до 1/1280 в 1 X PBS (8 разведений/образец). Инкубируйте клетки за 1 час при температуре 4 ° C с 25 мкл разбавленного сыворотка/хорошо. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
    7. Инкубируйте клетки с РБК адсорбированные видов анти крыса IgG или IgM подтипы помечены флюрохром за 30 мин при 4 ° C, один подтип/хорошо. Оценить крыса IgM и IgG анти РБК в сыворотке крови собирают 5 и 14 дней после иммунизирования, соответственно. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА дважды и удалить супернатант.
      Примечание: Если флюрохром помечены анти крыса Ig Ab недоступны, это можно использовать очищенный немеченого мыши анти крыса IgG подтип Ab и флюрохром меченых вторичных анти мышь Ab.
    8. 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в 1 X PBS и анализировать клетки с помощью анализатора СУИМ.
    9. МФО представляют как функция разрежения для каждой группы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка деятельности подавляющих после сортировки БТР (рис. 1), ответчик клеток и Tregs одновременно (рис. 2), или индивидуально (рис. 4), и любые другие предполагаемые регуляторных клеток (рис. 3), может быть сделано в естественных условиях путем прямого впрыска регуляторных клеток и в пробирке путем измерения яркости CFSE (рис. 5). Состояние гуморального иммунного ответа получателя к доноров (рис. 6) или Экзогенные антигены (рисунки 7 и 8) также может быть начисленных в vitro после иммунизации в естественных условиях как изображены.

Figure 1
Рисунок 1 . Строб стратегия для сортировки pDCs.
Клетки были отобраны по морфологии размер и степень детализации (SSC-A/FSC-A), были исключены Дуплеты FSC-W/FSC-H и SSC-W/SSC-H параметры, живые клетки были отобраны стробирования на DAPI– клетки, и pDCs были выбраны на CD45RA TCR––CD4 + CD45R+ выражение. Чистота оценивалась путем добавления DAPI сортировки клеток и работает на сортировщике ячейку с параметрами сортировки. Чистоте редких отсортированных населения (менее 2%) должно быть более чем на 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Строб стратегии сортировки CD4+CD25– клетки ответчика T и CD8CD45RCнизкой + Tregs.
Клетки были отобраны по морфологии, т.е. размер и степень детализации (SSC-A/FSC-A), Дуплеты были исключены SSC-W/SSC-H параметрами и FSC-W/FSC-H, живые клетки были отобраны стробирования на DAPI– клетки, и ответчик клетки были отобраны на TCR + CD4+CD25 выражение– . CD8+Tregs одновременно были отсортированы по стробирования на TCR+CD4–CD45RCнизкой клетки. Чистота оценивалась путем добавления DAPI сортировки клеток и работает на сортировщике ячейку с параметрами сортировки. Чистота должна быть более чем на 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Стробирования стратегии сортировки B клеток, миелоидных клеток и NK клеток.
Клетки были отобраны по морфологии размер и степень детализации (SSC-A/FSC-A), Дуплеты были исключены SSC-W/SSC-H параметрами и FSC-W/FSC-H, живые клетки были отобраны стробирования на DAPI– клетки, и B клетки были отобраны на CD45RA+ выражение, миелоидных клеток на выражения CD11b/c+ и НК-клеток CD45RAвысокое выражение CD11b/c–CD161–. Чистота оценивалась путем добавления DAPI сортировки клеток и работает на сортировщике ячейку с параметрами сортировки. Чистота должна быть более чем на 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Строб стратегии сортировки CD8+CD45RCнизкой и CD4+CD45RCнизкой Tregs.
Клетки были отобраны на морфологию размер и степень детализации (SSC-A/FSC-A), были исключены Дуплеты SSC-W/SSC-H параметрами и FSC-W/FSC-H, жил клетки были отобраны стробирования на DAPI– клетки и CD4+Tregs были отобраны на TCR + CD4+CD45RCнизкой выражение и CD8+Tregs+CD4 TCR–CD45RCнизкой выражение. Чистота оценивалась путем добавления DAPI сортировки клеток и работает на сортировщике ячейку с параметрами сортировки. Чистота должна быть более чем на 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Представитель анализ в пробирке подавляющих пробирного.
Пролиферация клеток ответчик был проанализирован отбора по морфологии размер и степень детализации (SSC-A/FSC-A), исключение Дуплеты параметрами FSC-W/FSC-H и SSC-W/SSC-H, исключение мертвых клеток и CD4+ Tregs, строб на DAPI–CPDV450 – клетки, выбор TCR+CD4+ клетки и CFSE анализ профилей. CFSE ворота была основана на клетки кератоз CFSE-меченых ответчика. CFSEвысокой клетки являются не пролиферирующих клеток и CFSEнизкой клетки с ≥ 1 дивизион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Представитель анализ конкретных alloantibody реакции доноров.
Splenocytes от доноров крысы были инкубировали с диапазоном разреженных тепло инактивированная сыворотки из переработанных или непереработанных получателей или наивно крыса, а затем с анти крыса IgG-FITC. Alloantibodies обнаруживаются путем анализа МФО FITC на DAPI– z клетки после ККК и FSC Дуплеты изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 . Принцип метода обнаружения анти KLH.
Получатели были прививки через 120 дней после трансплантации с KLH дополнена CFA, и образцы крови были собраны 4 и 13 дней после вакцинации. KLH белки были покрытием на 96-плоские поддоны скважин и инкубировали с образцов сыворотки от прививки крыс. Биотинилированным коза анти крыса IgG или IgM, Допускается определение анти KLH Ab в сыворотке крови собирают 4 или 13 дней после вакцинации. HRP-сочетании стрептавидина превратил ТМБ субстрата синий цветные продукт, который желтеет, когда реакция была остановлена с серной кислотой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 . Схема метода обнаружения анти РБК.
Получатели были прививки за 7 дней до и 3 дня после пересадки с культивированная красные кровяные клетки (эритроциты) и образцы крови были собраны от прививки получателей 5 и 14 дней после последнего иммунизации. БС инкубировали с образцов сыворотки от прививки крыс. Наличие антител анти БС на БС была обнаружена путем пятнать с метками коза анти крыса IgG или антитела IgM и анализ СУИМ Canto. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Приемных передача всего splenocytes в недавно привитых получателя является эффективным способом обнаружить присутствие регуляторных клеток индуцированных или потенцированные лечения. Хост, облучение индуцированной переходных лимфопения способствует выживаемость клеток после передачи и установление терпимости. Кроме того, югу смертоносных облучения листья время для ячеек с tolerogenic свойствами для преобразования в новых регулирующих клеток во время восстановления иммунитета, явление, называемое инфекционных терпимости34. Обычно, хорошо описано CD4 CD25высокойFoxp3++CD127низкой Tregs сначала изучаются, когда наблюдается терпимости. Однако, передача доли негативных (splenocytes обедненный CD4+Tregs) иногда позволяет расширение за пределы уже известных регуляторных клеток и выявление новых клеток населения1,2, 3,4. В AdCD40Ig-индуцированной терпимости, передача CD4+T клетки истощены splenocytes показали открытие CD8+CD45RCнизкой Tregs1. Кроме того последующие передачи всего CD8+ T клетки, а затем ограничиваетсянизкой клетки CD45RC, показал потенциал такого метода постепенно определить новой популяции регуляторных клеток. Кроме того эта стратегия позволяет анализ всех групп населения. Действительно мы показали, что многие нормативные клетки могут сосуществовать и даже вероятно, и что компенсационных механизмов существует2,4. У крыс, получавших CD40Ig, истощение CD8+ клеток позволило появление лимфоцитов и миелоидных клеток с регулирования свойств и переданы толерантности к аллотрансплантата сердца крыс согласно Протоколу описанные выше2. В модели терпимости, индуцированных Сверхэкспрессия IL34, оба CD4+ и CD8+Tregs были в состоянии передать терпимости4.

Доноров направлены специфику лечения индуцированной терпимости может быть оценена на клеточное и гуморальное уровнях. Во-первых, приемные передачи регуляторных клеток в получателей третьей стороной трансплантата не удастся в передаче терпимости, если клетки являются специфическими для первом трансплантата доноров33. Во-вторых, подавляющие клетки должны эффективно ингибируют пролиферацию клеток ответчика в ответ на стимуляцию, БТР от первого донор трансплантата, но не от третьей стороны доноров2. Наконец гуморальные ответы против донор трансплантата можно отличить от общего производства Ig в получателю, используя протокол, описанных выше. Кроме того в случае конкретных толерантности к первом трансплантата доноров, получателей должны быть в состоянии разработать новый гуморальный ответ против вторичного трансплантата третьей стороны, новый антиген или бывших известных антигена16.

Коллагеназы D лечение селезенки является предпочтительным и желательным для извлечения всех клеточных популяций из органа. Наконец, когда фенотип регуляторных клеток настолько плотный, что клетки являются слабо представлены (< 1% splenocytes), передачи отрицательных фракции, по сравнению с передачей в общей численности населения может помочь отличить подавляющих деятельность этой небольшой населения. Например, CD40Ig-индуцированной CD8+Tregs для аллогенной пептид может быть СУИМ, окрашенных с помощью тетрамера, но их низкое число не допускает позитивные приемных передачи33,38. Однако приемных передачи CD8 Тетрамер обедненного+CD45RC,низкой T клетки не передавать терпимости по сравнению с общей Tregs, подчеркнув потенциал этой субпопуляции. Этот результат был подтвержден в пробирке с подавляющей эксперимент. Действительно подавляющих эксперимент был также убедительный способ показать Du51-конкретных Tregs способность подавлять иммунный ответ33.

Блокирующая протокол, описанные выше ограничения для получателей эффекторных CD4+Т-клеток ответов на pDCs от донора. Этот протокол может быть адаптирована, заменив pDCs cDCs или всего БТР, но обеспечение того, что коэффициенты эффекторных: стимулятор подходят для достижения умеренным распространением управляемым подавляющие клетки. Действительно, отношение CD4+CD25–Т-клеток: pDCs должно быть 4:1, тогда как отношение CD4+CD25– Т клетки: cDCs должно быть 8:1 и CD4+CD25– Т клетки: БТР, 1:1 или 1:2. Коэффициенты зависят от alloreactivity между донором и получателем; перечисленные выше коэффициенты являются подходящими для комбинации LEW.1W:LEW.1A с острой неприятие происходящих на 7 день, но спектр ответчика: стимулятор коэффициенты должны быть протестированы перед принесение в жертву животных. Наконец CFSE является предпочтительным для тимидина для анализа подавляющих активность, для безопасности и надежности проблем. Однако обеспечить возможное различие между подавляющие клетки и ответчик клетки для анализа CFSE на 6 день если эффекторных CD4+CD25– Т-клетки заменяются всего splenocytes. Аналогичным образом убедитесь, что остальные клетки T среди стимулятор клеток может распространяться после облучения 35 гр.

Дизайн СУИМ окрашивания основан на наличие антител, перечисленных в таблице 3. Аналогичные протоколы могут быть адаптированы для моделей мышей, обеспечение целевого номинала (например миелоидных клеток, дифференциально описаны в крыс и мышей).

Heterotopic аллотрансплантата сердца крыс представляет собой твердые органов трансплантации модель с большими возможностями для мониторинга результатов трансплантата. В то время как почечной аллотрансплантата модель характеризуется внезапной смерти получателя, пальпация бить прочности сердечного трансплантата через брюшную стенку сообщает трансплантата эволюции39,40. Сопутствующие кожного лоскута или второго сердечного трансплантата может быть реализована на аллотрансплантата сердца получателю изучать памяти ответы41. Кроме того биомолекулярных инженерных и биологического или химического средства для истощения типов определенных ячеек как клетки B (IgM KO), CD8 клетки (антитела анти CD8α) или миелоидных клеток (clodronate липосомы), являются полезными инструментами для оценки важности таких клеток население в индукции или поддержание терпимости в зависимости от времени пост трансплантации, где истощает лечение администрируется получателя1,2,3,4.

На сегодняшний день, крыса Bregs, миелоидных клеток и CD8+Tregs не хорошо описаны. Протоколов индукции толерантности выше предлагаются в качестве ссылки для характеризации крыса регуляторных клеток в1,2,3,4. Далее может помочь фенотипического описания этих клеток и сравнение с другими моделями аллотрансплантация и других видов дискриминации маркеры большой интерес. Действительно сравнение Bregs от мыши модели терпимости и оперативном терпимая(ый) пациентов выделить преобладание CD5 или CD24 маркер выражения в качестве биомаркеров Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . В нашей модели терпимости, индуцированных AdCD40Ig, в сочетании с истощением CD8α CD24 оверэкспрессировали, по сравнению с клетки B, отсутствуют подавляющих активность2. Высокая пропускная способность цифровой ген выражение РНК последовательности недавно возникли как новаторский инструмент для дальнейшей характеризации регуляторных клеток46.

Наконец протоколы для обнаружения присутствия регуляторных клеток, индуцированных tolerogenic лечение может быть адаптирована к другим моделям. Здесь мы использовали LEW.1W в LEW.1A сочетание аллотрансплантата, характеризуется трансплантата в около 7 дней. Инвертировать комбинация, которая была описана как более строгие и где острые отказ происходит быстрее и сильнее, может использоваться. Аутоиммунные заболевания модели также могут воспользоваться нашим опытом в трансплантации для расшифровки механизмы индукции толерантности с лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа осуществлялась в контексте проекта Labex IGO (n ° АНР-11-LABX-0016-01), который является частью программы правительства Франции «Investissements будущее», управляемой НРУ (АНР-11-LABX-0016-01), а также финансируемый IHU-Сести» Investissements будущее» французское правительство программы, управляемые по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Tags

Иммунология выпуск 126 сортировки клеток регуляторных клеток Tregs Bregs RegMCs трансплантация генная терапия подавляющих пробирного аллотрансплантата сердца alloantibody передачи приемным клеток крыса
<em>In Vitro</em> и <em>In Vivo</em> Оценка T, B и миелоидных клеток подавляющих активность и гуморальные ответы от пересадки получателей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bézie, S., Usal, C.,… More

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter