Summary
Этот протокол описывает конфокальной микроскопии обнаружения G-белком рецепторов (GPCR) интернализации в клетках млекопитающих. Она включает в себя основную клеточной культуру, трансфекцию, и конфокальную микроскопию процедуру и обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций слитого выразил GPCR.
Introduction
Клетки обладают грузовой техникой оборота для транспортировки внеклеточного материалы, такой как лиганды, микроорганизмы, питательные вещества, и трансмембранные белки-в клетку для получения информации, энергии и других целей , 1, 2. Это имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, функций тканей и общей выживаемости клеток. Экспрессии на основе клеток флуоресцирующих слитых белков является мощным средством для изучения локализации и интернализации трансмембранных рецепторов, таких как G-белком рецепторов (GPCR), в 3 сигнальных путей.
Экспрессии слитых белков , помеченные с зеленым флуоресцентным белком (GFP) из медузы Aequorea виктория, в сочетании с методами обнаружения прямой флуоресценции, получили широкое признание в белках-ориентации исследования 4, 5, 6. GFP основе detectiот того, имеет то преимущество , что позволяет в режиме реального времени обработки изображений живых клеток, избегая при фиксации артефактов 7. Серия универсальных векторов клонирования была построена , чтобы облегчить экспрессию слитых белков с GFP в различных клетках 8, 9. Вектор pEGFP-N1 является широко используемым и коммерчески плазмидный вектор, кодирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), который был оптимизирован с дикого типа GFP для более яркой флуоресценции и более высокой экспрессии в клетках млекопитающих. Для наблюдения флуоресцентный сигнал EGFP, экспрессированный в клетках млекопитающих, то флуоресцентной микроскопии следует проводить с возбуждением на 488 нм и излучение на 507 нм, предпочтительно с конфокальной микроскопии.
Мониторинг внутриклеточной локализации и лиганд-опосредованная интернализации рецепторов является общим методом для исследования сигнальной трансдукции и функции GPCRs 10 вверх>, 11. В большинстве случаев, приводит к интернализации десенсибилизации из GPCRs (затухание реакции стимула, несмотря на присутствие агонистов) 12, 13. Интернализированные рецепторы могут быть включены в лизосомы и деградируют, или они могут быть переработаны обратно к клеточной поверхности, в зависимости от природы рецепторов и клеточных линий, используемых в экспериментах.
В гонадотропин-рилизинг гормона (рецепторы GnRHRs) принадлежат к семейству GPCR и имеют типичную структуру ХВГФ белка, с внеклеточным аминоокончанию, внутриклеточный -СООН терминала, и семь трансмембранных (ТМ) домены 14. Трансфекция рекомбинантной плазмиды Sj GnRHR-EGFP (с геномом GnRHR от Sepiella арошса) и конфокальная микроскопия Обнаружение EGFP-меченного Sj GnRHR (выраженной в клетках НЕК293) были сообщено Previouхитрое и флуоресценция GFP , была создана в качестве репортера трансмембранного белка локализации анализов 15. Теперь, интернализации Sj GnRHR, активированные С. японика гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ Sj), была продемонстрированы в временных и дозозависимых способах с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление клеток
- восстановление клеток
- Передача криоконсервированных клеток почек эмбриона 293 (НЕК293), клетки человека из жидкого азота резервуара до С водяной бане при 37 ° и трясти непрерывно в течение 1 - 2 мин.
- Добавляют 10 мл ростовой среды, уравновешенную (среда Игла в модификации Игла (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и 1% пенициллина-стрептомицина раствор) до 10 см культивирования клеток в чашке. Осторожно добавьте размороженные клетки в уравновешенной среду роста.
- Инкубируйте клетки в водяной рубашке СО 2 инкубатора при 37 ° C с увлажненной атмосферой , содержащей 95% воздух и 5% СО 2 в течение 2 - 4 ч.
- Через 2 - 4 ч, проверьте, что клетки прикреплены. Заменить уравновешенную среду для роста и культуры еще в течение 24 - 48 ч.
Примечание: Изменение уравновешенной ростовой среды является полезным, поскольку она удаляет диметилсульфоксид (ДМСО) и защищает от повреждения клеток.
- <сильный> сотовый канал
- Через 24 - 48 ч, когда клетки выросли почти до слияния, отбросить уравновешенной ростовой среды и промыть клетки с 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Вихревой блюдо мягко.
- Отменить PBS и добавляют 1 мл трипсин-ЭДТА (физиологический раствор, 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА). Для того, чтобы полностью переварить клетки, вихрем блюдо тщательно и аспирата от раствора трипсина-ЭДТА. Поместите блюдо в 37 ° C водяной рубашкой СО 2 инкубаторе в течение 3 мин.
Примечание: В течение этого периода, подготовить три новых 10-см блюда культуры клеток и добавляют 10 мл уравновешенной ростовой среды для каждого. - С помощью светового микроскопа, определить, если клетки подняли со дна тарелки. Добавляют 2 мл уравновешенной ростовой среды к блюду. Смешайте с помощью пипетки и немедленно пипетка 0,6 мл клеточной суспензии к каждому из новых блюд. Аккуратно перемешать с помощью пипетки и позволяют клеткам инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2.
2. Посев клеток
- Через 24 - 48 ч, когда пассированные клетки выращивали до слияния вблизи, отбросить уравновешенную ростовую среду и промыть клетки с 2 мл PBS. Вихревой блюдо мягко.
- Отменить PBS и добавляют 1 мл трипсин-ЭДТА. Для того, чтобы полностью переварить клетки, вихрем блюдо тщательно и аспирата от трипсин-ЭДТА. Поместите блюдо в 37 ° C водяной рубашкой СО 2 инкубаторе в течение 3 мин.
Примечание: В течение этого периода, подготовить 6-луночного планшета, добавив 2 мл уравновешенной ростовой среды в каждую лунку. - Добавить 1 мл ростовой среды, уравновешенной на блюдо, если под микроскопом, чтобы клетки подняли из дна чаши. Смешайте с помощью пипетки и немедленно пипеткой 0,1 мл суспензии клеток (объем регулируется в зависимости от плотности роста клеток) в каждую лунку подготовленной 6-луночного планшета (клеточно-менее 6-луночный планшет с 2 мл уравновешенной ростовой среды). Аккуратно перемешать с помощью пипетки и позволяют клеткаминкубировать при 37 ° С и 5% СО 2.
3. Cell Трансфекция
- Метод Трансфекции 1, с липосомными
Примечание: Пожалуйста , смотрите таблицу Материалы для трансфекции реагента 1.- На следующий день, убедитесь, что клетки должны быть 85 - 95% сплошности.
- Добавьте 3 мкг плазмидной ДНК (500 нг / мкл) и 100 мкл восстановленного сыворотки носителя в стерильной микроцентрифужных пробирку и осторожно перемешать. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Подготовьте 9 мкл реагента 1 и 100 мкл восстановленного сыворотки среды в другую пробирку микроцентрифужных и осторожно перемешать. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Смешайте разбавленный плазмиду смеси разбавленным реагентом 1 (общий объем = 215 мкл). Осторожно перемешать и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте среды от клеток-культивированных пластин, и добавляют 1,5 мл свежей DMEM без FBS.
- Добавить 215 мкл ДНК-элеменСмесь прогиба реагента к каждой капле скважины, и осторожно перемешать с помощью закрученной пластины.
- Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 4 - 8 часов. Заменить со свежей DMEM с 10% FBS.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение еще 24 - 48 ч перед запуском каких - либо экспериментов.
- Метод Трансфекции 2, с липосомными
Примечание: Пожалуйста , смотрите таблицу Материалы для трансфекции реагента 2.- Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (500 нг / мкл), 4 мкл реагента 2, и 100 мкл сыворотки уменьшенные носителя в стерильной микроцентрифужных трубки. Осторожно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь трансфекции в клетки по каплям.
- После трансфекции клетки инкубируют в течение 24 - 48 ч при 37 ° С и 5% CO 2, перед запуском каких - либо экспериментов.
4. Культура клеток на покровных стеклах
- репереместить ростовую среду из культуры 6-луночного планшета.
- Промыть монослой клеток с 1 мл PBS без кальция и магния.
- Добавить 0,5 мл трипсин-ЭДТА. Вихревой блюдо тщательно и аспирата от трипсин-ЭДТА. Инкубируйте культуры пластины в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Фактическое время инкубации изменяется в зависимости от клеточной линии, используемой.
Примечание: В течение этого периода, подготовить новую пластину 12-луночного и добавить диаметр 15 мм стерильной крышкой скользит в каждую лунку. Покровные стекла с покрытием лизина, ламининым, коллагеном или могут улучшить прикрепление клеток для клеток НЕК293, которые легко отделяются. - Когда клетки отделяют, добавляют 1 мл подогретого полной среды роста в каждую лунку. Смешайте с помощью пипетки и немедленно передать необходимое количество клеток на 12-луночный планшет с покровных стеклах. Добавить свежую полную ростовую среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1 мл
- Инкубируйте клетки в течение 16 - 24 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
Примечание: После того, как 30 -60 мин, большинство клеток будут приклеены к стерильным покровным стеклам.
5. Обнаружение конфокальной микроскопии
- Клеточная локализация
- Через 16 - 24 ч, когда клетки выросли почти до слияния на стерильных покровных стеклах в 12-луночный планшет, добавьте мембранный зонд, DII, в каждую лунку, давая конечную концентрацию 5 мкМ. Разрешить клетки инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С и 5% CO 2.
- Через 30 мин, удалить уравновешенную ростовую среду и промыть клетки дважды в холодном PBS (2 - 8 ° C).
- Закрепить клеток путем добавления 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно перемешивать в течение 15 мин.
Внимание: параформальдегид умеренно токсичен при контакте с кожей или ингаляции, и обозначен как вероятный человеческий канцероген. Химикаты вытяжных шкафов, вентилируемые шкафы баланса или другие защитные меры должны использоваться во время взвешивания и обработки параформальдегида. </ Li> - Вымойте фиксированные клетки дважды в PBS. Добавить 200-300 мкл DAPI (4' , 6-диамидино-2-фенилиндола) в растворе (0,5 мкг / мл) в каждую лунку и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Вымойте клетки дважды с PBS. Осторожно снимите крышку ускользает из пластины и фитиль излишки PBS. Инверсия на предметные стекла микроскопа с грузом одной каплей монтажа среды (50% об / об глицерин / вода). Удалите излишки монтажной среды из слайдов.
- Клеточная интернализации
- Через 16 - 24 ч, когда клетки выросли почти до слияния на стерильных покровных стеклах в 12-луночный планшет, удалить уравновешенную среду для роста и добавить свежий, нагревают среду DMEM (37 ° C). Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
- Treat клеток с различными концентрациями (0, 10 -12, 10 -9 и 10 -6 М) лиганда в течение 30 мин и относиться к ним с 10 -6 М лиганда в течение различного времени (0,10, 30 и 60 мин).
- Промывают клетки дважды в холодном PBS (2 - 8 ° C). Закрепить клеток путем добавления 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно перемешивать в течение 15 мин.
- Вымойте клетки дважды в PBS. Осторожно снимите крышку ускользает из пластины и фитиль лишнюю PBS. Инверсия на предметные стекла микроскопа с грузом одной каплей монтажа среды (50% об / об глицерин / вода). Удалите излишки монтажной среды из слайдов.
- конфокальной микроскопии
- Включите на оборудовании конфокальной микроскопии, в том числе мощности ртутной лампы, PC микроскоп, сканер, и лазер. Вход в личный кабинет операционной системы, запустите программу, проверьте конфигурацию и выбрать лазер. Включите различные единица конфокальной микроскопии системы в порядке, в соответствии с инструкциями.
- Поместите подготовленные слайды на столике микроскопа. Поместите образец над линзой объектива, используя контроллер стадии. Добавьте одну каплю кедрового масла начтобы покровные при выборе масла погружения линзы. Поместите крышку скользит на салазках, стоящих перед объективом.
- Найти клетки, представляющие интерес при люминесцентной микроскопии.
- Переключение в режим сканирования. Выберите мощность лазера и спектральный диапазон флуорофоры излучения. Захват высокого качества конфокального изображения от интенсивности настройки лазерного излучения и других параметров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан пример конфокальной системы микроскопа. На рисунке 2 представлена экспрессия pEGFP-N1 в клетках НЕК293. Сигнал GFP, был обнаружен в цитоплазме и ядре. Рисунок 3 показывает внутриклеточную локализацию GnRHR из S. арошса в клетках НЕК293, в соответствии с ранее опубликованными результатами 15. Слитый белок с тегом EGFP на С-конце Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) появился зеленый в этом эксперименте , когда под CLSM. Ядро окрашивали DAPI было обнаружено в синем цвете. DiI окрашивание выделено через клеточную мембрану в красном цвете. Желтый сигнал на клеточной поверхности в объединенном изображении показано совпадение красного и зеленый, демонстрируя локализацию плазматической мембраны Sj GnRHR.
Фигуры 4 и 5 дисплейрезультаты Sj GnRHR интернализации анализов в клетках HEK293. Для того, чтобы визуализировать интернализации Sj GnRHR, клетки обрабатывали гонадотропин-рилизинг гормона (Sj ГнРГ) 15 при различных концентрациях в течение 30 мин (рисунок 4), или они были обработаны с единой концентрацией (10 - 6 М) для различных длительностей ( Рисунок 5). При отсутствии Sj ГнРГ, слитый рецептора управления (ЦТЛ) имели локализацию плазменной мембраны. Как показано на фигуре 4, при различных концентрациях лиганда, интернализация Sj GnRHR протекала в зависимости от дозы, и рецептор был полностью усвоен от поверхности клетки с 10 - 6 М лиганда. Как показано на рисунке 5, результаты анализа временного хода рецепторов интернализации с 10 - 6 М лиганда показал , что усвоеныSj GnRHR было обнаружено 10 мин после стимуляции агониста, и крайняя интернализации произошла на 60 мин. Наблюдение с конфокальной микроскопии из этих двух фигур показало , что флуоресцирующий Sj GnRHR-EGFP гибридный белок в основном локализованы в плазматической мембране и был резко и быстро усвоены в клетку в ответ на Sj GnRH пептида в клетках НЕК293.
Рисунок 1. Пример системы микроскопа конфокальной. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. конфокальной микроскопии из GFP белка в контрольной pEGFP-N1-трансфицировали НЕК293 , Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Локализация Sj GnRHR-EGFP слитого белка в клетках НЕК293 с помощью конфокальной микроскопии. Ядро окрашивали DAPI показаны синим цветом. DiI окрашивание, отображается красным цветом, указывает на клеточную мембрану. Sj GnRHR-EGFP гибридный белок показан в зеленом цвете. В объединенном изображении, желтый указывает на совпадение красного и зеленого сигналов. Все изображения представляют собой, по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ig4.jpg»/>
Рисунок 4. Интернализации Sj GnRHR-EGFP гибридного белка в клетках НЕК293 в курсе времени конфокальной микроскопией. Клетки НЕК293 , трансфицированные Sj GnRHR-EGFP плазмиды были активированы путем обработки с различными концентрациями ГнРГ в течение 30 мин. Случай, контроль был без стимуляции GnRH (CTL). Все изображения представляют собой, по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Интернализации Sj GnRHR-EGFP слитого белка в клетках НЕК293 , в зависимости от дозы с помощью конфокальной микроскопии. Клетки НЕК293 , трансфицированные Sj GnRHR-EGFP плазмиды были активированы путем обработки 10 - 6 М лиганда для различных гurations. Случай, контроль был без стимуляции GnRH (CTL). Все изображения представляют собой, по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленный здесь, обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций выраженного гибридного белка GPCR в клетках НЕК293. Методика может быть легко адаптирована для многих различных генов и типов клеток, таких как для клеточной локализации и интернализации рецепторов corazonin от тутового шелкопряда в НЕК293 и BMN клеток 16.
Успешное применение этого мощного анализа зависит от нескольких ключевых факторов. Прежде всего, это хорошее здоровье клеток, которая необходима для эффективной трансфекции и качества данных. Время инкубации трансфекции, интервал между трансфекцией и другими экспериментами, а также при прохождении трансфицированных клеток, чтобы покрыть слипы перед тем визуализации, все шаги, где повреждение культивируемых клеток возможно. Таким образом, поддержание хорошего здоровья клеток является важной предпосылкой для всех шагов в этом эксперименте, Кроме того, во избежании плотно сжатые клеток в плотных культурах имеет жизненно важное значение для того, чтобы приобрести высококачественные изображения с конфокальной микроскопией. Для того, чтобы свести к минимуму влияния флуоресцентных меток на локализации GPCRs, мы получили рецепторы с EGFP, слитых с внутриклеточной С-концом. Успешной и эффективной трансфекции гена в клетки также имеет важное значение. Эффективность трансфекции может существенно отличаться в различных клеточных линиях. Таким образом, оптимизация определенных шагов в протоколе может быть необходима, в зависимости от конкретного типа клеток, используемого. Например, в способе трансфекции 1, продолжительность инкубации трансфектированных клеток в DMEM без FBS может быть оптимизирована в соответствии с состоянием клеток. В дополнение к дозировке плазмиды ДНК, дозировка реагента липосом и снижение сывороточных средства массовой информации должны быть скорректированы в соответствии с конкретными клеточными линиями. В противном случае, метод electrotransfection может быть проведен вместо липосом реагента опосредованной трансфекции Fили приемлемая эффективность трансфекции в конкретной клеточной линии. Однако, дополнительное оборудование не требуется, и клетка в суспензии и в небольшом объеме является трудной для трансфекции с помощью electrotransfection. Истинная сила тока анализа, однако, заключается в сравнении между изменениями в одних и тех же клетках в идентичных условиях культивирования после острых манипуляций, таких как интернализации Sj GnRHR в ответ на Sj GnRH лиганд.
Интернализации является одним из доминирующих механизмов , контролирующих GPCR сигнализации , чтобы обеспечить соответствующие клеточные реакции на стимулы 11. Мы можем легко наблюдать изменения в интернализации через визуализацию с конфокальной микроскопией. Интернализации Sj GnRHR в дозах и зависимые от времени образом ясно раскрываются на рисунке 4.
Протокол мы описали может быть легко адаптирован к внутриклеточному отслеживанию другого эукариотического прoteins, такие как эстроген рецептор 17 ядерного. Тем не менее, оптимизация определенных шагов в протоколе будет необходима, в зависимости от конкретных типов клеток, используемых, которые потребуют дальнейшего изучения и практики. Тем не менее, если учесть, что внутриклеточная локализация белков имеет большое влияние на идентификации генов, модификации белковой и сигнальные пути, этот протокол, основанный на опубликованных исследованиях, может обеспечить достоверные данные и информацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
