الشيخوخة الخلوية، والدولة لا رجعة فيها اعتقال دورة الخلية، يمكن الناجمة عن مختلف الضغوط الخلوية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للحث على الشيخوخة وطرق الخلوية لتقييم علامات الشيخوخة.
وردا على الإجهاد الخلوي أو ضرر، ويمكن الخلايا المتكاثرة لحث على برنامج معين الذي يبدأ حالة اعتقال دورة الخلية على المدى الطويل، ووصف الشيخوخة الخلوية. تراكم خلايا هرمة يحدث مع الشيخوخة عضوي ومن خلال زراعة المستمرة في المختبر. خلايا هرمة تؤثر العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، وإصلاح الأنسجة وتجديدها، وقمع الورم، والشيخوخة. وتشمل السمات المميزة للخلايا هرمة، ولكن لا تقتصر على، وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال)؛ INK4A P16، البروتين p53، وP21 المستويات؛ مستويات أعلى من الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX. تشكيل المرتبطة الشيخوخة-المغاير البؤر (SAHF)؛ والاستحواذ على المصاحب الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP)، وهي ظاهرة تتميز إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات والجزيئات الإشارة. هنا، نحن تصف بروتوكولات لكلا تنسخي والشيخوخة DNA الأضرار التي يسببها في الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، نسلط الضوء تقنيات لمراقبة النمط الظاهري الشيخوخي باستخدام العديد من علامات الشيخوخة المرتبطة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX وSAHF تلطيخ، ولقياس البروتين ومرنا مستويات المنظمين دورة الخلية والعوامل SASP. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتقييم الشيخوخة في مختلف النماذج والأنسجة.
منذ أكثر من نصف قرن، ووصف Hayflick وزملاؤه كيف خلايا تتكاثر هو دون تغيير في الثقافة، ولكن فقط لفترة محدودة من الوقت 1. زراعة على المدى الطويل من الخلايا الليفية الإنسان تسبب الخلايا لوقف الانتشار. ومع ذلك، فإنها كانت نشطة عملية الأيض، وهذا ما يسمى الشيخوخة الخلوية. الشيخوخة يمكن أن تكون مفيدة لتثبيط تكون الأورام، ولكن أيضا يمكن أن يكون ضارا، كما هو يعتقد أن تساهم في فقدان القدرة على التجدد الذي يحدث مع الشيخوخة 2 و 3. وقد تبين أن خلايا هرمة تتراكم في الأنسجة كما البشر سن 4 و قد تورطت في عدد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، وإصلاح الأنسجة، والمتعلقة بالعمر التهاب 2.
الركض المستمر للخلايا في ثقافة يدفع الشيخوخة تنسخي، والتي تم ربطهالالتيلومير الاستنزاف وعدم الاستقرار الجيني. الضغوط الخلايا المختلفة، بما في ذلك الحمض النووي من التلف والمسرطنة، ويمكن أيضا أن يسبب الشيخوخة 3. الشيخوخة التي تسببها العوامل الأخرى من الاستنزاف التيلومير وغالبا ما تسمى التوتر الناجم عن الشيخوخة المبكرة أو وعموما يعتمد على INK4A P16 / الروبيديوم مسار 5. وعلى الرغم من الانتشار، تظهر خلايا هو دون تغيير عادة المغزل في الشكل، ويمكن تحديد خلايا هرمة وجود بعض الخصائص، بما في ذلك شقة، مورفولوجيا كبير وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال) (الشكلان 1 و 2). كما تتراكم خلايا هرمة علامات الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX (الشكل 3) 6، وربما، المرتبط الشيخوخة المغاير بؤر (SAHF) (الشكل 4) 7. خلايا هرمة لديهم مستويات أعلى من المنظمين دورة الخلية، بما في ذلك ع 16 (INK4A P16) و / أو P21 والبروتين p53 (الشكل 5) 8، 9. وعلاوة على ذلك، أظهرت بيانات حديثة أن خلايا هرمة يمكن أن يكون لها آثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي عن طريق إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات وكيموكينات يسمى المرتبطة الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP) 10. على الرغم من أن هذه الظاهرة SASP قد تختلف من نوع من الخلايا إلى نوع من الخلايا، بصفة عامة، ويتجلى ذلك من خلال زيادة انترلوكين 6 (IL-6)، IL-8،-محببة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF)، النمو- α منظم الجين الورمي (GRO-α)، واللائحة العامة للمنظمة، β، من بين أمور أخرى (الشكل 6). الإجهاد معين أو الضرر الذي يسبب الشيخوخة قد تؤثر أيضا على النمط الظاهري إفرازية 11 و 12 و 13. يمكن الكشف عن SASP عن طريق قياس مستويات البروتينات يفرز باستخدام ELISAs أو صفائف خلوى / البروتينالصورة = "XREF"> 10 و 14. على الرغم من أن آليات ما بعد النسخي يمكن تنظيم مستويات البروتين SASP 11، 15، 16، 17، والتغيرات في مستويات مرنا ويمكن أيضا أن يتم الكشف في كثير من الحالات. هذه التغيرات عادة ما تكون أكثر حساسية وأسهل لتحديد من قياسات مستوى البروتين. ويمكن أيضا أن يتم تقييم علامات هرمة الأخرى، بما فيها بؤر الحمض النووي من التلف المستمر النووي، ودعا شرائح DNA مع بعض التعديلات لونين تعزيز الشيخوخة (DNA-ندوب) 18، والعديد من علامات أخرى 3 و 19 و 20.
هنا، نحن تصف التقنيات الشائعة لإحداث الشيخوخة في الخلايا في الثقافة وأيضا لقياس العديد من علامات الشيخوخة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX، SAHF، والبروتين ومرنا من senesceجزيئات الامتحانات التنافسية الوطنية المصاحب.
هنا، التي وصفناها طرق تنسخي والحمض النووي الضرر الناجم عن الشيخوخة باستخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين تقنيات لقياس البروتين ومستويات مرنا من مختلف البروتينات المرتبطة الشيخوخة، فضلا عن تلطيخ لSA-β-غال ولDNA-الضرر علامة γ-H2AX. هذه الب?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة. الكتاب أود أن أشكر ميريام غوروسب وقطب عبدالمحسن بالنسبة لكثير من المناقشات المفيدة حول الشيخوخة وقطب عبدالمحسن للأيضا قراءة نقدية للمخطوطة. كما نشكر أعضاء المختبر لدينا، خاصة دوغلاس دلوزين لقراءة نقدية للمخطوطة.
16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 |