Teknikker til at fremkalde og kvantificere cellesenescens
Summary
Cellulær aldring, den irreversible tilstand af celle-cyklus arrest, kan induceres ved forskellige cellulære spændinger. Her beskriver vi protokoller til at inducere cellulær aldring og metoder til vurdering markører for senescens.
Abstract
Som reaktion på cellulær stress eller skade, kan prolifererende celler inducerer et specifikt program, der initierer en tilstand af langsigtet cellecyklus-standsning, betegnet cellulær aldring. Akkumulering af aldrende celler forekommer med organismal aldring og gennem løbende dyrkning in vitro. Aldrende celler påvirker mange biologiske processer, herunder fosterudvikling, vævsheling og regenerering, tumorsuppression, og aldring. Kendetegnende for aldrende celler indbefatter, men er ikke begrænset til, øget senescens-associerede β-galactosidaseaktivitet (SA-β-gal); p16 INK4a, p53, og p21-niveauer; højere niveauer af DNA-skade, herunder γ-H2AX; dannelsen af Ældning-associeret heterochro Foci (SAHF); og erhvervelse af et Ældning-associeret Sekretorisk Fænotype (SASP), et fænomen karakteriseret ved udskillelse af en række pro-inflammatoriske cytokiner og signalmolekyler. Her beskriver vi protokoller for både replikativ ogDNA-beskadigelse-induceret senescens i dyrkede celler. Desuden fremhæver vi teknikker til at overvåge aldrende fænotype under anvendelse af adskillige senescens-associerede markører, herunder SA-β-gal, γ-H2AX og SAHF farvning, og at kvantificere protein og mRNA-niveauer af cellecyklusregulatorer og SASP faktorer. Disse fremgangsmåder kan anvendes til vurdering af senescens i forskellige modeller og væv.
Introduction
Over et halvt århundrede siden, Hayflick og kolleger beskrev, hvordan ikke-transformerede celler formere i kultur, men kun i en begrænset periode 1. Langsigtet dyrkning af humane fibroblaster forårsaget cellerne til at stoppe prolifererende; men de var metabolisk aktiv, og dette blev kaldt cellesenescens. Senescens kan være gavnligt for inhibering tumorigenese, men det kan også være skadelig, da det menes at bidrage til tab af regenerationsevne der opstår med aldring 2, 3. Aldrende celler er blevet vist at akkumuleres i væv som mennesker alder 4 og har været impliceret i en række biologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling, vævsreparation, og aldersrelateret inflammation 2.
Kontinuerlig passage af celler i kultur inducerer replikativ senescens, som er blevet forbundetat telomer nedslidning og genomisk ustabilitet. Forskellige celle-spændinger, herunder DNA-skade og onkogener, kan også forårsage ældning 3. Senescens forårsaget af andre end telomer nedslidning faktorer kaldes ofte stress-induceret eller for tidlig ældning og afhænger generelt af p16 INK4a / Rb pathway 5. Selvom prolifererende, utransformerede celler typisk forekommer spindlen i form, kan aldrende celler identificeres som havende visse karakteristika, herunder en flad, stor morfologi og øget senescens-associerede β-galactosidaseaktivitet (SA-β-gal) (figur 1 & 2). Aldrende celler akkumulerer også DNA damage markører, herunder γ-H2AX (figur 3) 6, og potentielt senescens-associerede heterochromatin foci (SAHF) (figur 4) 7. Aldrende celler har højere niveauer af cellecyklusregulatorer, herunder p 16 (p16 INK4a) og / eller p21 og p53 (figur 5) 8, 9. Endvidere har nylige data vist, at aldrende celler kan have ikke-selvstændige virkninger ved at udskille en række pro-inflammatoriske cytokiner og chemokiner kaldes senescens-associerede sekretorisk fænotype (SASP) 10. Selvom denne SASP fænomen kan variere fra celletype til celletype, i almindelighed påvises det ved en stigning i interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), vækst- reguleret onkogen α (GRO-α), og GRO-β, blandt andre (figur 6). Den særlige stress eller skade, der inducerer senescens kan også påvirke den sekretoriske fænotype 11, 12, 13. SASP kan påvises ved måling af niveauerne af udskilte proteiner ved anvendelse ELISA'er eller cytokin / proteinarrayss = "xref"> 10, 14. Selvom posttranskriptionelle mekanismer kan regulere SASP proteinniveauer 11, 15, 16, 17, kan også detekteres ændringer i mRNA-niveauer i mange tilfælde. Disse ændringer er generelt mere følsomme og lettere at kvantificere end målinger proteinniveau. Andre aldrende markører kan også vurderes, herunder vedvarende DNA beskadigelse nuklear foci, kaldet DNA-segmenter med chromatin ændringer forstærkende senescens (DNA-SCARS) 18, og forskellige andre markører 3, 19, 20.
Her beskriver vi almindelige teknikker til induktion senescens i celler i kultur og også til måling af flere markører for senescens, herunder SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, og proteinet og mRNA af ældesnce-associerede molekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet fremgangsmåder til replikativ og DNA-ødelæggelse induceret aldring anvendelse af humane diploide fibroblaster. Desuden er teknikker til kvantificering protein og mRNA-niveauer af forskellige senescens-associerede proteiner indbefattet, samt farvning for SA-β-gal og for DNA-skade markør γ-H2AX. Disse protokoller kan i vid udstrækning anvendes til at vurdere aldrende fænotyper både in vitro og in vivo, selvom der findes mange advarsler til karakterisering senescens in vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Intramural forskningsprogram af National Institutes of Health, National Institute on Aging. Forfatterne vil gerne takke Myriam Gorospe og Kotb Abdelmohsen for mange nyttige diskussioner om ældning og Kotb Abdelmohsen til også kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også vores laboratorium medlemmer, især Douglas Dluzen til kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
References
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
- Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
- Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
- Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
- Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
- Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
- Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
- Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
- Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
- Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
- Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
- Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
- Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
- Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
- Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
- Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase–an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
- Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
- Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
- Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
- Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).
