This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
तंत्रिका तंत्र की चोट के बाद अक्षतंतु उत्थान प्राप्त करना एक चुनौती भरा काम 1 है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में अक्षतंतु उत्थान की विफलता का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं तंत्रिका चोट मॉडल की अधिकता का इस्तेमाल किया है। सीएनएस के क्षेत्रों अलग रूप में, यह अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक संरचनात्मक रूप से उचित मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। उचित मॉडल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने एक विशिष्ट चोट की गंभीरता, ब्याज की न्यूरोनल सेल प्रकार के आधार पर उपचार, और उत्थान का आकलन करने के लिए वांछित रीढ़ की हड्डी संबंधी मार्ग तैयार कर सकते हैं, के रूप में एक "एक के लिए सभी" उपचार रणनीति का विरोध किया।
रीढ़ की हड्डी की चोट, उदाहरण के लिए, सबसे दुर्बल लक्षण सनसनी और हरकत के नुकसान से स्टेम। संवेदना में कमी, आरोही संवेदी रास्ते क्षति के कारण होता है, जबकि हरकत की हानि उतरते मोटर रास्ते को नुकसान के कारण होता है है। इन tw के बीच सेलुलर और संरचनात्मक मतभेद के कारणओ रास्ते, कई लक्षित अक्षतंतु उत्थान के अध्ययन केवल तर्क यह है कि या तो के सफल वसूली रोगियों को जबरदस्त लाभ का हो जाएगा के साथ एक या अन्य मार्ग पर ध्यान केंद्रित,। इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर और संवेदी अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एक वयस्क चूहे के निचले गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में एक समवर्ती पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के साथ एक सीधा पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) इंजेक्शन का उपयोग करता है प्रस्तुत करते हैं।
डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स, इस तरह के स्पर्श सनसनी और दर्द के रूप में संवेदी जानकारी, प्रसारण सीएनएस के लिए परिधि से लिए जिम्मेदार हैं। रीढ़ की हड्डी में संवेदी न्यूरॉन्स की लंबी axonal अनुमानों लंबी दूरी की अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। इसके अलावा, के रूप में इस तरह के कम से कम कृन्तकों कल्याण जटिलताओं के साथ एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के रूप में एक संवेदी मार्ग घाव जीवित रह सकते हैं, शोधकर्ताओं सीएनएस अक्षतंतु उत्थान पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी घाव की आवश्यकता के बिना अध्ययन कर सकते हैं। एक चौगुनी सी 5 – सी 8 (ग्रीवा एलevel 5 – 8) पृष्ठीय रूट कुचलने चोट forepaw deafferentation 2 के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के लिए एक सीधा रीढ़ की हड्डी की चोट से अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए है क्योंकि यह इस तरह के glial दाग गठन के रूप में अन्य कारकों से गैर है "स्वच्छ" मॉडल उपलब्ध कराता है।
वायरल जीन थेरेपी का उपयोग एक पुनर्योजी राज्य में न्यूरॉन्स रिप्रोग्राम तेजी से कई स्नायविक स्थिति 3 के लिए एक आशाजनक उपचार रणनीति के रूप में माना गया है। अध्ययन एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) एक विकास को बढ़ावा देने के प्रोटीन की ट्रांस्जीन ले जाने व्यवहार वसूली 4, 5, 6 के साथ मजबूत अक्षतंतु उत्थान को प्राप्त कर सकते वेक्टर के आवेदन से पता चला है। एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में गैर विभाजित होने वाली कोशिकाओं, transduce करने की क्षमता eliciting में एएवी के स्पष्ट कम pathogenicity, बनानायह जीन थेरेपी के लिए इष्टतम वेक्टर। साथ ही, रीकॉम्बीनैंट एएवी प्रपत्र उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है। इस रूप में, यह, मेजबान जीनोम 7 में अपने वायरल जीनोम को एकीकृत इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस के जोखिम को कम ऐसे lentivirus के रूप में अन्य वायरल वाहक के की तुलना में में असमर्थ है। यह एएवी जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक सुरक्षित विकल्प बनाता है।
एक DRG संवेदी न्यूरॉन्स की सेल शरीर होता है, यह अध्ययन और / या संवेदी अक्षतंतु उत्थान को बढ़ावा देने के जीन थेरेपी के लिए वायरस के प्रशासन के लिए सबसे उपयुक्त संरचनात्मक लक्ष्य है। विभिन्न एएवी सीरमप्रकारों और lentivirus की तुलना एक अध्ययन में, एएवी सीरोटाइप 5 (AAV5) कम से कम 12 सप्ताह के एक समय पाठ्यक्रम पर DRG न्यूरॉन्स transducing जब डीआरजी 8 में सीधे इंजेक्ट में सबसे कुशल होना दिखाया गया था। साथ ही, एएवी, 40% से अधिक पारगमन दक्षता हासिल कर सकते हैं इस तरह के बड़े व्यास neurofilament 200 केडीए के रूप में सभी डीआरजी न्यूरोनल उपप्रकार, transducing(NF200) पॉजिटिव न्यूरॉन्स और छोटे व्यास कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP) – या isolectin B4 (IB4) पॉजिटिव न्यूरॉन्स 4, 8।
डीआरजी इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट की शल्य प्रक्रिया के रूप में बेहद आक्रामक और नाजुक है, हमें विश्वास है कि इस लेख नए उपयोगकर्ताओं एक बहुत ही कुशल तरीके से प्रक्रिया जानने के लिए मदद मिलेगी। सी 8 पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट – एक समवर्ती सी 5 के साथ सी 7 DRGs – इस अनुच्छेद में, हम वयस्क चूहों चार सप्ताह एक नियंत्रण वायरस AAV5-GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के इंजेक्शन सी 6 में के बाद से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। यह मॉडल शोधकर्ताओं जो वायरल जीन थेरेपी के उपयोग की जांच कर रहे संवेदी अक्षतंतु उत्थान को बढ़ावा देने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
इस अनुच्छेद में, हम एक वयस्क चूहे के निचले गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में एक DRG इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रस्तुत करते हैं। जैसा कि इस एक बेहद आक्?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन, चिकित्सा अनुसंधान परिषद, यूरोपीय अनुसंधान परिषद ECMneuro, और कैम्ब्रिज NHMRC जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम शूटिंग के दौरान उनके तकनीकी सहायता के लिए हेलीन मेराल वैन 'टी Spijker और जस्टिना बैरट के लिए हमारी गहरी आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम एएवी उत्पादन में सहायता के लिए डॉ एलिजाबेथ मोलोनी और प्रोफेसर जूस्ट वरहागन (तंत्रिका विज्ञान के लिए नीदरलैंड संस्थान) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |