Introduction
Bereiken axon regeneratie na zenuwstelsel letsel is een uitdagende taak 1. Het falen van axon regeneratie in het centrale zenuwstelsel (CZS) te bestuderen, hebben onderzoekers een overvloed aan zenuwbeschadiging modellen gebruikt. Als gebieden van het CNS verschillen, is het belangrijk om een anatomisch geschikt model om axon regeneratie te bestuderen. Met de juiste model kunnen onderzoekers een specifieke behandeling op basis van de ernst van de schade, de neuronale celtype en gewenste spinale kanaal ter beoordeling van regeneratie formuleren, in tegenstelling tot een "one-for-all" behandelingsstrategie.
In ruggenmergletsel, bijvoorbeeld de meest slopende symptomen voortkomen uit het verlies van gevoel en motoriek. Verlies van gevoel wordt veroorzaakt door schade aan de toenemende, sensorische paden, terwijl het verlies van beweging wordt veroorzaakt door schade aan de dalende motor paden. Als gevolg van cellulaire en anatomische verschillen tussen deze two paden, tal van gerichte axon regeneratie studies alleen gericht zijn op de ene of de andere route, met de grondgedachte dat succesvol herstel van één van enorm voordeel zou zijn voor patiënten. In dit artikel presenteren we een protocol dat rechtstreeks dorsale wortel ganglia (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortel verbrijzelingsletsel in het onderste cervicale ruggenmerg van een volwassen rat als een model voor zintuiglijke axon regeneratie studie gebruikt.
DRG sensorische neuronen verantwoordelijk zijn voor het doorgeven van sensorische informatie, zoals tactiele sensatie en pijn, van de periferie naar het centrale zenuwstelsel. De lange axonale uitsteeksels van sensorische neuronen in het ruggenmerg dienen als een goed model voor lange-afstand axon regeneratie te bestuderen. Bovendien, als knaagdieren een zintuiglijke route laesie kan overleven, zoals een dorsale wortel crush met een minimum aan welzijn complicaties, onderzoekers kunnen CNS axon regeneratie te bestuderen zonder de noodzaak om volledig laesie het ruggenmerg. Een viervoudige C5 - C8 (cervicaal level 5-8) dorsale wortel crush is aangetoond dat het een bruikbaar model voor voorpoot deafferentatie 2 zijn. Bovendien, een dorsale wortel crush verschaft een "schonere" model voor axon regeneratie te bestuderen van een directe ruggenmergletsel omdat het ongecompliceerd door andere factoren zoals gliale littekenvorming.
Het gebruik van virale gentherapie neuronen herprogrammeren in een regeneratieve toestand wordt in toenemende mate gezien als een veelbelovende behandelingsstrategie voor vele neurologische aandoeningen 3. Onderzoeken hebben de toepassing van een adeno-geassocieerd virus (AAV) vector die het transgen van een groeibevorderende eiwitten kunnen bereiken robuuste axon regeneratie met gedragsherstel 4, 5, 6 weergegeven. De schijnbare lage pathogeniciteit van AAV bij het opwekken van een immune respons en het vermogen om niet-delende cellen, zoals neuronen te transduceren, teHet optimale vector voor gentherapie. Bovendien wordt het recombinante AAV formulier voor therapie. In deze vorm is het niet in staat zijn virale genoom integreren in het gastheergenoom 7, waardoor het risico van insertie mutagenese in vergelijking met andere virale vectoren zoals lentivirussen. Dit maakt AAV een veilige keuze voor gentherapie toepassingen.
Als DRG bevat de cellichamen van sensorische neuronen, is de meest geschikte anatomische doelwit voor de toediening van virus voor gentherapie te onderzoeken en / of te bevorderen zintuiglijke axon regeneratie. In een onderzoek waarin verschillende AAV-serotypen en lentivirus, AAV serotype 5 (AAV5) bleek de meest efficiënte transductie DRG neuronen gedurende een tijdsverloop van ten minste 12 weken bij direct geïnjecteerd in de DRG 8 zijn. Bovendien kan AAV meer dan 40% transductie efficiëntie, transduceren alle DRG neuronale subtypes, zoals de grote diameter neurofilament 200 kDa(NF200) -positieve neuronen en de kleine-diameter calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) - of isolectin b4 (IB4) -positieve neuronen 4, 8.
Als de chirurgische procedure van DRG injectie en dorsale wortel te verpletteren letsel is zeer invasieve en delicaat, zijn wij van mening dat dit artikel zal helpen nieuwe gebruikers om de procedure te leren op een zeer efficiënte manier. In dit artikel tonen we representatieve resultaten uit volwassen ratten vier weken na de injectie van een controlevirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 - C7 DRG's met een gelijktijdige C5 - C8 dorsale wortel verbrijzelingsletsel. Dit model is bijzonder geschikt voor onderzoekers die onderzoeken de toepassing van virale gentherapie zintuiglijke axon regeneratie te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al de volgende dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Als niet bekend zijn met deze procedures, neem dan contact op met lokale / nationale voorschriften en deskundig advies van een dierenarts voordat u begint met het protocol.
1. Het kiezen van een geschikte stam van dieren
LET OP: Een dorsale wortel te verpletteren letsel resulteert in het verlies van gevoel en poot deafferentatie. Voorkomende bijwerkingen van voorpoot deafferentatie kunnen bestaan over-verzorging, zelfverminking en poot autotomie.
- Verkrijgen van dieren voor de procedure.
OPMERKING: Bij ratten, hoe actiever stammen, zoals Lister-Hooded en Wistar, een hogere incidentie van poot autotomie na radicotomie in vergelijking met de meer volgzaam stammen, zoals Lewis en Sprague-Dawley. Als het mogelijk is, de meest volgzame stam, Lewis, moet altijd als eerste worden beschouwd. Moet een bijzonder actieve stam die nodig is voor het experiment te wijten zijn aan genetische mIJZIGING of specifieke gedragsbeoordeling eisen, moeten veterinaire behandeling in plaats van de verwachte negatieve effecten aan te pakken.
2. voorbereiden Virus Injectie
LET OP: Behandel alle virussen in overeenstemming met de biologische en laboratorium veiligheidsvoorschriften.
- Verdunnen of concentreren van het virus met een titer van 2 x 10 12 genoomkopie (GC) / ml virus volgende afzonderlijke verpakking protocollen 9.
LET OP: Hier werd het virus verdund in Dulbecco's met fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS) met 5% sucrose. De titer kan worden geoptimaliseerd hebben afhankelijk van het soort virus promotor, construct grootte en doelceltype. - Optioneel: voeg 1% gekleurde kleurstof (bijvoorbeeld Fast Green) om het virus oplossing voor eenvoudige visualisatie van de injectie later. Meng de oplossing zachtjes.
- Bewaar de oplossing op ijs voor onmiddellijk gebruik (binnen 4 uur) of een -80 ° C vriezer gedurende lange-termijn opslag.
3. Het uitvoeren van de preoperatieve voorbereiding van de Animal
LET OP: Vanwege de extreme invasieve karakter van de ingreep, moeten aseptische technieken worden gebruikt op alle tijden.
- Bereid en steriliseren alle chirurgische instrumenten en het ruggenmerg stereotaxisch frame voor het begin van de operatie. Bijvoorbeeld steriliseren instrumenten in een autoclaaf bij 134 ° C. Gebruik een nieuwe set van gesteriliseerde instrumenten voor elk dier.
- Verdoven van het dier. Bevestigt goede verdoving door knijpen de poot te testen op de terugtrekreflex of door op de cornea van het ooglid reflex.
- Voor volwassen ratten middels inhalatie-anesthesie zoals isofluraan Gebruik 4% isofluraan in 2,0 l / min zuurstof voor inductie. Voor onderhoud gedurende de operatie, gebruik 2-3% isofluraan in 1,5 l / min zuurstof, variëren van de isofluraan concentratie overeenkomstig de ademhaling van het dier over- of onderdosering voorkomen.
- Opce het dier wordt eerst verdoofd, noteer de preoperatieve gewicht van het dier.
- Van het cervicale DRG injectie afscheren van de haren op de nek tussen de oren tot net distaal van de schouderbladen. Ontsmet de geschoren gebied met een antiseptische product.
- Injecteer 2 ml zoutoplossing subcutaan in de flank van het dier, samen met een passende dosis analgeticum (bijvoorbeeld 5 mg / kg carprofen) en antibiotica (bijvoorbeeld 5 mg / kg enrofloxacine).
- Breng oogzalf om zowel de ogen om het hoornvlies drogen tijdens de procedure te voorkomen.
- Overgaan tot een operatie aan de wervelkolom stereotaxische frame met een verwarmingselement bij 37 ° C geplaatst onder het dier.
4. Het injecteren van DRG en uitvoeren van een dorsale Root crush
OPMERKING: Dit is een uiterst delicate operatie. Het is raadzaam om eerst te oefenen op een aantal dode dieren om vertrouwd te maken met de anatomie alvorens naar dier chirurgie leven.
- LOcate de prominente C2 en T2 doornuitsteeksels over de huid. Voeg een huidincisie tussen C2 en T2 doornuitsteeksels met een scalpel no.10 (zodra de huid wordt geopend, dient een wit, vezelig weefsel middellijn zichtbaar op de eerste spierlaag zijn, de eerste spierlaag een " gelei-achtige" textuur).
- Maak een vergelijkbare grootte incisie op de eerste laag van de spier aan de witte middellijn met behulp van een scalpel. Niet verder gaan dan de prominente T2 processus spinosus, want er is een grote slagaderlijke aftakking van de afdalende aorta in de buurt daar.
OPMERKING: Zware bloeden kan overal optreden van deze stap verder. Stop altijd het bloeden en verwijder het bloed met behulp van gesteriliseerde wattenstaafjes of chirurgische absorbeerbare sponzen aan duidelijke visualisatie te allen tijde mogelijk te maken. Verloopt de procedure "blind" kan leiden tot ongewenste beschadiging van het ruggenmerg, DRG of dorsale wortel, wat leidt tot onverwachte bijwerkingen bij het dier later. - Trek deeerste spierlaag gebruik van twee oprolmechanismen één geplaatste rostraal en caudaal één; de tweede spierlaag, met een gegroefd uiterlijk zichtbaar moet zijn.
- Plaats de middellijn van het tweede spierlaag (waar twee longitudinale spieren worden waargenomen verbonden door een dunne, vliezige weefsel). Ontleden de membraneuze weefsel met behulp van een paar microscissors de twee longitudinale spieren scheiden. Gebruik geen scalpel indien mogelijk, omdat dit kan leiden tot onnodige schade spieren bloeden.
- Pas de oprolmechanismen dienovereenkomstig de derde laag van dunne spieren die de ruggengraat bloot. Doornuitsteeksels voelbaar door licht aanraken met een pincet in de derde spierlaag.
- Voeg een kleine insnijding op de derde spierlaag gebruik microscissors en voorzichtig schrapen van de spieren van het bot met behulp van een scalpel curette of een zijdelingse wijze duidelijk bloot wervels. Indien nodig, knip een deel van de spieren of pezen weg naar de Lami makennectomy gemakkelijker.
- Links bloot C5 - C8 DRG Voer een linker hemi-laminectomie op C4 - T1 wervels door voorzichtig een deel van de lamina en het verwijderen pedikel via een paar fijne rongeurs. DRG is gelegen nabij het dwarse foramen van de wervels.
OPMERKING: C3 - C7 wervels hebben geen prominente processus spinosus. De C5 DRG ligt tussen C4 en C5 wervels, de C6 DRG tussen de C5 en C6 wervels, enzovoort, terwijl de C8 DRG ligt tussen C7 en T1 wervels. Er is geen C8 wervel, ondanks de aanwezigheid van een C8 DRG en C8 ruggenmerg segment. - Zodra genoeg DRG is blootgesteld voor injectie, bereid door het plaatsen van de spuit het virus gevulde microliter injectiespuit voorzien van een op maat gemaakte, 33-gauge stompe naald op de stereotaxische spuithouder. Vóór injectie gebruikt een 30-gauge naald afgeschuind om een kleine oppervlakkige opening aan elke gerichte DRG maken om te helpen bij het inbrengen van de injectienaald.
- Plaats de 33-gauge naald in het midden van de DRG door de knoppen voorzichtig naar stereotaxische coördinaten passen. Niet overdreven steek de naald, omdat dit kan leiden vloeistof lekken uit de ventrale zijde van de DRG. Eventuele lekkage onmiddellijk pas de positie van de naald.
OPMERKING: De numerieke stereotaxische coördinaten worden niet gebruikt; echter, is het nuttig om het frame gebruiken om de naald vast te houden voor injectie. - Injecteer 1 ul van het virus in elke DRG 0.2 uL / min met behulp van een infusie spuitpomp. Wacht eens drie minuten voordat de naald terugtrekken. Tijdens de injectie zal de DRG langzaam van kleur veranderen als het virus oplossing bevat een gekleurde kleurstof.
- Een gelijktijdige C5 voeren - C8 achterwortelganglia crush crush elke wortel drie keer gedurende 10 s elk een paar fijne punt pincet (Bonn Micro), tegenover de uiteinden van de tang volledig; een witte lijn in het weefsel moet worden weergegeven op de crush website. Niet dieper te gaan dan nodig is met het krachteeps, omdat dit schade aan de ventrale oorzaak.
- Na de injectie en / of pletten, zorg ervoor dat er geen bloeden of kleine stukjes botfragmenten linksaf bij de incisie site voordat het afsluiten van het dier. Indien gewenst, plaats een klein stukje chirurgische absorbeerbare spons bovenop het blootgestelde ruggenmerg en DRG.
- Kan de derde laag van de spier terug trekken van nature op de rug zonder hechten. Losjes hechten de twee longitudinale spieren aan de tweede laag (≈ 3 onderbroken hechtingen) met 6-0 absorbeerbaar hechtmateriaal. Hechtdraad de eerste spierlaag (≈ 5 onderbroken hechtingen) met 6-0 absorbeerbaar hechtmateriaal.
- Suture de huid met absorbeerbare 5-0 hechtmateriaal (≈ 10 onderbroken hechtingen).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de hechtingen niet te strak. Bolling van de huid is een teken van overmatige aanhalen en leidt tot ongemak voor het dier. - Indien tijdens de operatie zware bloeden plaatsgevonden, subcutaan injecteren 1-2ml zoutoplossing om het vochtverlies te vullen uit het dier toegestaan volgens lokale regelgeving.
- Bieden eetbare hydraterende gel en laat het dier volledig herstellen van de verdoving, uitvoerende regelmatige controle gedurende ten minste 1 uur, voordat de dieren naar de verzamelplaats.
- Houd het dier gedurende ten minste 3 weken voor een optimale transgenexpressie zintuiglijke axon regeneratie te beoordelen.
5. Het uitvoeren van postoperatieve zorg van de Animal
- Zorgen voor voedsel puree en zachte katoenen beddengoed voor het dier tijdens de eerste week na de operatie. Indien nodig, beheren extra doses pijnstillende en antibiotica om te helpen met het herstel in overeenstemming met de lokale / nationale voorschriften en veterinair advies.
- Verwijder de hechtingen op de huid na 7-10 dagen.
OPMERKING: voorkomende bijwerkingen van de ingreep onder meer de vorming van seroom of hematoom op de incisie site, krassen op de huid als gevolg van de jeuk veroorzaakt doorde interne absorbeerbare hechtingen, subtiele zintuiglijke of motoriek tekorten, en tekenen van zelfverminking op de deafferented poot na de dorsale wortel te verpletteren letsel. Voor eventuele welzijnsproblemen die in wezen ernstiger dan verwacht, onmiddellijk advies van de dierenarts.
6. Het uitvoeren van een anterograde CTB Injection axonen Tracing
LET OP: Het is aanbevolen om cholera toxine B subeenheid (CTB) axonale het traceren van een week voorafgaand aan het weefsel collectie uit te voeren.
- Bereid 1% CTB oplossing volgens instructies van de fabrikant.
- Optioneel: voeg 1% gekleurde kleurstof aan de oplossing voor eenvoudige visualisatie van de injectie later. Meng de oplossing zachtjes.
- Verdoven het dier (zie stap 3.2.1) en stabiliseren de linker voorpoot door taping de poot op de tafel.
- Handmatig en langzaam injecteren 1 pi van 1% CTB subcutaan in het midden van de voetzool onbehaarde en vier cijfers van een microliter injectiespuit voorzien with een op maat gemaakte, 33-gauge korte naald.
OPMERKING: Voordat injectie, helpt het om eerst een 30-gauge schuine naald te gebruiken om een kleine oppervlakkige opening op de huid, die helpt met het inbrengen van de injectienaald te maken. - Laat het dier om volledig te herstellen van de anesthesie alvorens terug te keren het dier naar de wachtruimte.
7. Weefsel Verzamelen
- Het virus geïnjecteerde DRG en ruggenmerg immunohistochemie verzamelen, bestuurt een overdosis verdovingsmiddel en transcardially perfuseren het dier met fosfaat gebufferde zoutoplossing gevolgd door koude 4% paraformaldehyde. voeren voorzichtig een volledige laminectomie op de rug op het vaste weefsel te verzamelen onder een microscoop. Doorgaan met weefsel voorbereiding, snijden en verwerken zoals vereist voor analyse 4, 5, 6.
Opmerking: Het gewonnen incisie moet duidelijk zijn, zoals waargenomen door de aanwezigheid van Bauto weefsel. - Als alternatief voor de virus geïnjecteerde DRG in vitro kweek te verzamelen, offeren het dier humaan met een goedgekeurde methode, zoals een toenemende concentratie kooldioxide. Zorgvuldig ontleden de DRG onder een microscoop, zorgen voor aseptische omstandigheden waar mogelijk. Doorgaan met weefselkweek wens 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als representatie wordt een transversale ruggenmerg deel met de bijgevoegde DRG voorgelegd aan de effectiviteit van dit protocol direct in de C7 tonen transduceren DRG neuronen en tracing sensorische neuronen van het ruggenmerg vier weken na het injecteren van een controlevirus, AAV5-GFP, DRG zonder dorsale wortel crush (Figuur 1A). Neuronen van zowel de dorsale kolom en de dorsale hoorn van het ruggenmerg GFP expressie (Figuur 1B), en de cellichamen en axonen binnen de geïnjecteerde DRG (figuur 1C). Aanvullende anatomische analyse van de cuneatus nucleus, de zintuiglijke axon terminal in de hersenstam, onthult positieve anterograde tracering CTB (figuur 1D).
Wanneer de DRG injectie wordt uitgevoerd gelijktijdig met een volledige C5-C8 achterwortelganglia crush, no GFP-positieve neuronen in het ruggenmerg of CTB-pluspoolTussen de cuneatus nucleus worden waargenomen (Figuur 2A). Het is echter opgemerkt dat geaxotomiseerde sensorische axons nog kunnen regenereren tot aan de dorsale wortel ingangszone in een volledig verpletterd dorsale wortel, wat een PNS omgeving, maar niet verder in het ruggenmerg 4, 5 (figuur 2A). Indien de geïnjecteerde virus omvat het transgen een mogelijk groeibevorderende eiwitten, kan de aanwezigheid van gemerkte neuronen in het ruggenmerg hetzij regeneratie of onvolledige dorsale wortel crush (figuur 2B) te vertegenwoordigen. Onderscheid te maken tussen deze twee mogelijkheden, moet CTB axonale tracering in de nucleus cuneatus geanalyseerd. De aanwezigheid van CTB-positieve terminals in de nucleus cuneatus benadrukt de waarschijnlijkheid van een onvolledige verwonding (figuur 2C), terwijl de afwezigheid van CTB-Pluspolen suggereert gedeeltelijke regeneratie in het ruggenmerg, geregenereerde axonenwaarschijnlijk niet de hele afstand tot de cuneatus nucleus (figuur 2D) te bereiken groeien. Tot op heden succesvol zintuiglijke axon regeneratie cuneatus de kern veelal toegepast in gevallen met een hoge cervicale letsel 11, 12 of de toepassing van neurotrofinen 13, 14. Elke dieren tekenen van onvolledige letsel moet worden uitgesloten van axon regeneratie studies.
Figuur 1: DRG Injection Zonder de dorsale wortel Crush Injury. (AC) Ruggenmerg doorsnede GFP-positieve neuronen in het ruggenmerg (A), waaronder de dorsale kolom dorsale hoorn (B) en cellichamen in de DRG (C) vier weken na de injectie van AAV5-GFP. <strong> (D) CTB-positieve zintuiglijke axon terminals in de cuneatus nucleus één week na CTB injectie. De schaalbalk 650 urn (AC) en 250 urn (D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Het beoordelen van de dorsale wortel Crush letsel en Axon Regeneration. (A) Een volledige dorsale wortel verbrijzelingsletsel leidt niet gelabelde neuronen van het ruggenmerg of CTB-positieve axon terminals in de cuneatus nucleus. Geaxotomiseerde sensorische axons kan regenereren de dorsale wortel ingangszone, maar niet voorbij in het ruggenmerg. (BD) de aanwezigheid van gemerkte neuronen in het ruggenmerg vertegenwoordigt incompleet letsel of Regeneratieon (B). Met aanvullende analyse, de aanwezigheid van CTB-positieve terminals in de nucleus cuneatus suggereert onvolledige schade (C), terwijl de afwezigheid suggereert volledige schade en eventueel gedeeltelijke regeneratie in het ruggenmerg (D). De schaalbalk is 250 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel geven we een stap-voor-stap een DRG injectie en dorsale wortel verbrijzelingsletsel voeren in de onderste cervicale ruggenmerg van een volwassen rat. Aangezien dit is een zeer invasieve en delicate operatie, we raden alle potentiële gebruikers voldoende opleiding en de praktijk te verkrijgen alvorens naar dier chirurgie leven. De gebruikers moeten vertrouwd zijn, niet alleen met het ruggenmerg anatomie, maar ook met de omliggende spieren, wervel botstructuur en vaatstelsel zijn. Idealiter zou een bevoegde gebruiker zich de procedure met minimale schade uitvoeren om de omringende weefsels, het uitvoeren van een schone laminectomie door een deel van de wervels verwijderen zonder het induceren schade aan het ruggenmerg. Zoals blijkt uit ruggenmergletsel, kan een kleine beschadiging in het ruggenmerg wijdverspreid schadelijk effect op het gehele zenuwstelsel. Bij dieren die een "schone" operatie hebben ondergaan hebben minder kans op last van onverwachte post-operatieve complicaties welzijnissues en zijn daarom minder waarschijnlijk voor de gewenste experimentele tijdstip worden opgeofferd hebben.
Virus dienen in het zenuwstelsel, zijn er enkele mogelijke toedieningswegen: 15 intraveneus, intraperitoneaal 16, intrathecale 17 of directe injectie in het doel 4, 8. Hoewel intraveneuze en intraperitoneale injecties zijn relatief niet-invasieve, kan de overschrijding van de bloed-hersenbarrière probleem 18, en routes leiden tot niet-specifieke transductie, die niet bruikbaar in een gespecialiseerde axon regeneratie onderzoek zou zijn. Ook voor intrathecale injectie in de subarachnoïdale ruimte, een invasieve administratieve route vele neuronale en niet-neuronale celtypen in het CZS kan worden getransduceerd, mogelijk genereren van niet-specifieke of off-Target effecten. Zo is de directe injectie van virus in de DRG een gunstige optie en waarschijnlijk resulteren in een veel hogere transductie-efficiëntie dan andere methoden. Het grote nadeel van deze optie is echter de invasiviteit van de chirurgische procedure, die gespecialiseerde opleiding vereist.
Zodra gebruikers de vereiste chirurgische vaardigheden onder de knie hebt, is dit protocol biedt een grote mate van flexibiliteit. In een axon regeneratie studie kunnen dieren worden onderzocht in combinatie met andere technieken, zoals in vivo elektrofysiologie en sensorische-motorische gedragstesten, terwijl de verzamelde weefsels kunnen worden gebruikt voor anatomische analyse of weefselkweek 4. Een combinatie van deze technieken, met verschillende experimentele tijdstippen, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om de voortgang van degeneratie of regeneratie van andere vezels subtypes, zoals NF200, CGRP en IB4 na verbrijzelingsletsel 4 bestuderen. Afhankelijk van de experimentele requiremegen, een of de andere van de gepresenteerde procedures kan alleen worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld kan DRG injectie alleen worden gebruikt voor axonale tracing experimenten, terwijl dorsale wortel crush alleen kan worden gebruikt in studies waarbij voorpoot deafferentatie vereist. Bovendien kunnen gebruikers ook variëren het type virus- en transgenproduct voor injectie, exact DRG te injecteren, en de exacte dorsale wortel op letsel. Eventueel kan celtransplantatie of farmacologische toediening in de DRG ook uitvoeren met dit protocol. Voortbouwend op verworven chirurgische vaardigheden, kan een ervaren gebruiker gaan naar andere technieken zoals DRG injectie in de lumbale regio - 19 of dorsale kolom crush (bijvoorbeeld in L3 L5 naar achterbeen functie getest), verdere studie ruggenmerg functie 5.
Kortom, wij geloven dat de DRG injectie en dorsale wortel crush tot een bruikbaar model voor zintuiglijke axon reg te bestuderenENERATIE. Ondanks de behoefte aan gespecialiseerde opleiding aan de invasieve chirurgische procedure uit te voeren, het protocol is flexibel, en potentiële gebruikers kunnen veel onderdelen passen aan hun experimentele eisen tegemoet te komen. Deze procedures kunnen dienen als basis voor de in search of een geschikt diermodel voor zintuiglijke axon regeneratie studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Christopher Reeve Foundation en Dana, de Medical Research Council, de European Research Council ECMneuro, en de Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Wij willen graag onze diepste dank aan Heleen Merel van 't Spijker en Justyna Barratt uitspreken voor hun technische assistentie tijdens het filmen. We willen graag Dr Elizabeth Moloney en professor Joost Verhaagen (Nederland Instituut voor Neurowetenschappen) om te helpen bij AAV-productie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
