Dorsalrotganglion Injeksjon og rygg Root knusningsskade som en modell for Sensory Axon Regeneration

Summary

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Abstract

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

Introduction

Oppnå axon regenerering etter skade nervesystemet er en utfordrende oppgave ^1. For å studere svikt av axon regenerering i sentralnervesystemet (CNS), har forskere benyttet en mengde av nerveskade modeller. Som regioner av CNS variere, er det viktig å benytte en anatomisk hensiktsmessig modell for å studere axon regenerering. Ved å bruke den aktuelle modellen, kan forskere formulere en spesifikk behandling basert på alvorligheten av skaden, den neuronale celletype av interesse, og den ønskede spinalkanalen for å vurdere regenerering, i motsetning til en "en-til-all" behandlingsstrategi.

I ryggmargsskade, for eksempel de mest ødeleggende symptomer stammer fra tap av følelse og bevegelse. Tap av følelse er forårsaket av skade på stigende sensoriske baner, mens tap av bevegelse er forårsaket av skade på synkende motorveier. På grunn av mobilnettet og anatomiske forskjeller mellom disse two trasé, mange målrettede axon restitusjon studier bare fokusere på den ene eller den annen vei, med den begrunnelse at en vellykket gjenoppretting av enten ville være en stor fordel for pasientene. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll som bruker en direkte dorsalrotganglia (DRG) injeksjon med en viral vektor, og en samtidig dorsal rot knuseskade i det nedre cervikal ryggmargen til en voksen rotte som modell for å studere sensorisk axon regenerering.

DRG-sensoriske neuroner er ansvarlig for videresending sensorisk informasjon, slik som taktile følelse og smerte, fra periferien til CNS. De lange aksonal projeksjoner av sensoriske nevroner i ryggmargen tjene som en god modell for å studere langdistanse axon regenerering. I tillegg, som gnagere kan overleve en sensorisk sti lesjon, slik som en dorsal root knuseskade med minimale velferd komplikasjoner, kan forskere studere CNS axon regenerering uten behov for fullstendig lesjon på ryggmargen. En firedoble C5 – C8 (cervical level 5. – 8.) dorsal root knuseskade har vist seg å være en nyttig modell for forpoten deafferentation ^2. I tillegg kan en dorsal root knuseskade gir en "renere" modell for å studere axon regenerering enn en direkte ryggmargsskade, fordi det er ukomplisert av andre faktorer, slik som glial arrdannelse.

Bruken av viral genterapi å omprogrammere neuroner inn i en regenererende tilstand har i økende grad betraktet som en lovende behandlingsstrategi for mange nevrologiske tilstander ^3. Studier har vist at anvendelsen av en adenoassosiert virus (AAV) vektor som bærer transgenet av en vekstfremmende protein kan oppnå robust axon regenerering med atferdsmessige utvinning ^{4, 5, 6.} Den tilsynelatende lav patogenitet AAV i å fremkalle en immunrespons, og evnen til å transdusere ikke-delende celler, såsom neuroner, gjørdet den optimale vektor for genterapi. I tillegg anvendes den rekombinante AAV form for terapi. I denne formen, er det ute av stand til å integrere dens virusgenomet i vertsgenomet ^7, som reduserer risikoen for innskuddsmutagenese i forhold til andre virale vektorer, slik som lentivirus. Dette gjør AAV et trygt valg for genterapianvendelser.

Som en DRG inneholder cellelegemer av sensoriske neuroner, er den mest passende anatomisk mål for administrering av virus for genterapi for å studere og / eller fremme sensorisk axon regenerering. I en studie som sammenligner forskjellige serotyper av AAV og lentivirus, ble AAV serotype 5 (AAV5) vist seg å være den mest effektive i overførende DRG-neuroner i løpet av et tidsforløp på minst 12 uker, når de injiseres direkte inn i den DRG ^8. I tillegg kan AAV oppnå mer enn 40% effektivitet transduksjon, transdusering av alle DRG-neuronal undertyper, slik som med stor diameter, neurofilament 200 kDa(NF200) -positive nevroner og liten diameter calcitonin-gen-relatert peptid (CGRP) – eller b4 isolectin (IB4) -positive neuroner ^{4, 8.}

Som den kirurgiske prosedyren av DRG injeksjon og dorsal root knusningsskade er svært invasiv og delikat, tror vi at denne artikkelen vil hjelpe nye brukere til å lære prosedyren på en svært effektiv måte. I denne artikkelen, viser vi representative resultater fra voksne rotter fire uker etter injeksjon av en kontrollvirus AAV5-GFP (grønt fluorescerende protein) til C6 – C7 DRG med en samtidig C5 – C8 dorsale knuseskade. Denne modellen er spesielt egnet for forskere som undersøker bruk av viral genterapi for å fremme sensorisk axon regenerering.

Protocol

Alle de følgende dyr prosedyrer ble utført i samsvar med Storbritannia Dyr (Scientific Procedures) Act 1986. Hvis ukjent med disse prosedyrene, må du sjekke med lokale / nasjonale bestemmelser og kontakt veterinær råd før du starter protokollen. 1. Valg av et egnet Strain of Animals MERK: En rygg root knusningsskade resulterer i tap av følelse og pote deafferentation. Vanlige bivirkninger av forpoten deafferentation kan inkludere over-grooming, selvskading, og pote autotomy. </p…

Representative Results

Som en illustrasjon, er en tverrgående ryggmargen seksjon med den vedlagte DRG presentert for å vise effektiviteten av denne protokollen i transdusering av DRG-neuroner og sporing sensoriske axoner i ryggmargen fire uker etter injisering av en kontrollvirus, AAV5-GFP, direkte inn i C7 DRG uten en dorsal root knuseskade (figur 1A). Aksoner i både dorsale kolonnen og dorsalhornet i ryggmargen uttrykker GFP (figur 1B), samt cellelegemene og aksoner i den…

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi en trinn-for-trinn-guide for å utføre en DRG-injeksjon og de dorsale knuseskade i det nedre cervikal ryggmargen til en voksen rotte. Ettersom dette er en svært invasiv og delikat operasjon, anbefaler vi på det sterkeste at alle potensielle brukere får tilstrekkelig opplæring og praksis før fremmarsj å leve dyr operasjon. Brukerne bør være kjent ikke bare med ryggmargs anatomi, men også med de omliggende muskler, ryggvirvel benbygning og blodkar. Ideelt sett, burde en dyktig b…

Materials

Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%
Cholera Toxin B subunit	List Biological Laboratories	104	For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%
IsoFlo	Zoetis	115095	Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)
Baytril 2.5% injectable	Bayer	05032756093017	Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg
Carprieve 5.0% w/v	Norbrook	02000/4229	Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg
Lacri-Lube	Allergan	PL 00426/0041	Eye ointment
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn Micro Forceps	Fine Science Tools	FST 11083-07	For performing dorsal root crush injury
Tissue Separating Scissors	Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (straight)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Ethicon	1972	For bleeding control
Microliter Syringe RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Custom-made Removable Needle (for DRG injection)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, point style 3
Custom-made Removable Needle (for CTB injection)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 10 mm, point style 3
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments	UMP3-1