Introduction
Alcançar axônio regeneração após lesão do sistema nervoso é uma tarefa desafiadora 1. Para estudar o fracasso da regeneração axonal no sistema nervoso central (CNS), os pesquisadores usaram uma infinidade de modelos de lesão do nervo. Como regiões do SNC diferentes, é importante o uso de um modelo anatomicamente apropriado para estudar a regeneração de axónios. Usando o modelo apropriado, os investigadores podem formular um tratamento específico com base na gravidade da lesão, o tipo de célula neuronal de interesse, e do tracto espinal desejado para avaliar a regeneração, em oposição a uma estratégia de tratamento "um-para-todos".
Na lesão medular, por exemplo, os sintomas mais debilitantes decorrem da perda de sensação e locomoção. Perda de sensibilidade é causada por danos aos ascendentes vias sensoriais, enquanto a perda de locomoção é causada por danos às vias motoras descendentes. Devido às diferenças celulares e anatômicas entre estes twO caminhos, muitos estudos de regeneração do axônio alvo se concentrar apenas em um ou outro caminho, com a justificativa de que a recuperação bem sucedida de qualquer um seria de grande benefício para os pacientes. Neste artigo, apresenta-se um protocolo que utiliza uma injecção directa dos gânglios da raiz dorsal (DRG) com um vector viral e uma lesão concomitante esmagamento da raiz dorsal da medula espinhal cervical inferior de um rato adulto como um modelo para estudar a regeneração axonal sensorial.
DRG neurónios sensoriais são responsáveis pela transmissão de informação sensorial, tais como sensação táctil e dor, desde a periferia até ao sistema nervoso central. As projecções longas axonal de neurónios sensoriais na medula espinal servem como um bom modelo para o estudo de longa distância a regeneração de axónios. Além disso, como os roedores pode sobreviver a uma lesão via sensorial tal como uma lesão por esmagamento da raiz dorsal com complicações mínimas de bem-estar, os investigadores podem estudar a regeneração de axónios do SNC, sem a necessidade da lesão completamente a medula espinhal. Um C5 quádruplo - C8 (l cervicalível 5-8) dorsal lesão por esmagamento raiz tem sido mostrado a ser um modelo útil para a pata dianteira desaferentação 2. Além disso, uma lesão por esmagamento dorsal raiz fornece um modelo mais "limpo" para estudar a regeneração de axónios de uma lesão da medula espinal directa porque não é complicada por outros factores, tais como a formação de cicatriz glial.
O uso da terapia de genes virais para reprogramar neurónios num estado regenerativa tem sido cada vez mais considerado como uma estratégia de tratamento promissor para muitas condições neurológicas 3. Estudos têm demonstrado a aplicação de um vector de vírus adeno-associado (AAV) transportando o transgene de uma proteína que promove o crescimento podem atingir robusto regeneração axónio com recuperação comportamental 4, 5, 6. A baixa patogenicidade aparente de AAV na indução de uma resposta imunológica e a capacidade de transduzir células que não se dividem, tais como os neurónios, fazerque o vector óptimo para a terapia genética. Além disso, a forma de AAV recombinante é utilizado para a terapia. Nesta forma, é incapaz de integrar o seu genoma viral no genoma do hospedeiro 7, reduzindo o risco de mutagénese de inserção em comparação com outros vectores virais, tais como lentivírus. Isso faz com que o AAV um cofre escolha para aplicações de terapia génica.
Como DRG contém os corpos celulares de neurónios sensoriais, é o alvo anatómica mais apropriado para a administração de vírus para a terapia de gene para o estudo e / ou promover a regeneração axonal sensorial. Num estudo comparativo de diferentes serotipos de AAV e lentivírus, AAV de serotipo 5 (AAV5) mostrou-se o mais eficiente na transdução neurios DRG ao longo de um curso de tempo de pelo menos 12 semanas quando injectado directamente no DRG 8. Além disso, o AAV pode atingir mais de 40% de eficiência de transdução, transduzir todos os subtipos neuronais de DRG, tais como a de grande diâmetro de neurofilamentos de 200 kDa(NF200) neurónios -positivas e o péptido relacionado com o gene da calcitonina de pequeno diâmetro (CGRP) - ou b4 isolectina (IB4) neurónios -positivas 4, 8.
Como o procedimento cirúrgico de DRG injeção e lesão por esmagamento da raiz dorsal é extremamente invasiva e delicada, acreditamos que este artigo vai ajudar novos usuários a aprender o procedimento de forma muito eficiente. Neste artigo, que mostra resultados representativos de ratos adultos quatro semanas após a injecção de um vus de controlo AAV5-GFP (proteína fluorescente verde) em C6 - DRGs C7 com um concomitante C5 - C8 raiz dorsal lesão por esmagamento. Este modelo é especialmente adequado para os investigadores que estão a investigar a utilização de terapia de genes virais para promover a regeneração axonal sensorial.
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Protocol
Todos os seguintes procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Unido Animais Unidos (Scientific Procedures) Act 1986. Se não familiarizados com estes procedimentos, por favor, verifique com os regulamentos locais / nacionais e procurar orientação de um veterinário antes de iniciar o protocolo.
1. Escolhendo uma estirpe adequada de Animais
NOTA: A raiz dorsal lesão por esmagamento resulta na perda de sensação e pata deafferentation. Os efeitos adversos comuns de deafferentation forepaw pode incluir excesso de preparação, auto-mutilação e autotomy pata.
- Obter animais para o procedimento.
NOTA: Para os ratos, as estirpes mais activas, tais como Lister-Capuz e Wistar, têm uma maior incidência de autotomia pata após desaferentação, em comparação com as estirpes mais dóceis, tais como Lewis e Sprague-Dawley. Se possível, a estirpe mais dócil, Lewis, deve ser sempre considerada em primeiro lugar. No caso de uma estirpe particularmente activo ser necessário para a expericia devido ao m genéticaODIFICAÇÃO ou requisitos específicos de avaliação comportamental, tratamento veterinário deve estar no local para lidar com os efeitos adversos esperados.
2. Preparar o Virus for Injection
CUIDADO: Manusear todos os vírus, de acordo com as normas biológicas e laboratoriais de segurança.
- Diluir ou concentrar-se o vírus a um título de 2 x 10 cópia 12 genoma (GC) / mL seguinte vírus indivíduo protocolos de embalagem 9.
NOTA: Aqui, o vírus foi diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) com 5% de sacarose. O tulo pode ter de ser optimizada, dependendo do tipo de vírus, promotor, construir tamanho e tipo de célula alvo. - Opcional: adicione 1% de corante de cor (por exemplo, Fast Green) para a solução de vírus para fácil visualização da injeção mais tarde. Misturar a solução muito suavemente.
- Manter a solução em gelo para uso imediato (no prazo de 4 horas) ou em um congelador de -80 ° C para a longoarmazenagem a longo prazo.
3. Realizar a preparação pré-operatória do animal
NOTA: Devido à invasão extrema da cirurgia, técnicas de assepsia deve ser usado em todos os momentos.
- Preparar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e a estrutura estereotáxica espinal antes de iniciar a cirurgia. Por exemplo, as ferramentas de esterilizar em autoclave a 134 ° C. Use um novo conjunto de ferramentas esterilizadas para cada animal.
- Anestesiar o animal. Confirmar anesthetization adequada por beliscar a pata para testar o reflexo de retirada ou tocando a córnea para o reflexo das pálpebras.
- Para ratos adultos, utilizando anestesia por inalao de isoflurano, tais como, utilizar 4% de isoflurano em 2,0 L / min de oxigénio para a indução. Para a manutenção durante toda a cirurgia, utilizar 2-3% de isoflurano em 1,5 L / min de oxigénio, variando a concentração de isoflurano de acordo com o padrão de respiração do animal a fim de evitar dosagem sub-super ou.
- Emce o animal é inicialmente anestesiados, registrar o peso pré-operatória do animal.
- Para a injecção de DRG cervical, raspar a pele no pescoço de entre os ouvidos para apenas distai para as escápulas. Desinfectar a área raspada com um produto anti-séptico.
- Injectar 2 mL de soro fisiológico por via subcutânea no flanco do animal, ao longo com uma dose apropriada de analgésico (por exemplo, 5 mg / kg carprofeno) e antibiótico (por exemplo, 5 mg / kg de enrofloxacina).
- Aplicar pomada para ambos os olhos para evitar a secagem da córnea durante o procedimento.
- Continuar a cirurgia em uma estrutura estereotáxica espinal com uma almofada de aquecimento a 37 ° C, colocado debaixo do animal.
4. Injetar DRG e Execução de uma lesão por esmagamento da raiz dorsal
NOTA: Esta é uma cirurgia extremamente delicada. É aconselhável praticar em alguns animais mortos primeiro a se familiarizar com a anatomia antes de avançar para viver a cirurgia animal.
- euOcate os processos espinhosos C2 e T2 proeminentes sobre a pele. Fazer uma incisão na pele entre as C2 e T2 processos espinhosos com uma lâmina de bisturi no.10 (uma vez que a pele é aberta, uma linha média, fibroso de tecido branco deve ser visível sobre a primeira camada de músculo, a primeira camada de músculo tem um " gelatinosa" textura).
- Fazer uma incisão de tamanho similar sobre a primeira camada de músculo ao longo da linha média branco, utilizando uma lâmina de bisturi. Não vá além do processo espinhoso T2 proeminente, como há um ramo arterial principal da aorta descendente localizado perto de lá.
NOTA: sangramento pesado pode ocorrer em qualquer lugar a partir desta etapa em diante. Sempre parar o sangramento e remover o sangue usando cotonetes esterilizados ou esponjas absorvíveis cirúrgicos para permitir a visualização clara em todos os momentos. Prosseguindo com o procedimento "cegamente" podem resultar em dano indesejável para a medula espinhal, DRG, ou raiz dorsal, levando a efeitos adversos inesperados no animal mais tarde. - retrair oprimeira camada de músculo usando dois afastadores, uma colocados rostral e um caudal; a segunda camada de músculo, com uma aparência estriada, deve ser visível.
- Localizar a linha média da segunda camada de músculo (onde dois músculos longitudinais pode ser observada ligada por um tecido fino, membranosa). Dissecar o tecido membranoso usando um par de microtesouras para separar os dois músculos longitudinais. Evitar o uso de uma lâmina de bisturi, se possível, pois isso pode resultar em lesão muscular desnecessária e sangramento.
- Ajustar os afastadores em conformidade para expor a terceira camada de músculo fino que cobre a lombada. Os processos espinhosos pode ser sentida por tocar levemente com um par de pinças sobre a terceira camada de músculo.
- Fazer uma pequena incisão na terceira camada de músculo usando microtesouras e suavemente raspar o músculo do osso utilizando uma cureta ou um bisturi de forma a expor costado claramente as vértebras. Se necessário, cortar um pouco do músculo ou tendão afastado para fazer o Laminectomy mais fácil.
- Para expor a C5 esquerda - DRGs C8, executar um hemi-laminectomia esquerda no C4 - vértebras T1 removendo cuidadosamente parte da lâmina e pedículo usando um par de fórceps finos. O DRG está localizado perto do forame transversal das vértebras.
NOTA: C3 - C7 vértebras não tem um processo espinhoso proeminente. O C5 DRG está localizado entre a C4 e C5 vértebras, o C6 DRG é entre C5 e C6 vértebras, e assim por diante, enquanto o C8 DRG é entre C7 e T1 vértebras. Não há vértebra C8, apesar da presença de um DRG C8 e um segmento espinal medula C8. - Uma vez suficiente do DRG foi exposta para injecção, preparar a seringa através da colocação da seringa cheia microlitro de vírus equipado com uma agulha 33 de calibre sem corte feito por medida para o suporte de seringa estereotáxico. Antes da injecção, usar uma agulha biselada de calibre 30 para efectuar uma pequena abertura superficial em cada um dos DRG alvo para auxiliar a inserção da agulha de injecção.
- Inserir o 33-gAuge agulha no centro do DRG, rodando os manípulos suavemente para ajustar as coordenadas estereotáxicas. Não excesso de inserir a agulha, uma vez que pode obrigar o fluido para vazar para fora a partir do lado ventral do DRG. Caso ocorra fuga, ajustar a posição da agulha imediatamente.
NOTA: As coordenadas estereotáxicas numéricos não são utilizados; no entanto, é útil utilizar a moldura para segurar a agulha para injecção. - Injectar 1 ul do vírus em cada DRG em 0,2 mL / min utilizando uma bomba de infusão de seringa. Esperar por um período adicional de três minutos antes de se retirar a agulha. Durante a injecção, o DRG irá alterar-se lentamente cor se a solução de vírus contém um corante de cor.
- Para efectuar uma concomitante C5 - C8 lesão por esmagamento da raiz dorsal, raiz esmagar cada três vezes durante 10 s cada um usando um par de fórceps de ponta fina (Bona Micro), opostas às extremidades das pinças completamente; uma linha branca no tecido deve aparecer no local do esmagamento. Não ir mais fundo do que o necessário com o forceps, pois isso pode causar danos à raiz ventral.
- Após a injeção e / ou queda, certifique-se de que não há sangramento ou pequenos pedaços de fragmentos de ossos deixados no local da incisão antes de fechar o animal. Se preferido, coloque um pequeno pedaço de esponja absorvível cirúrgico no topo da medula espinal expostos e DRG.
- Permitir que a terceira camada de músculo para retrair volta naturalmente para a coluna vertebral, sem sutura. Frouxamente suturar os dois músculos longitudinais sobre a segunda camada (3 ≈ suturas interrompidas) com material de sutura absorvível 6-0. Suturar a primeira camada de músculo (≈ 5 suturas interrompidas) com material de sutura absorvível 6-0.
- Suturar a pele com 5-0 material de sutura absorvível (≈ 10 suturas interrompidas).
NOTA: Certifique-se de que as suturas não estão muito apertadas. Abaulamento da pele é um sinal de aperto excessivo e pode causar desconforto ao animal. - Se o sangramento intenso ocorreu durante a cirurgia, por via subcutânea injectar 1-2ml de soro fisiológico para repor a perda de fluido a partir do animal, conforme permitido sob regulamentos locais.
- Fornecer gel hidratante comestível e permitir que o animal a recuperar completamente da anestesia, que executa a monitorização regular durante pelo menos 1 h antes de retornar o animal de volta para a área de exploração.
- Manter o animal, durante pelo menos 3 semanas para a expressão do transgene óptima para avaliar a regeneração axonal sensorial.
5. Realizar cuidados pós-operatórios do animal
- Fornecer purê de alimentos e roupa de cama de algodão macio para o animal durante o pós-operatório primeira semana. Se necessário, administrar doses adicionais de analgésico e antibiótico para ajudar com a recuperação de acordo com os regulamentos locais / nacionais e orientação de um veterinário.
- Retirar as suturas na pele após 7 - 10 dias.
NOTA: Os efeitos adversos comuns da cirurgia incluem a formação de seroma ou hematoma no local da incisão, arranhar marcas na pele devido à coceira causada poras suturas absorvíveis internas, deficits sensoriais ou de locomoção sutis e sinais de auto-mutilação na pata desaferentada após a lesão por esmagamento da raiz dorsal. Para quaisquer questões de bem-estar que são substancialmente mais grave do que o esperado, consultar veterinário imediato.
6. Realizar uma injeção anterógrada CTB para axonal Tracing
NOTA: Recomenda-se a realização de cólera subunidade da toxina B (CTB) axonal traçando uma semana antes da coleta de tecido.
- Preparar solução a 1% CTB como por instruções do fabricante.
- Opcional: adicione 1% de corante colorido para a solução para fácil visualização da injeção mais tarde. Misturar a solução muito suavemente.
- Anestesiar o animal (ver o passo 3.2.1) e estabilizar a pata dianteira esquerda gravando o membro para a mesa.
- Manualmente e injectar lentamente 1 mL de 1% de CTB subcutaneamente no centro da almofada da pata glabra e quatro dígitos usando um wi microlitro seringaTh, uma agulha de calibre 33 curto feito por encomenda.
NOTA: Antes da injecção, ele ajuda a primeira usar uma agulha biselada de calibre 30 para efectuar uma pequena abertura superficial sobre a pele, o que ajuda a inserção da agulha de injecção. - Permitir que o animal se recuperar totalmente da anestesia antes de retornar o animal para a área de exploração.
7. Tecido Recolha
- Para recolher o DRG injectados com vírus e da medula espinal para imuno-histoquímica, administrar uma sobredose de anestésico e transcardialmente perfundir o animal com soro fisiológico tamponado com fosfato seguido por paraformaldeído a 4% frio. Cuidadosamente executar uma laminectomia completa sobre a coluna vertebral para recolher o tecido fixado sob um microscópio. Continuar com a preparação do tecido, de corte, e processamento tal como exigido para análise 4, 5, 6.
NOTA: O local da incisão recuperado deve ser aparente, como observado pela presença de stecido carro. - Alternativamente, para recolher o DRG injecção de vírus para a cultura in vitro, sacrificar o animal de forma humana com um método aprovado, tal como um aumento da concentração de dióxido de carbono. Cuidadosamente dissecar o DRG sob um microscópio, garantindo condições assépticas, sempre que possível. Continuar com a cultura de tecidos como desejado 4, 5, 6, 10.
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Representative Results
Como uma representação, uma secção da medula espinal transversal com o DRG ligado é apresentado para mostrar a eficácia deste protocolo na transdução neurónios DRG e rastreio axónios sensoriais na medula espinal quatro semanas após a injecção de um vírus de controlo, AAV5-GFP, directamente para o C7 DRG sem lesão por esmagamento da raiz dorsal (Figura 1A). Axónios em ambos a coluna dorsal e o corno dorsal da medula espinal expressar GFP (Figura 1B), assim como os corpos celulares e axónios no interior do DRG injectados (Figura 1C). A análise anatómica adicional do núcleo cuneiforme, o terminal axonal sensorial no tronco cerebral, revela positivo anterógrada CTB rastreio (Figura 1D).
Quando a injecção de DRG é realizada em simultâneo com uma lesão completa esmagamento da raiz dorsal C5-C8, não há axónios GFP positivas na medula espinal ou do terminal CTB-positivas no núcleo cuneiforme são observados (Figura 2A). No entanto, é de salientar que os axónios sensoriais axotomizados ainda pode regenerar-se para a zona de entrada da raiz dorsal de uma raiz dorsal completamente triturada, que é um ambiente de SNP, mas não para além de para a medula espinhal 4, 5 (Figura 2A). No caso em que o vírus injectado contém o transgene de um potencial proteína que promove o crescimento, a presença de axónios marcados na medula espinal pode representar qualquer regeneração ou uma lesão por esmagamento da raiz dorsal incompleta (Figura 2B). Para discriminar entre estes dois resultados, CTB rastreio axonal no núcleo cuneiforme deve ser analisado. A presença de terminais de CTB-positivas no núcleo cuneiforme destaca a probabilidade de uma lesão incompleta (Figura 2C), ao passo que a ausência de terminais CTB-positivos sugere regeneração parcial para a medula espinal, como axónios regeneradossão provavelmente incapaz de crescer a totalidade da distância para atingir o núcleo cuneiforme (Figura 2D). Até à data, sucesso regeneração axonal sensorial para o núcleo cuneiforme na maior parte tem sido relatada em casos com elevada lesão cervical 11, 12 ou com a aplicação de neurotrofinas 13, 14. Quaisquer animais que apresentem sinais de lesão incompleta devem ser excluídos dos estudos axônio de regeneração.
Figura 1: Injecção DRG Sem uma lesão por esmagamento de raiz dorsal. (AC) secção da medula espinal mostrando axónios GFP positivas na medula espinhal (A), incluindo o corno dorsal da coluna dorsal e (B) e corpos celulares no DRG (C) quatro semanas após a injecção de AAV5-GFP. <fortes> (D) terminais de axios sensoriais CTB-positivas no núcleo cuneiforme uma semana após a injecção de CTB. A barra de escala é 650 mícrons (AC) e 250 (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação de raiz dorsal de lesão por esmagamento e a regeneração de axónios. (A) um completas da raiz dorsal de lesão por esmagamento não resulta em axónios marcados na medula espinal ou terminais de axónios CTB-positivos no núcleo cuneiforme. axónios sensoriais sujeitos a axotomia pode regenerar-se para a zona de entrada da raiz dorsal, mas não para além de para a medula espinhal. (BD) A presença de axónios marcados na medula espinal representa ou lesão incompleta ou regeneratiem (B). Com a análise adicional, a presença de terminais de CTB-positivos no núcleo cuneiforme sugere lesão incompleta (C), enquanto que a sua ausência indica lesão completa e regeneração parcial potencialmente para a medula espinal (D). A barra de escala é 250 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, é apresentado um guia de passo-a-passo para realizar uma injecção de DRG e lesão por esmagamento da raiz dorsal da medula espinhal cervical inferior de um rato adulto. Como esta é uma cirurgia extremamente invasivo e delicado, é altamente recomendável que todos os potenciais utilizadores obter treinamento e prática suficiente antes de avançar para viver a cirurgia animal. Os utilizadores devem estar familiarizado, não só com a anatomia espinal medula, mas também com os tecidos circundantes musculares, estrutura do osso vertebral, e vasculatura. Idealmente, um utilizador competente deverá ser capaz de executar o procedimento com o mínimo de danos para os tecidos circundantes, a realização de uma laminectomia limpa por remoção de parte das vértebras sem induzir qualquer dano para a medula espinhal. Como é evidente a partir de lesão medular, uma pequena lesão na medula espinhal podem ter um efeito negativo generalizado a todo o sistema nervoso. Além disso, os animais que tenham sido submetidos a uma cirurgia "limpa" são menos propensos a sofrer de pós-inesperadacomplicações operatórias e as questões de bem-estar e são, portanto, menos provável que tenha de ser sacrificados antes do ponto de tempo experimental desejado.
Para administrar o vírus para o sistema nervoso, existem algumas possíveis vias de administração: por via intravenosa 15, 16 intraperitoneal, intratecal 17, ou injecção directa no alvo 4, 8. Embora injecções intravenosas e intraperitoneais são relativamente não-invasiva, a travessia da barreira sangue-cérebro pode ser uma questão 18, e estas rotas resultar em transdução de não-específica, o que não seria útil em um estudo a regeneração de axónios especializado. Do mesmo modo, para injecção intratecal para o espaço subaracnóide, uma via administrativa mais invasivo, muitos tipos de células neuronais e não neuronais dentro do SNC podem ser transduzidas, potencialmente gerando não específica ou off-target efeitos. Assim, a injecção directa de vírus para o DRG é uma opção favorável e probabilidade de resultar numa eficiência de transdução muito mais elevada do que outros métodos. A principal desvantagem desta opção, no entanto, é a capacidade de invasão do procedimento cirúrgico, o que requer treinamento especializado.
Depois que os usuários têm dominado as habilidades cirúrgicas necessárias, este protocolo oferece uma grande quantidade de flexibilidade. Num estudo a regeneração de axónios, os animais podem ser estudada em combinação com outras técnicas, tais como em electrofisiologia vivo e testes comportamentais sensório-motores, enquanto que os tecidos recolhidos podem ser utilizados para análise anatómica ou cultura de tecido 4. Uma combinação destas técnicas, com variados pontos de tempo experimentais, por exemplo, pode ser utilizado para estudar o progresso de degeneração ou regeneração de diferentes subtipos de fibras, tais como NF200, CGRP, e IB4 após lesão por esmagamento 4. Dependendo da requireme experimentalnts, um ou o outro dos procedimentos apresentados podem ser realizados isoladamente. Por exemplo, DRG injecção só pode ser utilizado para experiências de rastreio axonais, enquanto lesão por esmagamento da raiz dorsal por si só pode ser utilizada em todos os estudos em que é necessário pata dianteira desaferentação. Além disso, os utilizadores também pode variar o tipo de vírus e de produto do transgene para injecção, o DRG exacta a ser injectado, e a raiz dorsal exacta para ferimentos. Se for caso disso, o transplante de células ou a administração farmacológica para o DRG também pode ser realizado usando este protocolo. Com base na habilidade cirúrgica adquiridos, um utilizador experiente pode proceder a outras técnicas, tais como a injecção de DRG na região lombar (por exemplo, em L3 - L5 para avaliar a função dos membros posteriores) 19 ou coluna dorsal lesão por esmagamento, para estudar ainda mais a função da medula espinal 5.
Em conclusão, acreditamos que a injeção de DRG e dorsal lesão por esmagamento da raiz para ser um modelo útil para estudar reg axônio sensorialeneration. Apesar da exigência de formação especializada para realizar o procedimento cirúrgico invasivo, o protocolo é flexível e potenciais utilizadores podem modificar muitas partes para acomodar seus requisitos experimentais. Esses procedimentos podem servir como uma base para aqueles em busca de um modelo animal adequado para estudos axônio regeneração sensoriais.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Christopher e Dana Reeve Foundation, do Medical Research Council, a pesquisa Conselho ECMneuro Europeia, ea Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Nós gostaríamos de expressar nossa mais profunda gratidão a Heleen Merel van 't Spijker e Justyna Barratt para sua assistência técnica durante as filmagens. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Elizabeth Moloney e Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) para auxiliar na produção de AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
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