Summary
이 프로토콜은 표적 결합 및 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 유도와 같은 리툭시 맵의 두 가지 중요한 기능적 특성 에 대한 시험관 내 비교를 설명합니다. 상기 방법은 기준 리툭시 맵과 리툭시 맵 바이오시 밀러 사이의 일대일 비교를 위해 사용되었다. 이러한 분석법은 바이오시 밀러 개발이나 생산 과정에서의 품질 관리에 사용될 수 있습니다.
Abstract
치료 용 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)는 암을 포함한 여러 병리 상태의 치료에 적합하다. 제약 회사로 바이오시 밀러 단클론 항체의 개발은 시장 기회이지만, 또한 약물 접근성을 높이고 치료 관련 비용을 절감 할 수있는 전략이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 Daudi 세포에서 리툭시 맵과 목표 구속력 CDC 유도 평가를 설명한다. 이들 두 기능은 항체의 다른 영역의 구조를 필요 리툭시 맵에 의해 유도 된 임상 효과에 적합하다. 프로토콜은 기준 리툭시 맵의 좌우 비교 시판 리툭시 맵의 밀러를 허용한다. 평가 된 제품은 기본 물리 화학적 차이가 있음을 시사하고 임상에서 그 차이의 영향을 분석 할 필요성을 강조하는, 표적 결합 및 CDC 유도 모두에서 차이를 보였다. 여기에보고하는 방법은 체외에서 간단하고 저렴한 구성 </ EM> 리툭시 맵 바이오시 밀러의 활동의 평가를위한 모델. 따라서, 그들은 바이오시 밀러 개발시 유용뿐만 아니라, 바이오시 밀러 생산 품질 관리가 될 수 있습니다. 또한, 상기 제시된 방법은 다른 치료 용 모노클로 추정 될 수있다.
Introduction
치료 항체는 암,자가 면역 및 만성 질환, 신경 학적 장애 등 1 등 다양한 병리의 치료를 위해 개발 된 재조합 단일 클론 항체 (단클론 항체)이다. 현재 FDA는 40 개 이상의 치료 단클론 항체에 대한 승인을 부여하고, 더는 다음 년 만에 시장에 도달 할 것으로 예상된다.
리툭시 맵은 CD20 + B 세포 비호 지킨 림프종 (NHL), CD20 + 여포 성 NHL, 만성 림프 구성 백혈병, 류마티스 관절염 (2, 3)의 치료를 위해 승인 된 높은 친 키메라 단일 클론 항체의 IgG1이다. 리툭시 맵에 의한 B 세포에서 과다 발현되는 CD20의 인식은 아폽토시스를 유도하고; 활성화를 보완; 항체 - 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 3. 이 약의 특허는 2013 년 2016 년 미국 유럽 및 만료각각. 따라서, 제약 회사는 전 세계적으로 리툭시 맵 바이오시 밀러를 개발하고있다. 인간의 소비에 대한 다른 약물과 마찬가지로, 바이오시 밀러는 규제 기관의 승인을 필요로합니다. 국제 가이드 라인은 단클론 항체에 대한 생물학적 동등성이 새로운 레퍼런스 제품 4의 물리 화학적 특성, 약물 동력학, 효능 및 안전성을 비교하여 증명되어야 함을 나타냅니다.
따라서, 이러한 비교에서 사용 된 방법은 모노클로 날 항체의 구조적 및 기능적 특성, 임상 적 관련성 특히 평가한다. 이를 위해, 시험 관내 분석법 (. 채프먼 등 검토) 생체 내 실험을 통해 여러 장점을 보여 5 : ⅰ) 시험관 내 연구에서 제안 된 밀러 제품과 기준의 차이에 민감하다; ⅱ) 생체 내 연구에 많은 모노클위한 중요한 종으로 수행해야비 - 인간 영장류; 및 ⅲ) 작용 기전 임상전 독성, 참조 제품의 임상 효과 때문에 아니라 추가적인 유용한 정보를 제공하지 않을 수 밀러와 생체 내 연구에서, 공지되어있다. 따라서, 바이오시 밀러에 대한 유럽 연합 (EU)의 지침 후보 생체 데이터 만 6 강력한 기반으로 임상 시험을 입력 할 수 있습니다.
여기, 우리는 CD20 + 배양 세포를 사용 리툭시 맵의 생물학적 활성을 평가하는이 빠르고, 경제, 간단한 분석을 제시한다. 이 분석은 리툭시 맵 바이오시 밀러 후보에 대한 비교 동등성의 일부로 포함 할 수있다.
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Protocol
1. 유동 세포 계측법에 의한 표적 결합의 평가
- 생물학적 물질 및 시약의 제조
- 10 % 열 불 활성화 태아 소 혈청 (H-IFBS)을 보충 한 RPMI 배양 배지 500 mL를 만든다.
- 문화 Daudi Burkitt의 림프종 (Daudi) 세포와 Daudi GFP + 세포 (RPMI와 75cm 2 배양 플라스크 사용). 5 % CO 2 가습 분위기에서 37 ° C에서 6 ~ 9 X 10 5 cells / mL가 될 때까지 배양한다.
- PBS에 1/100 H-IFBS를 희석하여 염색 완충액 50 mL를 만든다; 이 완충액은 최소 1 개월 동안 2 ~ 8 ° C에서 안정합니다.
- 기준 및 biosimilar mAbs에 대한 테스트 솔루션을 준비하십시오. 5 μg / mL부터 시작하는 염색 완충 용액에 10 : 1의 순차 희석액 (각각 500 μL)을 만드십시오.
- 염색 버퍼를 사용하여 인간 IgG (이소 타입 컨트롤)를 5 μg / mL로 희석하고 PE-Cy5 마우스 항 인간 IgG (2 차 항체)를 con제조업체가 제시 한 중앙 집중도.
- PBS (고정 버퍼)에 4 % paraformaldehyde를 준비합니다.
- 대상 바인딩
- 75cm 2 배양 플라스크에서 Daudi 및 Daudi GFP + 세포 현탁액을 모아 15mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 5 분 400 XG에서 원심 분리기.
- PBS 5 ML을 추가하여 세포를 씻어 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 centrifuging.
- PBS에 세포를 Resuspend하고 trypan 블루와 셀 카운트와 생존 능력 분석을 수행합니다. 분석을 위해 세포 생존율이 95 % 이상인 배양 물을 사용한다.
- 차가운 얼룩 버퍼와 4 x 10 6 세포 / ML에 세포 현탁액을 희석.
- 1.5 - ML의 microcentrifuge 튜브, 참조 또는 biosimilar mAbs의 다른 테스트 농도의 100 μL에 세포 현탁액 50 μL를 추가합니다. 각 실험 조건에 대한 복제물을 포함하십시오.
- 추가 튜브 준비이소 형 대조군 (리툭시 맵 대신 인간 IgG1) 및 음성 대조군 (1 차 항체가없는 2 차 항체).
- 4 ° C에서 20-30 분 동안 품어 라.
- PBS 1 ML을 추가하여 세포를 씻어 10시 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 centrifuging ° C. 뜨는 물을 버린다.
- 2 차 항체 100 μL에 세포를 일시 중지하고 4에서 20 ~ 30 분 동안 품어. ° C, 빛으로부터 보호.
- PBS로 두 번 세포를 씻어 고정 버퍼의 200 μL에서 그들을 중단.
- 유동 세포 계측기에서 세포를 분석하십시오.
참고 : 샘플을 4 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호하면 신호가 며칠 동안 안정합니다.
- 데이터 취득
- 유동 세포 계측 운영 소프트웨어의 워크 시트에 두 개의 도트 플롯을 엽니 다. 첫 번째에는 FSC-A 대 FSC-H를 설정하고 두 번째에는 FSC-A 대 SSA-A를 설정하십시오. PE-Cy5 채널에 대한 히스토그램을 엽니 다.
- FSC-A 대 FSC-H 플롯에서 단일 게이트 이벤트를 선택하는 게이트 (R1)를 만드십시오 ( 그림 1A ).
- FSC-A 대 SSA-A 도트 플롯에서 R1 집단을 설정하고 표적 세포 ( 그림 1B )를 선택하는 새로운 게이트 (R2)를 만듭니다. PE-Cy5 강도 히스토그램에서 R2 모집단을 설정하여 세포의 빈도 분포를 봅니다.
- 네거티브 및 이소 타입 컨트롤 ( 그림 1C )을 사용하여 PE-Cy5 채널에 대한 낮은 형광 강도 (FI) 제한을 조정합니다.
- 참조 제품의 농도가 더 높은 샘플에서 R2 내 10,000 개의 이벤트를 수집합니다. 이 샘플의 FI는 예상되는 최고 값이어야합니다 ( 그림 1C ).
- 샘플의 나머지 부분을 얻으십시오.
- 각 샘플에 대해 PE-Cy5 채널에서 중간 형광 강도 (MFI)를 얻습니다.
- 기준 또는 biosimilar 단클론 항체가있는 시료의 경우 시료 MFI와 이소 타입 컨트롤 (ΔMFI)의 차이를 계산하십시오.
CDC 2. 평가
- 생물학적 물질 및 시약의 제조
- 전술 한 (- 1.1.2 1.1.1 단계)로 세포 배양 배지와 배양의 Daudi 및 GFP +의 Daudi 세포를 준비한다.
참고 : 또한, CDC 분석은 무 혈청 RPMI이 필요합니다. - 무 혈청 RPMI로 2 : 정상적인 인간 혈청 보체 (NHSC) 1을 희석. 2.5 mL의 준비.
- RPMI로 2 : 1 NHSC 희석 열 불 활성화 (30 분 / 56 ° C) 1 ㎖를 준비한다.
- 무 혈청 RPMI에서 테스트 기준에 대한 솔루션과 바이오시 밀러 단클론 항체의 세트를 준비합니다. 0.025 ㎍ / mL의 1에서 열 개 희석 (200 μL 각)를 확인합니다.
- 전술 한 (- 1.1.2 1.1.1 단계)로 세포 배양 배지와 배양의 Daudi 및 GFP +의 Daudi 세포를 준비한다.
- CDC 분석
- 배양 물로부터의 Daudi 및 GFP +의 Daudi 세포를 수집하고, 세포 생존력 (단계 1.2.1 참조 - 1.2.3)를 정량화.
- 혈청이없는 RPMI에 4 × 105 세포 / ㎖의 세포 현탁액을 제조.
- 더하다96- 웰 원추형 (V) - 바닥 마이크로 플레이트에서 각 참조 또는 biosimilar 단클론 항체 검사 농도 50 μL에 세포 현탁액 50 μL. 각 실험 조건에 대한 복제물을 포함하십시오.
- 네가티브 컨트롤 ( 즉, 단클론 항체가없는), 기초 사멸 조절 ( 즉, 단클론 항체 존재시 열 비활성화 된 NHSC) 및 염색 양성 대조군 ( 즉, 70 % EtOH 50 μL에 노출 된 세포)에 대한 추가 웰을 준비합니다.
- 37에서 20 ~ 30 분 동안 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 humidified 분위기.
- 각 우물에 50 μL의 NHSC (1 : 2로 희석)를 첨가하고 37 ℃에서 2.5 시간 동안 옵 소닌 화 된 세포를 배양합니다. 5 % CO 2 가습 분위기에서. 기초 사멸 조절 우물에서 열 비활성화 된 NHSC를 사용하십시오.
- 10 ° C에서 5 분간 400 XG로 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다.
- 150 μL의 PBS를 첨가하고 400 xg 및 10 ° C에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하여 세포를 세척한다. 디상등액을 scard.
- 이전 7,8 바와 같이, 7-aminoactinomycin (7-AAD)를 샘플 얼룩.
- 같은 날에 흐름 세포 계수기에 세포를 분석 할 수 있습니다.
- 데이터 취득
- 운영 소프트웨어 흐름 cytometer의 워크 시트 열기 개의 도트 플롯. 1.3.3 (도 2A-B) - 단계 1.3.1에서와 같이 이러한 플롯을 설정한다. R2의 인구에 7-AAD 대 GFP의 도트 플롯이다 세 번째 플롯을 작성합니다.
- 의 Daudi 세포를 사용하여 적절한 FI 한계를 정의의 Daudi GFP + 세포 죽음 양성 대조군 (도 2C).
- 각 샘플에 대해, 7-AAD + 표적 세포의 비율을 측정한다. R2에서 적어도 5000 개 이벤트를 취득.
- 샘플과 다를 검색된 백분율로부터 기저 데스 제어 -7- AAD +의 비율을 감산하여 특정 항체 - 유도 세포 독성을 계산모노클로 날 항체의 엔트 농도 (도 2D).
3. 생물학적 동등성 분석
- 그래프 소프트웨어로 농도 및 응답 값을 입력합니다.
- 그래프를 생성하고 다음 고려하여 비 선형 회귀를 계산 : i)는 "X"로 항체 농도의 로그 변환을 사용한다; ⅱ) 경사 수학적 모델 변수 (Y = 최소 응답 + (최대 반응 - 최소 반응)를 사용 / 1 + 10 ^ ((LogEC 50-X) * 힐 기울기)); 기저 응답을 감산 한 이후 및 ⅲ) 0으로 하단 값을 제한.
참고 : 대칭 S 자 모양의 곡선이 예상된다. - F 테스트를 (많은 그래프 소프트웨어 프로그램은이 기능을 포함)를 사용하여 글로벌 맞춤와 비선형 맞는 양을 비교.
참고 : 이러한 테스트가 일치하는 최대 반응, logEC (50)와 힐의 기울기는 두 데이터 세트에 대해 동일 귀무 가설로 설정의도 된 생물학적 문제는 해결 될 수 있습니다.
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Representative Results
전술 한 프로토콜을 사용하여, 결합 대상 및 기준 리툭시 맵의 CDC 유도 아시아에서 생산 밀러 리툭들 시판와 병렬로 비교 하였다.
의 Daudi 세포에서 모노클로 날 항체는 모두 농도 의존적으로 (도 1D)에 CD20을 결합. 결합 데이터의 비선형 회귀 분석 기준 및 밀러 리툭 각각 (도 1E)에 대해 0.978 및 0.848의 R 2를 표시. 농도 - 반응 곡선의 통계적 분석은, 이들 계산 때문에, 약동학 파라미터는, 모노클로 날 항체 (P <0.0001)과 크게 다른 것으로 나타났다. 동등 생물에 대한 최대 반응은 기준 제품보다 낮은 2.16 배이었다. 이러한 결과는이 평가 단클론 항체가 CD20는 나를 표현 바인딩 서로 다른 능력을 가지고 제안백혈병 세포의 mbrane.
CDC 유도 또한 2 가지 단클론 항체와 비교되었다. 기준 및 바이오시 밀러 제품은 Daudi 세포에서 CDC를 농도 의존적으로 자극했다 ( 그림 2E ). 중요하게, mAb가 CDC를 유도하는 농도는 표적 결합에 필요한 농도와 상이했다. CDC 데이터의 비선형 회귀는 두 제품 모두에서 r 2 > 0.980을 보였다. 농도 - 반응 곡선의 통계적 비교는 이들이 유의 적으로 다르다는 것을 나타내 었으며 (P <0.01), 바이오시 밀러의 효능이 떨어졌습니다. 이들 데이터는 CDC를 유도하는 용량이 분석 된 단클론 항체에 대해 상이하다는 것을 나타낸다.
그림 1. 항 -CD20 치료 용 단클론 항체의 표적 결합. Daudi GFP + 세포가 서로 다른 것으로 나타났습니다.모노클로 날 항체의 엔트 농도 (4.8 NG / ml로 5 ㎍ / mL의에) 다음 PE-Cy5에 접합 된 항 - 인간 이차 항체로 염색. 형광 강도 (FI)를 세포 계측법의 Daudi 세포 (B)의 것에 대응하는 크기 및 입도 단일 이벤트 (A)의 흐름에 의해 측정 하였다. 염색 세포 (라이트 그레이), 아이소 타입 컨트롤 (어두운 회색), 5 μg의 기준 리툭시 맵 (청색)의 / ㎖가 FI 한계 (C)를 설정하기 위해 사용되었다. 평가는 모두 모노클로 날 항체 농도 의존적으로 (D)에서의 Daudi 세포를 결합. 응답 (ΔMFI, 텍스트 참조)를 기준 (청색) 나 밀러 (블랙) 리툭시 맵 (E)에 대한 농도 - 반응 곡선을 생성하는데 사용 하였다. 비선형 회귀 분석의 통계 비교는 모노클 차이 (, 피셔의 정확한 시험, P <0.0001)를 나타내었다. 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의에.
항 -CD20 치료 단클론 항체에 의해 그림 2. CDC 유도. 모노클로 날 항체의 다양한 농도로 옵 소닌의 Daudi GFP + 세포는 인간 보체에 노출시켰다. 세포 사멸을 7- AAD 염색 및 크기와 입도가의 Daudi 세포 (B)에 대응하는 단일 이벤트 (A)의 형광 강도 (FI)의 유세포 분석으로 평가 하였다. 흠 GFP- (검은 색)과 GFP + (녹색) 세포와 에탄올 살해 세포 (적색) 컨트롤 (C)로 하였다. 단클론 항체 - 유도 세포 독성 (D)의 계산을 허용 기저 죽음 제어 (회색) 및 리툭시 맵의 샘플 (청색)의 7-AAD가 + 세포의 정량. 기준 (청색) 나 밀러 (블랙) 리툭시 맵에 대해 얻어진 농도 - 반응 곡선 (E). 비선형 회귀 분석의 통계 비교는 두 개의 단클론 항체 (, 피셔의 정확한 시험, P <0.01)에 의해 유도 된 반응의 차이를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 단일 클론 항체는 CDC 분석의 대상 세포로 치료 목적 사용 승인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
치료 단클론 항체의 특허 만료 바이오시 밀러의 개발을 추진하고 있습니다. 따라서, 이러한 제품의 임상 적 활동의 차이를 식별 할 수있는 간단한 방법이 필요하다. 목표 구속력 CDC 유도 : CD20 + 세포 배양은 리툭시 맵의 두 가지 주요 기능 특성의 평가를 위해 사용 하였다. 후자는 그것의 보수 (9) Fc 영역의 상호 작용에 주로 의존하면서 전자 활성은 항체의 Fab의 영역에 의해 CD20의 인식을 요구한다. 따라서 이러한 분석은 모노클로 날 항체의 구조적 및 기능적 특성을 연결하는 방법을 제공한다.
치료 용 모노클로 날 항체의 결합 대상은 통상의 등온 적정 열량 측정법 (ITC), 표면 플라스 몬 공명 (SPR), 또는 biolayer 간섭계 (10), (11), (12)에 의해 평가된다. 이 분석은 AF 허용finity 계산하지만 전문 장비와 훈련이 필요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 친화도 데이터없이, 제품 간의 차이를 식별하기 위해 좌우 비해 표적 결합을 평가한다. 상기 방법은 간단하고 활성 평가를위한 관련 세포 컨텍스트를 사용한다. 반면, 리툭시 맵에 의한 CDC의 유도가 해제 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 정량은 알라 마르 블루 14, 15, 및 16은 MTT 분석법 ATP 측정 (13)에 의해 평가 될 수있다. 7-AAD 염색법을 사용하여 여기에보고 된 방법은 낮은 배경을 갖고 multiparametric 유세포 분석을위한 다른 얼룩과 결합 될 수있다.
제시된 대표적인 실험에서 투여 량 - 반응 곡선이 상기 EC (50)의 산출, 힐 기울기 및 최대 반응을 허용 4- 파라미터 기호 논리적 모델을 끼워. concentrati의 특히, 범위이러한 곡선을 생성하기 위해 사용 된 분석은 각 분석마다 다르므로 예비 실험에서 적절한 범위를 분석하고 정의하는 것이 중요하다는 것을 강조했다. 형광 염료 및 보체와 같은 주요 시약의 변화 또는 다른 목표 수준의 세포주의 사용은 유효 농도 범위를 대체 할 수 있습니다.
통계 분석은 표적 결합과 CDC 유도 모두에서 아시아에서 상업적으로 이용 가능한 바이오시 밀러 리툭시 맵의 한 배치와 참고 제품 간의 차이를 확인했습니다. 단클론 항체의 제조 공정이 엄격히 통제되는 경우에도 참조 생산물의 각 속성이 범위를 표시한다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 유사한 생물 요법의 평가 과정에서 시험해야하는 배치의 최소 수는 대조군의 가변성의 정도와 분석의 가변성에 달려있다 .4)비교의 평가 기간 동안 NT를 배치.
제시된 방법은 한 항원을 발현하는 세포에 접근 한, 치료 적 단클론 항체 - 타겟 다른 쌍에 외삽 될 수있다. CDC 유도가 임상 적 효능에 관련된 각 단클론 항체에 대한 이전에보고 된 휴대 전화 모델에 대한 정보를 컴파일하는 리툭시 맵 이외의 표 1은 치료 단클론 항체.
결론적으로, 여기에 설명 된 두 가지 분석은 대부분의 실험실에서의 실행을 허용, 간단한 빠르고, 저렴. 방법은 바이오시 밀러 개발의 초기 단계에서 또는 생산 중에 배치 별 비교를 위해 규제 당국의 승인 후 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González 및 SM Pérez-Tapia는 UDIBI의 직원으로 여러 제약 회사의 생물 동등성 연구를 수행합니다.
Acknowledgments
저자는 인정하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
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