Summary
このプロトコルは、リツキシマブの2つの重要な機能特性、すなわち標的結合および補体依存性細胞傷害（CDC）誘導のin vitro比較を記載する。この方法は、参照リツキシマブとリツキシマブバイオシミラーとの間での左右比較のために用いられた。これらのアッセイは、バイオシミラーの開発中またはその製造における品質管理として使用することができる。
Abstract
治療用モノクローナル抗体（mAb）は、癌を含む様々な病状の治療に関連する。製薬企業によるバイオシミラーmAbの開発は市場機会であるが、薬物接近性を高め、治療関連コストを削減する戦略でもある。本明細書で詳述するプロトコルは、Daudi細胞におけるリツキシマブによる標的結合およびCDC誘導の評価を記載する。これらの2つの機能は、抗体の異なる構造領域を必要とし、リツキシマブによって誘発される臨床効果に関連する。これらのプロトコールは、参照リツキシマブと市販のリツキシマブバイオシミラーの横から縦の比較を可能にする。評価された製品は、標的結合およびCDC誘導の両方において差異を示し、基礎的な物理化学的な相違点があることを示唆し、臨床設定におけるこれらの相違の影響を分析する必要性を強調した。ここに報告された方法は、単純で安価なin vitro <リツキシマブ・バイオシミラーの活性の評価のためのモデルである。したがって、それらは、バイオシミラーの開発中、ならびにバイオシミラー生成における品質管理のために有用であり得る。さらに、提示された方法は、他の治療用mAbに外挿することができる。
Introduction
治療用抗体は、癌、自己免疫疾患および慢性疾患、神経障害、および他の1を含む種々の病状の治療のために開発された組換えモノクローナル抗体（mAb）です。現在、FDAは、40の以上の治療のmAbを承認した、とよりは、次の年に市場に達すると予想されています。
リツキシマブは、CD20 + B細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）、CD20 +濾胞性NHL、慢性リンパ球性白血病、および慢性関節リウマチ2,3の治療のために承認された高親和性キメラモノクローナルIgG1抗体です。リツキシマブによるB細胞において過剰発現されるCD20の認識は、アポトーシスを誘導します。補体活性化。および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）3。この薬の特許は2013年と2016年にヨーロッパで、米国で期限切れそれぞれ、したがって、世界中の製薬企業はリツキシマブ・バイオシミラーを開発している。他のヒト麻薬薬と同様に、バイオシミラーは規制当局の承認を必要とする。国際ガイドラインによると、モノクローナル抗体では、新生物および参照産物の物理化学的特性、薬物動態、有効性、および安全性を比較することによって、生体親和性を実証する必要がある4 。
したがって、そのような比較に使用される方法論は、mAb、特に臨床的に関連性のあるものの構造的および機能的特性を評価しなければならない。そのために、 in vitroアッセイは、in vivo実験（Chapman et al。で概説されている ） 5に比べていくつかの利点を示す：i） in vitro研究は、提案されたバイオシミラーと参照産物との間の差異により敏感である。 ii） in vivo試験は、関連する種において実施されなければならず、多くのmAbについて、非ヒト霊長類; iii）作用機序、前臨床毒性学、および参照産物の臨床効果は周知であるため、バイオシミラーを用いたインビボ研究はさらなる有用な情報を提供しない可能性がある。したがって、欧州連合（EU）のバイオシミラーのガイダンスにより、候補者は強力なインビトロデータのみに基づいて臨床試験に入ることができる6 。
ここでは、CD20 +培養細胞を用いたリツキシマブの生物学的活性を評価する2つの迅速、経済的、および単純なアッセイを提示する。これらのアッセイは、リツキシマブのバイオシミラー候補の比較練習の一部として含めることができます。
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Protocol
フローサイトメトリーによる標的結合の評価
- 生物学的材料および試薬の調製
- 10％熱不活性化ウシ胎仔血清（H-IFBS）を添加したRPMI培地500mLを調製する。
- 培養Daudi Burkittのリンパ腫（Daudi）細胞およびDaudi GFP +細胞（RPMIおよび75cm 2培養フラスコを使用）。 5％CO 2加湿雰囲気で37℃、6〜9×10 5細胞/ mLになるまで培養物を維持する。
- PBS中の1/100 H-IFBSを希釈することにより50mLの染色緩衝液を調製する;この緩衝液は2〜8℃で少なくとも1ヶ月間安定である。
- 参照およびバイオシミラーmAbの試験溶液を調製する。 5μg/ mLから始まる染色バッファー中で10：1の段階希釈液（それぞれ500μL）を調製する。
- 染色バッファーを使用して、ヒトIgG（アイソタイプ対照）を5μg/ mLに希釈し、PE-Cy5マウス抗ヒトIgG（二次抗体）をCon製造業者によって提案されている。
- PBS（固定緩衝液）中4％パラホルムアルデヒドを調製する。
- ターゲットバインディング
- DaudiおよびDaudi GFP +細胞懸濁液を75cm 2培養フラスコから収集し、15mL遠心管に移す。 400xgで5分間遠心分離する。
- 5mLのPBSを添加し、5分間400×gで細胞懸濁液を遠心分離することによって細胞を洗浄する。
- 細胞をPBSに再懸濁し、トリパンブルーで細胞数および生存率分析を行う。分析のために95％以上の細胞生存率レベルを有する培養物を使用する。
- 冷たい染色緩衝液で4×10 6細胞/ mLに細胞懸濁液を希釈する。
- 1.5mLのマイクロ遠心チューブで、50μLの細胞懸濁液を100μLの異なる試験濃度の対照またはバイオシミラーmAbに加えます。実験条件ごとに反復を含める。
- 追加のチューブを準備するアイソタイプコントロール（リツキシマブの代わりにヒトIgG1）およびネガティブコントロール（一次抗体を含まない二次抗体）。
- 4℃で20〜30分間インキュベートする。
- PBS 1mLを加え、10分間400×gで5分間遠心して細胞を洗浄する。上清を捨てる。
- 100μLの二次抗体に細胞を懸濁し、光から保護された4℃で20〜30分間インキュベートする。
- PBSで細胞を2回洗浄し、固定緩衝液200μL中にそれらを懸濁する。
- フローサイトメーターで細胞を分析する。
注：サンプルが4℃で保存され、光から保護されている場合、信号は数日間安定しています。
- データ収集
- フローサイトメーター操作ソフトウェアのワークシート上に2つのドットプロットを開く。最初のFSC-A対FSC-A対第2番目のFSC-A対SSA-Aを設定します。 PE-Cy5チャンネルのヒストグラムを開きます。
- FSC-A対FSC-Hプロットでは、ゲート（R1）が一重項事象を選択するようにする（ 図1A ）。
- SSA-Aドットプロットに対するFSC-AのR1集団を設定し、標的細胞を選択する新しいゲート（R2）を作製する（ 図1B ）。細胞の頻度分布を見るために、PE-Cy5強度ヒストグラムのR2集団を設定する。
- ネガティブおよびアイソタイプコントロール（ 図1C ）を使用して、PE-Cy5チャンネルの蛍光強度（FI）制限値を調整します。
- 基準製品の濃度がより高いサンプルからR2内の10,000の事象を取得する。このサンプルのFIは予想される最高値でなければなりません（ 図1C ）。
- 残りのサンプルを取得します。
- 各サンプルについて、PE-Cy5チャネル中の中央蛍光強度（MFI）を得る。
- 参照またはバイオシミラーmAbを有する試料については、試料MFIとアイソタイプ対照（ΔMFI）との差を計算する。
2. CDCの評価
- 生物学的材料および試薬の調製
- 細胞培養培地を調製し、上記のDaudiおよびDaudi GFP +細胞を培養する（ステップ1.1.1〜1.1.2）。
注：さらに、CDCアッセイには無血清RPMIが必要です。 - 正常ヒト血清補体（NHSC）1：2を無血清RPMIで希釈する。 2.5 mLを調製する。
- RPMIで1：2に希釈した熱不活性化（30分/ 56℃）NHSC 1 mLを調製する。
- 無血清RPMI中の参照およびバイオシミラーmAbに対する一連の試験溶液を調製する。 1〜0.025μg/ mLの10希釈（各200μL）を行います。
- 細胞培養培地を調製し、上記のDaudiおよびDaudi GFP +細胞を培養する（ステップ1.1.1〜1.1.2）。
- CDCアッセイ
- 培養物からDaudiおよびDaudi GFP +細胞を収集し、細胞生存率を定量する（ステップ1.2.1〜1.2.3参照）。
- 無血清RPMI中で4×10 5細胞/ mLの細胞懸濁液を調製する。
- 追加96ウェルの円錐形の各参照又はバイオシミラーのmAbの試験濃度の50μLの細胞懸濁液（V）の50μL-bottomマイクロ。各実験条件のための反復が含まれます。
- 、モノクローナル抗体（mAbなしで、すなわち ）陰性コントロールの基礎死制御を追加のウェルを準備（ すなわち、熱不活性化mAbの存在下でNHSC）、および染色陽性コントロール（ すなわち、70％の50μLのEtOHに曝露された細胞）。
- 5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で30分間- 20細胞をインキュベートします。
- NHSCの50μL（1希釈：2）を追加し、それぞれのウェルを、5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で2.5時間オプソニン化細胞をインキュベートします。基礎死対照ウェルに熱不活性化NHSCを使用してください。
- 10℃で5分間、400×gで遠心分離。上清を捨てます。
- PBS 150μLを添加し、400×gで、10°Cで5分間細胞懸濁液を遠心分離することによって細胞を洗います。ディ上清をSCARD。
- 先に図7、 図8に記載されているように、7-アミノアクチノマイシン（7-AAD）を用いてサンプルを染色。
- 同じ日に、フローサイトメーターで細胞を分析します。
- データ収集
- オペレーティングソフトウェアフローサイトメーターのワークシート上の2つのドットプロットを開きます。ステップ1.3.1のように、これらのプロットを設定- 1.3.3（ 図2A-B）。 R2の人口の7-AAD対GFPのドットプロットである第三のプロットを作成します。
- Daudi細胞を用いて適切なFIの制限を定義する、ダウディGFP +細胞、及び死陽性対照（ 図2C）。
- 各サンプルについて、7-AAD +標的細胞の割合を測定します。 R2から少なくとも5000のイベントを取得します。
- 異なると試料中に見出さ割合から基本死制御に7-AAD +の割合を減算することにより特異的mAbによって誘導される細胞毒性を計算しますmAbのENT濃度（ 図2D）。
3. Biosimilarity分析
- グラフ作成ソフトウェアに集中し、応答値を入力します。
- グラフを生成し、次の考慮事項と非線形回帰を計算した：i）「X」としてmAb濃度の対数変換を使用します。 ii）の可変勾配数学モデル（Y =最小応答+（最大応答-最小応答）を使用/ 1 + 10 ^（（LogEC 50 -X）*ヒルスロープ））。基礎応答が差し引かれているのでIII）、ゼロにボトム値を制約します。
注：対称のS字状の形状の曲線が期待されています。 - F検定を（多くのグラフのソフトウェア・プログラムは、この機能が含まれる）を使用して、グローバルフィットと非線形フィットの両方を比較してください。
注：このようなテストは、最大応答、logEC 50、およびヒルスロープは、2つのデータセットのために同じであることを帰無仮説として確立一致します対処されることを意図した生物学的質問。
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Representative Results
上記のプロトコルを用いて、標的結合および参照リツキシマブのCDC誘導を、アジアで産生され市販されているバイオシミラーリツキシマブのものと並行して比較した。
Daudi細胞では、両方のmAbがCD20に濃度依存的に結合した（ 図1D ）。結合データの非線形回帰は、参照およびバイオシミラーのリツキシマブそれぞれについて0.978および0.848のr 2を示した（ 図1E ）。濃度 - 応答曲線の統計的分析から、これらのmAbおよびそれらから計算された薬力学的パラメータは、mAb間で有意に異なることが示された（P <0.0001）。バイオシミラーの最大応答は参照生成物のそれより2.16倍低かった。これらの結果は、2つの評価されたmAbが、白血病細胞のmbrane。
CDCの誘導は、2つのmAbと比較しました。基準とバイオシミラー製品は、濃度依存的（ 図2E）でダウディ細胞でCDCを刺激しました。重要なことに、mAbはCDCを誘起する濃度は、標的結合に必要なものよりも異なっていました。 CDCデータの非線形回帰は、両方の製品についてのR 2> 0.980を示しました。濃度 - 応答曲線の統計学的比較は、それらがバイオシミラーはあまり強力で行う、（P <0.01）有意に異なることを示しました。これらのデータは、CDCを誘導する能力を分析したmAbのために異なっていることを示しています。
インビトロ標的結合抗CD20治療mAbので図1。ダウディGFP +細胞が異なると暴露しましたmAbの濃度（4.8ng / mL〜5μg/ mL）を決定し、PE-Cy5結合抗ヒト二次抗体で染色した。蛍光強度（FI）は、Daudi細胞（B）のサイズおよび粒状度に対応する単一事象（A）についてのフローサイトメトリーによって測定した。 FI制限（C）を設定するために、染色されていない細胞（薄灰色）、アイソタイプ対照（暗灰色）、および5μg/ mLの参照リツキシマブ（青）を用いた。両方の評価されたmAbは濃度依存的にDaudi細胞に結合した（D） 。応答（ΔMFI;テキスト参照）を用いて、参照（青）またはバイオシミラー（黒）リツキシマブ（E）の濃度 - 応答曲線を作成した。非線形回帰の統計的比較は、mAb間の差異を示した（P <0.0001; Fisher exact test）。 より大きいversiを見るにはここをクリックしてくださいこの図の上。
抗CD20治療用mAbによって図2 CDCの誘導。 mAbを種々の濃度でオプソニン化ダウディGFP +細胞はヒト補体に曝露しました。細胞死は、サイズおよび粒度がDaudi細胞（B）に対応して、7-AAD染色および単一のイベント（A）上の蛍光強度（FI）のフローサイトメトリー分析により評価しました。未染色GFP-（黒）およびGFP +（緑色）細胞およびエタノール死滅細胞（赤色）は、対照（C）として含めました。モノクローナル抗体誘発細胞毒性（D）の計算のために許可された基礎死コントロール（灰色）およびリツキシマブサンプル（青）における7-AAD +細胞の定量。参照（青）またはバイオシミラー（黒）リツキシマブ（E）について得られた濃度-応答曲線。非線形回帰の統計学的比較は、二つのmAb（;フィッシャーの正確確率検定P <0.01）によって誘導される応答との間の差を示しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1モノクローナル抗体は、CDCアッセイの標的細胞と、治療的使用のために承認します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
治療用mAbの特許満了により、バイオシミラーの開発が促進されている。したがって、これらの製品の臨床的に関連する活動における差異を特定することができる簡単な方法が必要とされている。 CD20 +培養細胞を、リツキシマブ：標的結合およびCDC誘導の2つの重要な機能特性の評価のために用いた。前者の活性はmAbのFab領域によるCD20の認識を必要とするが、後者は主にFc領域とその相補体9との相互作用に依存する。したがって、これらのアッセイは、mAbの構造的および機能的特徴を結びつける方法を提供する。
治療用mAbの標的結合は、通常、等温滴定熱量測定（ITC）、表面プラズモン共鳴（SPR）、またはバイオ層干渉計10,11,12によって評価される。これらのアッセイにより、finity計算が、彼らは特殊な機器と訓練が必要です。ここで説明するプロトコルも親和性データなしで、製品間の違いを識別するために、左右の比較において、標的結合を評価します。方法は簡単で、活動の評価のための関連する細胞の状況を採用しています。一方、リツキシマブによるCDCの誘導は、放出された乳酸脱水素酵素（LDH）の定量は、14またはアラマーブルー15、及びMTTは16アッセイATP測定13により評価することができます。 7-AAD染色を使用して、ここで報告された方法は、低いバックグラウンドを有し、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析のために他の染色と組み合わせることができます。
提示代表的な実験では、用量反応曲線は、EC 50の計算、ヒルスロープ、および最大応答を可能にする、4パラメータロジスティックモデルを嵌。 concentratiの注目すべきは、範囲予備実験で十分な範囲を分析し、規定の重要性を強調し、各アッセイのために異なっていたような曲線を生成するために使用アドオン。そのような蛍光色素と相補体、又は異なる目標レベルを有する細胞株の使用などの重要な試薬の変化は、濃度の有効範囲を移動させることができます。
統計解析は、標的結合にし、CDCの誘導の両方で、1つのアジアにおける市販のバイオシミラーリツキシマブのバッチと参照製品との違いを確認しました。なお、基準製品の各属性は、範囲を表示し、mAbの製造工程は厳密に制御された場合でも、それを考慮することが重要です。従って、同様の生物学的治療の評価の間に試験されるべきバッチの最小数が基準製品のばらつきの程度およびアッセイの変動4 .Thusに依存して、これらのプロトコルはdiffereに適用されなければなりません比較の評価時のNTバッチ。
提示方法がある限り、抗原を発現する細胞がアクセス可能であるとして、治療のmAb-ターゲットの他のペアに外挿することができます。 表1は、CDCの誘導が臨床効果に関連し、各mAbのために、以前に報告された細胞モデルの情報をコンパイルしているため、リツキシマブ以外の治療のmAb。
結論として、ここで説明する2つのアッセイは、ほとんどのラボでその実行を可能に、簡単、迅速、かつ安価です。方法は、バイオシミラー開発の初期段階の間、または製造時のバッチ間の比較のために規制当局の承認後に使用することができます。
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín、E.González-González、SMPérez-TapiaはUDIBIの従業員であり、いくつかの製薬会社のバイオシラディリティ研究を行っています。
Acknowledgments
著者は何の確認応答がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
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