Summary
Detta protokoll beskriver in vitro- jämförelsen av två viktiga funktionella egenskaper hos rituximab: målbindning och komplementberoende cytotoxicitet (CDC) induktion. Metoderna användes för jämförelse mellan referens rituximab och en rituximab jämförbar jämförelse mellan sidor och sidor. Dessa analyser kan användas under biosimilar utveckling eller som kvalitetskontroll i deras produktion.
Abstract
Terapeutiska monoklonala antikroppar (mAbs) är relevanta för behandling av olika patologier, inklusive cancer. Utvecklingen av biosimilar mAbs av läkemedelsföretag är ett marknadsmöjlighet, men det är också en strategi att öka tillgången till läkemedel och minska kostnaderna för terapi. De protokoll som beskrivs här beskriver beskrivningen av målbindning och CDC-induktion med rituximab i Daudi-celler. Dessa två funktioner kräver olika strukturella regioner av antikroppen och är relevanta för den kliniska effekt som induceras av rituximab. Protokollen möjliggör jämförelse av referensritualximab och en marknadsförd rituximab biosimilar jämförelse. De utvärderade produkterna visade skillnader både i målbindning och CDC-induktion, vilket tyder på att det finns underliggande fysikalisk-kemiska skillnader och framhäver behovet av att analysera effekterna av dessa skillnader i den kliniska miljön. Metoderna som rapporteras här är enkla och billiga in vitro </ Em> modeller för utvärdering av aktiviteten av rituximabbiosimilar. Således kan de vara användbara under biosimilar utveckling, liksom för kvalitetskontroll i biosimilar produktion. Vidare kan de presenterade metoderna extrapoleras till andra terapeutiska mAbs.
Introduction
Terapeutiska antikroppar är rekombinanta monoklonala antikroppar (mAbs) utvecklade för behandling av olika patologier, inklusive cancer, autoimmuna och kroniska sjukdomar, neurologiska störningar och andra 1 . För närvarande har FDA godkänt mer än 40 terapeutiska mAbs, och mer förväntas nå marknaden under de följande åren.
Rituximab är en chimär monoklonal IgG1-antikropp med hög affinitet godkänd för behandling av CD20 + B-cell-icke-Hodgkins lymfom (NHL), CD20 + follikel NHL, kronisk lymfocytisk leukemi och reumatoid artrit 2 , 3 . Anmärkningen av CD20, som överuttrycks i B-celler, genom rituximab inducerar apoptos; Komplement aktivering; Och antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC) 3 . Patenten av detta läkemedel utgick i Europa och i USA 2013 och 2016, Respektive. Således läkemedelsföretag runt om i världen utvecklar rituximab biosimilars. Som i alla andra läkemedel för livsmedel biosimilars kräver godkännande från tillsynsmyndigheter. Internationella riktlinjer anger att för mAbs bör biosimilarity demonstreras genom att jämföra fysikalisk-kemiska egenskaper, farmakokinetik, effekt och säkerhet av de nya och referensprodukter 4.
Följaktligen måste de metoder som används i sådana jämförelser bedöma de strukturella och funktionella egenskaperna hos de monoklonala antikropparna, särskilt de med klinisk relevans. I detta syfte, analyser in vitro visar flera fördelar jämfört med experiment in vivo (översikt i Chapman et al.) 5: i) in vitro-studier är mer känsliga för skillnader mellan den föreslagna biologiskt likartat och referensprodukten; ii) in vivo-studier måste utföras i relevanta arter, som för många mAbs äricke-humana primater; och iii) eftersom verkningsmekanismen, det prekliniska toxikologi, och de kliniska effekterna av referensprodukten är väl kända, in vivo-studier med biosimilars kanske inte ger ytterligare användbar information. Således EU: s Vägledning för biosimilars tillåter kandidater att komma in kliniska prövningar bygger på robust i enbart sex vitro-data.
Här presenterar vi två snabba, ekonomiska och enkla analyser som utvärderar den biologiska aktiviteten hos rituximab använder CD20 + odlade celler. Dessa analyser kan ingå som en del av jämförbarhet övning för rituximab biosimilar kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utvärdering av målbindning med flödescytometri
- Framställning av biologiska material och reagenser
- Gör 500 ml RPMI-odlingsmedium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (H-IFBS).
- Kultur Daudi Burkitts lymfom (Daudi) celler och Daudi GFP + -celler med användning av RPMI och 75 cm 2 odlingsflaskor. Håll kulturerna vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad atmosfär tills de når 6 - 9 x 10 ^ celler / ml.
- Gör 50 ml färgningsbuffert genom att späda 1/100 H-IFBS i PBS; Denna buffert är stabil vid 2-8 ° C under minst en månad.
- Förbered testlösningarna för referens- och biosimilar mAbs. Gör tio 1: 2 serieutspädningar (500 μl vardera) i färgningsbuffert, från 5 μg / ml.
- Använd färgpuffer till utspädd human IgG (isotypkontroll) till 5 μg / ml och PE-Cy5-mus anti-human IgG (sekundär antikropp) till conCentrering som föreslagits av tillverkaren.
- Bered 4% paraformaldehyd i PBS (fixeringsbuffert).
- Målbindning
- Samla Daudi- och Daudi GFP + -cellsuspensionerna från 75 cm 2 odlingsflaskorna och överför dem till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 400 xg i 5 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 5 ml PBS och centrifugera cellsuspensionen vid 400 xg under 5 min.
- Resuspendera cellerna i PBS och utföra en cellräkning och lönsamhetsanalys med trypanblå. Använd kulturer med celllevnadsnivåer ≥ 95% för analysen.
- Späd cellens suspension till 4 x 106 celler / ml med kall färgningsbuffert.
- I 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 50 μl av cellsuspensionen till 100 ul av de olika testkoncentrationerna av referens- eller biosimilar mAbs. Inkludera replikat för varje experimentellt tillstånd.
- Förbered ytterligare rör förisotypkontroll (human lgG1 stället för rituximab) och negativ kontroll (sekundär antikropp utan primär antikropp).
- Inkubera vid 4 ° C under 20 - 30 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml PBS och centrifugering av cellsuspensionen vid 400 xg under 5 min vid 10 ° C. Kassera supernatanten.
- Suspendera cellerna i 100 mikroliter av den sekundära antikroppen och inkubera under 20 - 30 min vid 4 ° C, skyddad från ljus.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS och suspendera dem i 200 ul av fixeringsbuffert.
- Analysera cellerna på en flödescytometer.
OBS: Signalen förblir stabil under flera dagar om proverna förvaras vid 4 ° C och skyddas från ljus.
- Datainsamling
- Öppna två punkt tomter på ett kalkylblad av flödescytometern operativsystem. Ställa in FSC-A kontra FSC-H i det första och det FSC-A kontra SSA-A i den andra. Öppna ett histogram för PE-Cy5 kanal.
- I FSC-A mot FSC-H-plot, gör en grind (R1) att välja singlethändelser ( Figur 1A ).
- Ställ in R1-populationen i FSC-A mot SSA-A-punkten och gör sedan en ny grind (R2) som väljer målceller ( Figur 1B ). Ställ in R2-populationen i PE-Cy5-intensitetshistogrammet för att se cellernas frekvensfördelning.
- Justera gränsen för lägre fluorescensintensitet (FI) för PE-Cy5-kanalen med hjälp av negativ och isotypkontroll ( Figur 1C ).
- Förvärva 10 000 händelser inom R2 från provet med den högre koncentrationen av referensprodukten. FI i detta prov bör vara den högsta förväntade ( Figur 1C ).
- Skaffa resten av proven.
- För varje prov får du median fluorescensintensiteten (MFI) i PE-Cy5-kanalen.
- För prover med referens eller biosimilar mAb, beräkna skillnaden mellan prov MFI och den för isotypkontrollen (ΔMFI).
2. Bedömning av CDC
- Beredning av biologiska material och reagenser
- Förbereda cellodlingsmedium och kultur Daudi och Daudi GFP + celler såsom beskrivits ovan (steg 1.1.1 - 1.1.2).
OBS! Dessutom kräver CDC-analysen serumfritt RPMI. - Utspädd normalt humant serumkomplement (NHSC) 1: 2 med serumfritt RPMI. Förbereda 2,5 ml.
- Förbereda en ml värmeinaktiverat (30 min / 56 ° C) NHSC späddes 1: 2 med RPMI.
- Förbereda uppsättningar av tester lösningar för referens- och biologiskt likartade mAbs i serumfritt RPMI. Göra tio spädningar (200 pl vardera) från 1 till 0,025 pg / ml.
- Förbereda cellodlingsmedium och kultur Daudi och Daudi GFP + celler såsom beskrivits ovan (steg 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC-analysen
- Samla Daudi och Daudi GFP + celler från odlingarna och kvantifiera cellviabiliteten (se steg 1.2.1 - 1.2.3).
- Framställa en cellsuspension med 4 x 10 5 celler / ml i serumfritt RPMI.
- Lägg till50 mikroliter av cellsuspension till 50 mikroliter av varje referens- eller jämförbart biologiskt mAb testkoncentration i 96-brunnars konisk (V) -bottom mikroplattor. Inkludera replikat för varje experimentell skick.
- Förbereda ytterligare brunnar för den negativa kontrollen (dvs utan mAb), basaldödskontroll (dvs värmeinaktiverat NHSC i närvaro av mAb), och färgning positiv kontroll (dvs. celler som exponerats för 50 mikroliter av 70% EtOH).
- Inkubera cellerna i 20 - 30 minuter vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad atmosfär.
- Lägga 50 mikroliter av NHSC (utspädd 1: 2) till varje brunn och inkubera de opsoniserade cellerna under 2,5 timmar vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad atmosfär. Använd värmeinaktiv NHSC i de basala död kontrollbrunnarna.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 10 ° C. Kassera supernatanten.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 150 mikroliter av PBS och centrifugering av cellsuspensionen i 5 min vid 400 xg och 10 ° C. diAvlägsna supernatanten.
- Färga proverna med 7-aminoaktinomycin (7-AAD), som tidigare beskrivits 7 , 8 .
- Analysera cellerna på en flödescytometer på samma dag.
- Datainsamling
- Öppna två punkter i ett arbetsblad i operationscykeln för flödescytometern. Ställ in dessa tomter som i steg 1.3.1 - 1.3.3 ( Figur 2A-B ). Skapa en tredje plot som är en prickplott för GFP kontra 7-AAD på R2-populationen.
- Definiera adekvata FI-gränser med hjälp av Daudi-celler, Daudi GFP + -celler och dödspositiv kontroll ( Figur 2C ).
- För varje prov mäter du procentandelen av 7-AAD + målceller. Skaffa minst 5000 händelser från R2.
- Beräkna den specifika mAb-inducerad cytotoxiciteten genom att subtrahera andelen 7-AAD + i den basala dödskontrollen från den procentandel som finns i prover med olikaent koncentrationer av mAbs (Figur 2D).
3. Biosimilarity Analys
- Ange koncentrationsvärdena och svars i en graf programvara.
- Generera grafer och beräkna icke-linjära regressioner med följande överväganden: i) använda log-transformering av mAb koncentration såsom "X"; ii) använda variabel lutning matematisk modell (Y = minimal respons + (maximal respons - minsta respons) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * Hill-lutning)); och iii) begränsa de undre värdena till noll, eftersom den basala svar har subtraherats.
OBS: kurvor med en symmetrisk sigmoidal form förväntas. - Jämför både icke-linjära passar med en global passning med hjälp av en F-test (många graf program inkluderar denna funktion).
OBS: Sådana tester fastställa som nollhypotesen att den maximala responsen, logEC 50, och Hill-lutningen är desamma för de två datauppsättningar, vilket matcharbiologisk fråga avsedd att tas upp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av de protokoll som beskrivs ovan, målbindande och CDC induktion av referens rituximab jämfördes parallellt med de hos ett jämförbart biologiskt rituximab produceras och kommersiellt tillgängliga i Asien.
I Daudi-celler, båda mAb bundet CD20 på ett koncentrationsberoende sätt (figur 1D). Icke-linjära regressioner av bindningsdata visade ett r 2 av 0,978 och 0,848 för referens och jämförbart biologiskt rituximab, respektive (figur 1E). Statistisk analys av koncentration-responskurvor visade att de, och därmed de farmakodynamiska parametrarna som beräknats från dem, är signifikant olika mellan mAbs (P <0,0001). Det maximala svaret för biologiskt likartat var 2,16 gånger lägre än den för referensprodukten. Dessa resultat tyder på att de två utvärderade mAbs har olika kapacitet att binda CD20 uttrycks på migmbrane av leukemiska celler.
CDC induktion var också jämfört med de två mAbs. Referens- och biologiskt likartade produkter stimulerade CDC i Daudi-celler på ett koncentrationsberoende sätt (Figur 2E). Viktigare, de koncentrationer vid vilka de mAb inducerade CDC var annorlunda än de som krävs för målbindande. Icke-linjära regressionsanalys av CDC data visade r 2> 0,980 för båda produkterna. Den statistiska jämförelsen av koncentration-responskurvor indikerade att de är signifikant olika (P <0,01), vilket gör den biologiskt likartat mindre potent. Dessa data tyder på att förmågan att framkalla CDC är olika för de analyserade mAbs.
Figur 1. In vitro Target-bindning av anti-CD20 Terapeutisk mAbs. Daudi GFP + -celler exponerades för skiljerent koncentrationer av mAb (4,8 ng / ml till 5 ^ g / ml) och färgades sedan med PE-Cy5-konjugerad anti-human sekundär antikropp. Fluorescensintensitet (FI) mättes genom flödescytometri på enstaka händelser (A), med storlek och granularitet motsvarande de för de Daudi-celler (B). Ofärgade celler (ljusgrå), isotyp kontroller (mörkgrå) och 5 | ig / ml av referens rituximab (blå) användes för att ställa in FI gränser (C). Båda utvärderade mAb bundet Daudi-celler på ett koncentrationsberoende sätt (D). Svar (ΔMFI; se text) användes för att generera koncentrations-responskurvor för referens (blå) eller biologiskt likartat (svart) rituximab (E). Statistisk jämförelse av de icke-linjära regressioner uppvisade skillnader mellan mAbs (P <0,0001; Fisher exakt test). Klicka här för att se en större versiom av denna figur.
Figur 2. CDC Induktion av anti-CD20 Therapeutic mAbs. Daudi GFP + celler opsoniserade med olika koncentrationer av mAb exponerades för humant komplement. Celldöd utvärderades genom 7-AAD-färgning och flödescytometrisk analys av fluorescensintensitet (FI) på enstaka händelser (A), med storlek och granularitet motsvarande de Daudi-celler (B). Ofärgade GFP- (svart) och GFP + (gröna) cellerna och etanol dödade celler (röd) inkluderades som kontroller (C). Kvantifiering av de 7-AAD + celler i de basala-dödskontroll (grå) och rituximab prover (blå) tillåts för beräkningen av mAb-inducerad cytotoxicitet (D). Koncentration-responskurvor som erhållits för referens (blå) eller biologiskt likartat (svart) rituximab (E). Statistisk jämförelse av de icke-linjära regressioner uppvisade skillnader mellan responserna inducerade av de två mAb (P <0,01; Fisher exakt test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Monoklonala antikroppar Godkänd för terapeutisk användning, med målceller för CDC-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patentutlösen av en terapeutisk mAb är att främja utvecklingen av biosimilar. Det finns således ett behov av enkla metoder som kan identifiera skillnader i kliniskt relevanta aktiviteter hos dessa produkter. CD20 + odlade celler användes för utvärdering av två viktiga funktionella egenskaper hos rituximab: målbindning och CDC-induktion. Den tidigare aktiviteten kräver erkännande av CD20 av Fab-regionen i mAb, medan den senare beror huvudsakligen på interaktionen mellan Fc-regionen och dess komplement 9 . Därför tillhandahåller dessa analyser ett sätt att länka de strukturella och funktionella egenskaperna hos mAbs.
Målbindningen av terapeutiska mAbs utvärderas vanligtvis genom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR) eller biolaginterferometri 10 , 11 , 12 . Dessa analyser tillåter afFinitetsberäkning, men de kräver specialutrustning och träning. Protokollet som beskrivs här utvärderar målbindning i en sida-till-sida-jämförelse för att identifiera skillnader mellan produkter, även utan affinitetsdata. Metoden är enkel och använder ett relevant cellulärt sammanhang för aktivitetsbedömning. Å andra sidan kan CDC-induktion med rituximab utvärderas med ATP-mätning 13 , kvantifieringen av frigjort laktatdehydrogenas (LDH) 14 eller alamarBlue 15 och MTT-analyser 16 . Metoden som rapporteras här, med användning av 7-AAD-färgning, har en låg bakgrund och kan kombineras med andra fläckar för multiparametrisk flödescytometrisk analys.
I de representativa experimenten som presenterades monterade dos-responskurvorna fyraparameters logistikmodell, vilket möjliggör beräkning av EC 50 , Hill-höjden och maximal respons. I synnerhet koncentrationsområdenaons används för att generera sådana kurvor var olika för varje analys, belyser vikten av att analysera och definiera lämpliga intervall i preliminära experiment. Förändringar i viktiga reagens, såsom fluorokromer och komplement, eller användning av en cellinje med en annan målnivå, kan förskjuta det effektiva området av koncentrationer.
Statistisk analys identifierade skillnaderna mellan en sats av ett biologiskt likartat rituximab kommersiellt tillgänglig i Asien och referensprodukten, både i målbindande och i CDC induktion. Det är viktigt att tänka på att även när tillverkningsprocessen av mAbs är hårt kontrollerad, varje egenskap hos referensprodukten uppvisar ett intervall. I enlighet därmed, det minsta antal satser som bör testas under utvärderingen av en liknande bioterapeutiska beror på omfattningen av variation av referensprodukten och på analys variabilitet 4 .Thus, måste dessa protokoll tillämpas på different satser under utvärdering av jämförbarhet.
De presenterade metoderna kan extrapoleras till andra par av terapeutiska mAbs-mål, så länge som de celler som uttrycker antigenet är åtkomliga. Tabell 1 listar terapeutiska andra än rituximab som CDC induktion är relevant för den kliniska effekten och sammanställer information om tidigare rapporterade cellulära modeller för varje mAb mAbs.
Sammanfattningsvis, de två analyser som beskrivs här är enkel, snabb och billig, vilket möjliggör deras genomförande i de flesta laboratorier. Metoderna kan användas under tidiga stegen av biologiskt likartat utveckling eller efter godkännande för sats till sats jämförelse under produktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González och SM Pérez-Tapia är anställda i UDIBI, som utför biosimilarity studier för flera läkemedelsföretag.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
