Summary
يصف هذا البروتوكول المقارنة في المختبر من اثنين من الخصائص الوظيفية الرئيسية لريتوكسيماب: الهدف ملزمة والسمية الخلوية (CDC) الحث تعتمد تكمل. وقد استخدمت أساليب مقارنة جنبا إلى جنب بين ريتوكسيماب مرجعية وبدائل حيوية ريتوكسيماب. هذه المقايسات يمكن استخدامها خلال تطوير بدائل حيوية أو لمراقبة الجودة في إنتاجها.
Abstract
الاجسام المضادة العلاجية (MABS) هي ذات الصلة لعلاج الأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. تطوير MABS بدائل حيوية من قبل شركات الأدوية هي فرصة السوق، ولكنها أيضا استراتيجية لزيادة إمكانية الوصول المخدرات والحد من التكاليف المرتبطة العلاج. البروتوكولات بالتفصيل هنا تصف تقييم هدف ملزم وCDC تحريض من قبل ريتوكسيماب في الخلايا داودي. تتطلب هذه الوظائف منطقتين هيكلية مختلفة من الأجسام المضادة وهي ذات الصلة الاثر السريري الناجم عن ريتوكسيماب. البروتوكولات تسمح للمقارنة جنبا إلى جنب من ريتوكسيماب مرجعية وبدائل حيوية ريتوكسيماب تسويقها. وأظهرت المنتجات تقييم الاختلافات في كل من هدف ملزم وCDC تحريض، مما يوحي بأن هناك اختلافات الفيزيائية الأساسية وتسليط الضوء على الحاجة إلى تحليل أثر هذه الاختلافات في إعداد سريرية. الأساليب ذكرت هنا تمثل بسيطة وغير مكلفة في المختبر </ em> نماذج لتقييم نشاط البدائل الحيوية ريتوكسيماب. وبالتالي، فإنها يمكن أن تكون مفيدة خلال تطوير بدائل حيوية، فضلا عن مراقبة الجودة في إنتاج بدائل حيوية. وعلاوة على ذلك، وأساليب عرض يمكن استقراء لMABS العلاجية الأخرى.
Introduction
الأجسام المضادة العلاجية هي الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المؤتلف (مابس) وضعت لعلاج أمراض مختلفة، بما في ذلك السرطان، المناعة الذاتية والأمراض المزمنة، واضطرابات عصبية، وغيرها 1 . حاليا، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير الموافقة على أكثر من 40 مابس العلاجية، وأكثر من المتوقع أن تصل إلى السوق في السنوات التالية.
ريتوكسيماب هو عالية تقارب خيالية أحادي النسيلة IgG1 الأجسام المضادة المعتمدة لعلاج CD20 + B خلية سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين (نهل)، CD20 + نهل الجريبي، سرطان الدم الليمفاوي المزمن، والتهاب المفاصل الروماتويدي 2 ، 3 . الاعتراف CD20، أوفيركسرسد في الخلايا ب، من قبل ريتوكسيماب يدفع موت الخلايا المبرمج. تكملة التنشيط؛ والخلايا التي تعتمد على الأجسام المضادة السمية الخلوية (أدسك) 3 . براءات الاختراع من هذا الدواء انتهت في أوروبا والولايات المتحدة في 2013 و 2016على التوالي. وهكذا، شركات الأدوية في جميع أنحاء العالم على تطوير البدائل الحيوية ريتوكسيماب. كما هو الحال في أي عقار آخر للاستهلاك البشري، البدائل الحيوية تتطلب موافقة من الهيئات التنظيمية. وتشير المبادئ التوجيهية الدولية التي لMABS، يجب أن يظهر biosimilarity بمقارنة خصائص الفيزيائية، الدوائية، فعالية، وسلامة المنتجات الجديدة والمرجعية 4.
وفقا لذلك، يجب على المنهجيات المستخدمة في مثل هذه المقارنات تقييم الخصائص الهيكلية والوظيفية للMABS، وخاصة تلك التي لها صلة السريرية. تحقيقا لهذه الغاية، فحوصات في المختبر تظهر العديد من المزايا في التجارب المجراة (إعادة النظر في تشابمان وآخرون.) 5: أ) في الدراسات المختبرية هي أكثر حساسية للاختلافات بين المنتج بدائل حيوية والإشارة المقترحة؛ ب) الدراسات المجراة يجب أن يؤديها في الأنواع ذات الصلة، والتي لكثير من MABS لالرئيسيات غير البشرية. والثالث) منذ آلية العمل، وعلم السموم قبل السريرية، والآثار السريرية من الناتج إشارة معروفة، الدراسات المجراة مع البدائل الحيوية قد لا توفر معلومات إضافية مفيدة. وفقا لذلك، توجيه الاتحاد الأوروبي لالبدائل الحيوية يسمح المرشحين لدخول التجارب السريرية على أساس قوي في بيانات المختبر وحده 6.
هنا، نقدم اثنين من فحوصات سريعة واقتصادية وبسيطة أن تقييم النشاط البيولوجي للريتوكسيماب باستخدام CD20 + الخلايا المستزرعة. يمكن تضمين هذه المقايسات كجزء من ممارسة المقارنة للمرشحين بدائل حيوية ريتوكسيماب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تقييم الهدف ربط بواسطة التدفق الخلوي
- إعداد المواد البيولوجية والكواشف
- جعل 500 مل من وسط ثقافة رمي تستكمل مع 10٪ مصل الدم البقري الجنين المعطل (H-إفبس).
- ثقافة داودي بوركيت خلايا الغدد الليمفاوية (داودي) وخلايا دودي غفب + باستخدام رمي و 75 سم 2 قوارير الثقافة. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 جو مرطب حتى تصل إلى 6 - 9 × 10 5 خلايا / مل.
- جعل 50 مل من تلطيخ العازلة عن طريق تمييع 1/100 H- إيفس في برنامج تلفزيوني. هذا العازلة مستقرة في 2-8 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
- إعداد حلول الاختبار للمرجعية و مبس مشابهة. جعل عشرة 1: 2 التخفيفات المسلسل (500 ميكرولتر لكل منهما) في العازلة تلطيخ، بدءا من 5 ميكروغرام / مل.
- استخدام العازلة تلطيخ لتخفيف إيغ الإنسان (السيطرة إيزوتيب) إلى 5 ميكروغرام / مل و بي-Cy5 الماوس إيغ لمكافحة الإنسان (الأجسام المضادة الثانوية) إلى يخدعوحدانية التركيز المقترح من قبل المصنع.
- إعداد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (عازلة التثبيت).
- هدف ملزم
- جمع داودي وتعليق خلية داودي GFP + من قوارير ثقافة 75 سم 2 ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
- غسل الخلايا بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني وإجراء تعداد خلايا وتحليل الجدوى مع الأزرق التريبان. استخدام الثقافات مع مستويات بقاء الخلية ≥ 95٪ للتحليل.
- تمييع تعليق خلية إلى 4 × 10 6 خلية / مل مع العازلة تلطيخ الباردة.
- في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 100 ميكرولتر من تركيزات مختلفة من اختبار الإشارة أو MABS بدائل حيوية. تشمل مكررات لكل حالة تجريبية.
- إعداد أنابيب إضافية ل(IGG1 الإنسان بدلا من ريتوكسيماب) والسيطرة السلبية (الأجسام المضادة الثانوية دون الأجسام المضادة الأولية).
- احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 20 - 30 دقيقة.
- غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق الخلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 20 - 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتعليقها في 200 ميكرولتر من العازلة التثبيت.
- تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: تظل إشارة مستقرة لعدة أيام إذا تم تخزين العينات في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء.
- الحصول على البيانات
- فتح اثنين من النقاط المؤامرة على ورقة عمل من برنامج تشغيل التدفق الخلوي. تعيين فسك-A مقابل فسك-H في الأولى و فسك-A مقابل سا-A في الثانية. افتح مخطط بياني لقناة بي-Cy5.
- في FSC-A مقابل FSC-H مؤامرة، وجعل باب (R1) اختيار الأحداث القميص (الشكل 1A).
- تعيين السكان R1 في FSC-A مقابل SSA-A دوت مؤامرة ثم جعل بوابة جديدة (R2) تحديد الخلايا المستهدفة (الشكل 1B). تعيين السكان R2 في الرسم البياني PE-Cy5 كثافة لعرض توزيع تردد من الخلايا.
- ضبط حد أدنى كثافة مضان (FI) للقناة PE-Cy5 باستخدام السيطرة السلبية ونمط إسوي (الشكل 1C).
- الحصول على 10000 الأحداث داخل R2 من العينة مع تركيز أعلى من الناتج إشارة. وينبغي أن يكون FI من هذه العينة أعلى من المتوقع (الشكل 1C).
- الحصول على بقية العينات.
- لكل عينة، احصل على كثافة مضان متوسط (MFI) في قناة PE-Cy5.
- للعينات مع الإشارة أو بدائل حيوية ماب، حساب الفرق بين عينة مؤسسات التمويل الأصغر وذلك من isotype السيطرة (ΔMFI).
2. تقييم CDC
- إعداد المواد البيولوجية والكواشف
- إعداد الخلايا خلية ثقافة متوسطة والثقافة داودي وداودي GFP + كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.1 - 1.1.2).
ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، فحص CDC يتطلب RPMI المصل خالية. - تمييع العادي تكملة المصل البشري (NHSC) 1: 2 مع خالية من المصل RPMI. إعداد 2.5 مل.
- إعداد 1 مل من الحرارة المعطل (30 دقيقة / 56 ° C) NHSC المخفف 1: 2 مع RPMI.
- إعداد مجموعة من الاختبارات حلول للمرجعية وMABS بدائل حيوية في RPMI المصل خالية. إجراء عشر التخفيفات (200 ميكرولتر لكل منهما) 1-،025 ميكروغرام / مل.
- إعداد الخلايا خلية ثقافة متوسطة والثقافة داودي وداودي GFP + كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC فحص
- جمع الخلايا داودي وداودي GFP + من الثقافات وتحديد بقاء الخلية (انظر الخطوات 1.2.1 - 1.2.3).
- إعداد تعليق الخلية مع 4 × 10 5 خلية / مل في RPMI المصل خالية.
- إضافة50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 50 ميكرولتر من كل مرجع أو بيوسيميلار تركيز تركيز ماب في 96-جيدا مخروطي (V) -الفلتر الصغير. تضمين النسخ المتماثلة لكل حالة تجريبية.
- إعداد آبار إضافية للسيطرة السلبية ( أي بدون ماب)، والسيطرة على الموت القاعدية ( أي الحرارة معطل نهسك في وجود ماب)، وتلطيخ السيطرة الإيجابية ( أي الخلايا المعرضة ل 50 ميكرولتر من إتوه 70٪).
- احتضان الخلايا لمدة 20 - 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 جو مرطب.
- إضافة 50 ميكرولتر من نسك (المخفف 1: 2) إلى كل بئر واحتضان الخلايا أوبوسونيزد لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 2٪ ترطيب كو 2 ٪. استخدام الحرارة المعطلة نهسك في الآبار القاعدية لمراقبة الموت.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- غسل الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 400 x ج و 10 درجة مئوية. ديscard طاف.
- وصمة عار على عينات مع 7-aminoactinomycin (7-AAD)، كما هو موضح سابقا 7 و 8.
- تحليل الخلايا على عداد الكريات تدفق في نفس اليوم.
- الحصول على البيانات
- فتح اثنين الدوت المؤامرات على ورقة عمل لقياس التدفق الخلوي برنامج التشغيل. وضع هذه المؤامرات كما في الخطوات 1.3.1 - 1.3.3 (الشكل 2A-B). إنشاء مؤامرة الثالثة التي هي مؤامرة نقطة لGFP مقابل 7-AAD على السكان R2.
- تعريف حدود FI كافية باستخدام خلايا داودي، داودي GFP + الخلايا، ومراقبة إيجابية الموت (الشكل 2C).
- لكل عينة، وقياس النسبة المئوية للخلايا 7-AAD + الهدف. الحصول على ما لا يقل عن 5000 من الأحداث R2.
- حساب سمية الخلايا المحددة الناجمة عن ماب-بطرح نسبة 7-AAD + في السيطرة الموت القاعدية من نسبة جدت في عينات مع تختلفوتركيزات إنت من مابس ( الشكل 2D ).
3. تحليل بيوسيماليتي
- أدخل قيم التركيز والاستجابة في برنامج رسوم بيانية.
- توليد الرسوم البيانية وحساب الانحدارات غير الخطية مع الاعتبارات التالية: 1) استخدام سجل التحول من تركيز ماب كما "X". 2) استخدام النموذج الرياضي المنحدر المتغير (Y = الحد الأدنى من الاستجابة + (الاستجابة القصوى - الحد الأدنى من الاستجابة) / 1 + 10 ^ ((لوجيك 50 -X) * منحدر هيل))؛ و 3) تقييد القيم السفلية إلى الصفر، حيث تم طرح الاستجابة القاعدية.
ملاحظة: ومن المتوقع المنحنيات مع شكل سيني متناظرة. - قارن كل من غير الخطية يناسب مع تناسب عالمي باستخدام اختبار F (العديد من برامج الرسوم البيانية وتشمل هذه الميزة).
ملاحظة: هذه الاختبارات تنص على فرضية نول أن الاستجابة القصوى، لوجيك 50 ، ومنحدر هيل هي نفسها لمجموعتي البيانات، والذي يطابقمسألة بيولوجية يعتزم معالجتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تستهدف ملزمة وتمت مقارنة تحريض CDC ريتوكسيماب إشارة بالتوازي مع تلك ريتوكسيماب بدائل حيوية تنتج ومتاحة تجاريا في آسيا.
في الخلايا داودي، سواء MABS ملزمة CD20 بطريقة تعتمد على التركيز (1D الشكل). عرض الانحدار غير الخطية من البيانات ملزمة لص 2 من 0،978 و0.848 لتكون مرجعا وريتوكسيماب بدائل حيوية، على التوالي (الشكل 1E). وأظهر التحليل الإحصائي للمنحنيات التركيز على الاستجابة أنهم، وبالتالي المعلمات الدوائية تحسب منها، تختلف اختلافا كبيرا بين MABS (P <0.0001). وكانت الاستجابة القصوى للبدائل حيوية 2.16 أضعاف أقل من المنتج المرجعية. وتشير هذه النتائج إلى أن اثنين من MABS تقييم لها قدرات مختلفة لربط أعرب CD20 على ليmbrane خلايا اللوكيميا.
كان CDC الاستقراء أيضا بالمقارنة مع MABS اثنين. المرجعية وبدائل حيوية المنتجات حفزت CDC في الخلايا داودي بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 2E). الأهم من ذلك، كانت التركيزات التي وMABS يسببها CDC مختلفة عن تلك المطلوبة لملزما الهدف. وأظهرت الانحدار غير الخطية للبيانات CDC ص 2> 0.980 لكل من المنتجات. وأشارت المقارنة الإحصائية للمنحنيات التركيز على الاستجابة أنها تختلف اختلافا كبيرا (P <0.01)، مما يجعل بدائل حيوية أقل قوة. وتشير هذه البيانات إلى أن القدرة على إحداث CDC مختلفة لMABS تحليلها.
الشكل 1. في المختبر الهدف الملزم من مكافحة CD20 العلاجية MABS. وتعرض خلايا داودي GFP + تختلفتركيزات الأنف والحنجرة من MABS (4.8 نانوغرام / مل إلى 5 ميكروغرام / مل) ثم ملطخة الضد الثانوية مكافحة الإنسان-PE Cy5 مترافق. وقد تم قياس كثافة مضان (FI) من خلال التدفق الخلوي على أحداث واحدة (A)، مع حجم وتحبب مماثلة لتلك الخلايا داودي (B). تم توظيف خلايا غير ملوثين (رمادي فاتح)، وضوابط نمط إسوي (رمادي غامق)، و 5 ميكروغرام / مل من الإشارة ريتوكسيماب (الأزرق) لتعيين حدود FI (C). كلا MABS تقييم ملزمة خلايا داودي بطريقة تعتمد على التركيز (D). واستخدمت لتوليد منحنيات التركيز على الاستجابة لإشارة (الأزرق) أو بدائل حيوية (أسود) ريتوكسيماب (E)؛ الردود (انظر النص ΔMFI). وأظهرت الاحصائية المقارنة بين الانحدارات غير الخطية الخلافات بين MABS (P <0.0001؛ فيشر اختبار دقيق). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.
الشكل 2. CDC التعريفي كتبها مكافحة CD20 العلاجية MABS. تعرضت خلايا داودي GFP + opsonized مع تركيزات مختلفة من MABS لتكملة البشري. تم تقييم موت الخلايا بنسبة 7-AAD تلطيخ وتحليل تدفق cytometric من كثافة مضان (FI) على الأحداث واحدة (A)، مع حجم وتحبب المقابلة لخلايا داودي (B). أدرجت GFP- غير ملوثين (أسود) والخلايا (الأخضر) GFP + والخلايا قتل الإيثانول (الحمراء) والضوابط (C). الكمي ل7-AAD + الخلايا في السيطرة القاعدية الموت (الرمادي) وعينات ريتوكسيماب (الأزرق) يسمح لحساب سمية الخلايا التي يسببها ماب (D). منحنيات التركيز على الاستجابة التي تم الحصول عليها كمرجع (الأزرق) أو بدائل حيوية (أسود) ريتوكسيماب (E). وأظهرت الاحصائية المقارنة بين الانحدارات غير الخطية الفروق بين استجابات الناجمة عن اثنين من MABS (P <0.01، فيشر اختبار دقيق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. وحيدة النسيلة الأجسام المضادة المعتمدة لأغراض علاجية، مع خلايا المستهدفة للCDC الفحص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن انتهاء صلاحية براءة اختراع ماب العلاجي هو تشجيع تطوير بيوسيميالز. وبالتالي، هناك حاجة إلى أساليب بسيطة يمكن أن تحدد الاختلافات في الأنشطة ذات الصلة سريريا من هذه المنتجات. تم استخدام CD20 + الخلايا المستزرعة لتقييم اثنين من الخصائص الوظيفية الرئيسية لل ريتوكسيماب: الهدف ملزمة و سدك الحث. النشاط السابق يتطلب الاعتراف CD20 من قبل منطقة فاب من ماب، في حين أن هذا الأخير يعتمد أساسا على التفاعل من منطقة فك مع تكملها 9 . لذلك، هذه المقايسات توفر وسيلة لربط الخصائص الهيكلية والوظيفية لل مابس.
وعادة ما يتم تقييم الهدف ملزم مابس العلاجية من قبل قياس الحرارة المعايرة متساوي الحرارة (إيتس)، الرنين سطح بلاسمون (سير)، أو التداخل بيولاير 10 ، 11 ، 12 . هذه المقايسات تسمح أفولكنها تحتاج إلى معدات متخصصة وتدريب. بروتوكول الموصوفة هنا يقيم الهدف ربط في المقارنة جنبا إلى جنب لتحديد الاختلافات بين المنتجات، حتى من دون بيانات تقارب. طريقة بسيطة وتوظف السياق الخلوي ذات الصلة لتقييم النشاط. من ناحية أخرى، سدك تحريض بواسطة ريتوكسيماب يمكن تقييمها من قبل أتب قياس 13 ، الكمي من نازعة اللاكتات صدر (لد) 14 أو ألاماربلو 15 ، وفحوصات مت 16 . الطريقة المذكورة هنا، وذلك باستخدام تلطيخ 7-آد، لديه خلفية منخفضة، ويمكن دمجها مع البقع الأخرى لتحليل تدفق سايتوميتريك متعدد الحلبات.
في التجارب التمثيلية المقدمة، منحنيات الجرعة والاستجابة تركيب نموذج لوجستي أربعة المعلمة، والسماح لحساب إيك 50 ، المنحدر هيل، والاستجابة القصوى. والجدير بالذكر أن نطاقات كونسنتراتيكان استخدام هذه المنحنيات مختلفا في كل مقايسة، مما يبرز أهمية تحليل وتحديد نطاقات كافية في التجارب الأولية. قد تؤدي التغيرات في الكواشف الرئيسية، مثل الفلوروكرومات والمكملات، أو استخدام خط خلية بمستوى مستهدف مختلف، إلى تهجير النطاق الفعال للتركيزات.
وحدد التحليل الإحصائي الاختلافات بين دفعة واحدة من ريتوكسيماب بيوسيميلار المتاحة تجاريا في آسيا والمنتج المرجعي، سواء في ربط الهدف وفي سدك الحث. من المهم أن نعتبر أنه حتى عندما يتم التحكم في عملية التصنيع من مابس بإحكام، كل سمة من المنتج المرجعي يعرض مجموعة. وبناء على ذلك، فإن الحد الأدنى لعدد الدفعات التي يجب اختبارها خلال تقييم العلاج الحيوي مماثل يعتمد على مدى تقلب المنتج المرجعي وعلى تقلب الفحص 4.وهكذا، يجب أن تطبق هذه البروتوكولات إلى ديفيرنت دفعات خلال تقييم قابلية المقارنة.
ويمكن استنباط الأساليب المعروضة إلى أزواج أخرى من أهداف مابس العلاجية، طالما أن الخلايا التي تعبر عن مستضد يمكن الوصول إليها. الجدول 1 يسرد مابس العلاجية بخلاف ريتوكسيماب التي تحريض سدك ذات الصلة إلى الفعالية السريرية ويجمع المعلومات عن النماذج الخلوية المبلغ عنها سابقا لكل ماب.
في الختام، المقايسات الموصوفة هنا بسيطة وسريعة وغير مكلفة، مما يسمح لتنفيذها في معظم المختبرات. ويمكن استخدام الأساليب خلال الخطوات المبكرة من التطور الحيوي أو بعد الموافقة التنظيمية لمقارنة الدفعة إلى الدفعة أثناء الإنتاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. ساليناس، ياسمين، E. غونزاليس غونزاليس، وSM بيريز تابيا هم موظفون من UDIBI، الذي يؤدي الدراسات biosimilarity لعدة شركات الأدوية.
Acknowledgments
الكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
