Summary
Este protocolo describe la comparación in vitro de dos características funcionales clave del rituximab: la unión al diana y la inducción de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos se emplearon para una comparación lado a lado entre el rituximab de referencia y un biosimilar de rituximab. Estos ensayos se pueden emplear durante el desarrollo biosimilar o como un control de calidad en su producción.
Abstract
anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) son relevantes para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo los cánceres. El desarrollo de anticuerpos monoclonales biosimilares por las compañías farmacéuticas es una oportunidad de mercado, pero también es una estrategia para aumentar la accesibilidad de drogas y reducir los costes asociados a la terapia. Los protocolos detallados aquí describen la evaluación de unión a la diana y la inducción CDC por rituximab en células Daudi. Estas dos funciones requieren diferentes regiones estructurales del anticuerpo y son relevantes para el efecto clínico inducida por rituximab. Los protocolos permiten la comparación de lado a lado de un rituximab referencia y un biosimilar rituximab comercializado. Los productos evaluados mostraron diferencias tanto en unión a la diana y la inducción CDC, lo que sugiere que hay diferencias fisicoquímicas subyacentes y poner de relieve la necesidad de analizar el impacto de esas diferencias en el entorno clínico. Los métodos aquí presentados constituyen simple y barato in vitro </ Em> para la evaluación de la actividad de rituximab biosimilares. Por lo tanto, pueden ser útiles durante el desarrollo biosimilar, así como para el control de calidad en la producción biosimilar. Además, los métodos presentados pueden extrapolarse a otros mAbs terapéuticos.
Introduction
Los anticuerpos terapéuticos son anticuerpos monoclonales recombinantes (mAbs) desarrollados para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes y crónicas, trastornos neurológicos y otros 1 . Actualmente, la FDA ha concedido la aprobación a más de 40 mAb terapéuticos, y se espera que lleguen más al mercado en los años siguientes.
Rituximab es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidad aprobado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de células B CD20 + , LNH folicular CD20 + , leucemia linfocítica crónica y artritis reumatoide 2 , 3 . El reconocimiento de CD20, que está sobreexpresado en células B, por rituximab induce apoptosis; activación del complemento; Y citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) 3 . Las patentes de este fármaco expiraron en Europa y en los EE.UU. en 2013 y 2016, Respectivamente. Así, las compañías farmacéuticas en todo el mundo están desarrollando biosimilares de rituximab. Como en cualquier otro medicamento para consumo humano, los biosimilares requieren la aprobación de las agencias reguladoras. Directrices internacionales indican que para los mAbs, la biosimilaridad debe demostrarse mediante la comparación de las características físico-químicas, farmacocinéticas, la eficacia y la seguridad de los productos nuevos y de referencia [ 4] .
Por consiguiente, las metodologías utilizadas en tales comparaciones deben evaluar las características estructurales y funcionales de los mAb, especialmente aquellos con relevancia clínica. Para ello, los ensayos in vitro muestran varias ventajas sobre los experimentos in vivo (revisados en Chapman et al. ) 5 : i) los estudios in vitro son más sensibles a las diferencias entre el biosimilar propuesto y el producto de referencia; Ii) deben realizarse estudios in vivo en especies relevantes, que para muchos mAbs sonPrimates no humanos; Y iii) ya que el mecanismo de acción, la toxicología preclínica y los efectos clínicos del producto de referencia son bien conocidos, los estudios in vivo con biosimilares pueden no proporcionar información útil adicional. En consecuencia, la Orientación de la Unión Europea para biosimilares permite a los candidatos a entrar en ensayos clínicos basados en sólidos datos in vitro sólo [ 6] .
Presentamos dos ensayos rápidos, económicos y sencillos que evalúan la actividad biológica de rituximab utilizando células cultivadas con CD20 + . Estos ensayos pueden incluirse como parte del ejercicio de comparabilidad para los candidatos biosimilares de rituximab.
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Protocol
1. Evaluación de la unión de diana por citometría de flujo
- Preparación de materiales biológicos y reactivos
- Hacer 500 mL de medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (H-IFBS).
- Cultivo de linfoma Daudi Burkitt (Daudi) y células Daudi GFP + usando RPMI y frascos de cultivo de 75 cm2. Mantener los cultivos a 37 ° C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 hasta que alcancen 6 - 9 x 105 células / ml.
- Hacer 50 ml de tampón de tinción diluyendo 1/100 H-IFBS en PBS; Este tampón es estable a 2-8 ° C durante al menos un mes.
- Preparar las soluciones de prueba para los mAbs biosimilares y de referencia. Hacer diez diluciones en serie 1: 2 (500 μ l cada uno) en el tampón de tinción, a partir de 5 μ g / mL.
- Utilizar tampón de tinción para diluir la IgG humana (control de isotipo) a 5 μg / ml y IgG anti-humano de ratón PE-Cy5 (anticuerpo secundario)Sugerido por el fabricante.
- Preparar paraformaldehído al 4% en PBS (tampón de fijación).
- Enlace de destino
- Se recogen las suspensiones de células Daudi y Daudi GFP + de los matraces de cultivo de 75 cm2 y se transfieren a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
- Lavar las células mediante la adición de 5 ml de PBS y la centrifugación de la suspensión celular a 400 xg durante 5 min.
- Resuspender las células en PBS y realizar un recuento de células y el análisis de viabilidad con azul trypan. Utilizar cultivos con niveles de viabilidad celular ≥ 95% para el análisis.
- Diluir la suspensión celular a 4 x 106 células / ml con tampón de tinción fría.
- En tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 50 μl de la suspensión celular a 100 μl de las diferentes concentraciones de ensayo de los mAbs de referencia o biosimilares. Incluya repeticiones para cada condición experimental.
- Prepare tubos adicionales para(IgG1 humana en lugar de rituximab) y control negativo (anticuerpo secundario sin anticuerpo primario).
- Incubar a 4 ° C durante 20 - 30 min.
- Lavar las células mediante la adición de 1 mL de PBS y la centrifugación de la suspensión celular a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Suspender las células en 100 μl del anticuerpo secundario e incubar durante 20 - 30 min a 4 ° C, protegido de la luz.
- Lavar las células dos veces con PBS y suspenderlas en 200 μl de tampón de fijación.
- Analizar las células en un citómetro de flujo.
NOTA: La señal permanece estable durante varios días si las muestras se almacenan a 4 ° C y se protegen de la luz.
- Adquisición de datos
- Abra dos parcelas de puntos en una hoja de trabajo del software de operación del citómetro de flujo. Fije el FSC-A frente al FSC-H en el primero y el FSC-A frente al SSA-A en el segundo. Abra un histograma para el canal PE-Cy5.
- En el gráfico FSC-A versus FSC-H, haga una puerta (R1) seleccionando eventos singulares ( Figura 1A ).
- Establezca la población R1 en el diagrama de puntos FSC-A versus SSA-A y luego haga una nueva puerta (R2) seleccionando las células objetivo ( Figura 1B ). Establezca la población de R2 en el histograma de intensidad PE-Cy5 para ver la distribución de frecuencia de las células.
- Ajuste el límite inferior de intensidad de fluorescencia (FI) para el canal PE-Cy5 usando el control negativo y de isotipo ( Figura 1C ).
- Adquirir 10.000 eventos dentro de R2 de la muestra con la mayor concentración del producto de referencia. FI de esta muestra debe ser el más alto esperado ( Figura 1C ].
- Adquirir el resto de las muestras.
- Para cada muestra, obtenga la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) en el canal PE-Cy5.
- Para muestras con el mAb de referencia o biosimilar, calcule la diferencia entre la MFI de muestra y la del control de isotipo (ΔMFI).
2. Evaluación de los CDC
- Preparación de materiales biológicos y reactivos
- Preparar las células medio de cultivo celular y la cultura Daudi y Daudi GFP + como se describe anteriormente (pasos 1.1.1 - 1.1.2).
NOTA: Además, el ensayo CDC requieren RPMI sin suero. - Diluir normal de complemento de suero humano (NHSC) 1: 2 con medio RPMI libre de suero. Preparar 2,5 ml.
- Preparar 1 ml de inactivado por calor (30 min / 56 ° C) NHSC diluido 1: 2 con medio RPMI.
- Preparar conjuntos de soluciones de ensayo para la referencia y mAbs biosimilares en RPMI libre de suero. Hacer diez diluciones (200 l cada una) de 1 a 0.025 g / ml.
- Preparar las células medio de cultivo celular y la cultura Daudi y Daudi GFP + como se describe anteriormente (pasos 1.1.1 - 1.1.2).
- ensayo de CDC
- Recoger las células Daudi y Daudi GFP + procedentes de los cultivos y cuantificar la viabilidad celular (consulte los pasos 1.2.1 - 1.2.3).
- Preparar una suspensión de células con 4 x 10 5 células / ml en RPMI libre de suero.
- Añadir50! L de suspensión de células a 50 l de cada referencia o concentración de ensayo mAb biosimilar en 96 pocillos cónica (V) -fondo microplacas. Incluir repeticiones para cada condición experimental.
- Preparar pozos adicionales para el control negativo (es decir, sin mAb), control de la muerte basal (es decir, inactivado por calor NHSC en presencia de mAb), y el control positivo de tinción (es decir, células expuestas a 50 l de EtOH al 70%).
- Se incuban las células durante 20 - 30 min a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada.
- Añadir 50 l de NHSC (diluido 1: 2) a cada pocillo e incubar las células opsonizadas durante 2,5 horas a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada. Utilice NHSC inactivado por calor en los pocillos de control muerte basales.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar el sobrenadante.
- Lavar las células mediante la adición de 150! L de PBS y centrifugando la suspensión de células durante 5 min a 400 xg y 10 ° C. diScard el sobrenadante.
- Mancha las muestras con 7-aminoactinomicina (7-AAD), como se describió anteriormente 7 , 8 .
- Analizar las células en un citómetro de flujo en el mismo día.
- Adquisición de datos
- Abra dos parcelas de puntos en una hoja de trabajo del software de operación del citómetro de flujo. Fije las parcelas como en los pasos 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Cree una tercera parcela que sea un diagrama de puntos para GFP versus 7-AAD en la población de R2.
- Definir los límites adecuados FI utilizando las células Daudi, células Daudi GFP + , y el control de muerte positiva ( Figura 2C ].
- Para cada muestra, mida el porcentaje de células diana 7-AAD + . Adquirir al menos 5.000 eventos de R2.
- Calcular la citotoxicidad inducida por el mAb específico restando el porcentaje de 7-AAD + en el control basal de muerte del porcentaje encontrado en muestras con diferenciasDe concentraciones de mAbs ( Figura 2D ).
3. Análisis de biosimilitud
- Introduzca los valores de concentración y respuesta en un software gráfico.
- Generar gráficos y calcular las regresiones no lineales con las siguientes consideraciones: i) utilizar la transformación logarítmica de la concentración de mAb como "X"; Ii) utilizar el modelo matemático de pendiente variable (Y = respuesta mínima + (respuesta máxima - respuesta mínima) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * pendiente de pendiente)); Y iii) limitan los valores inferiores a cero, ya que se ha restado la respuesta basal.
NOTA: Se esperan curvas con una forma sigmoidal simétrica. - Comparar ambos ajustes no lineales con un ajuste global usando una prueba F (muchos programas de software de gráficos incluyen esta característica).
NOTA: Estas pruebas establecen como hipótesis nula que la respuesta máxima, logEC 50 , y la pendiente de Hill son los mismos para los dos conjuntos de datos, que coincide con elpregunta biológico destinados a tratar.
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Representative Results
Usando los protocolos descritos anteriormente, se comparó la unión de diana y la inducción de CDC de rituximab de referencia en paralelo con las de un rituximab biosimilar producido y comercialmente disponible en Asia.
En las células de Daudi, ambos mAbs se unieron a CD20 de una manera dependiente de la concentración ( Figura 1D ). Las regresiones no lineales de datos de unión mostró un r 2 de 0,978 y 0,848 para referencia y rituximab biosimilar, respectivamente ( Figura 1E ). El análisis estadístico de las curvas concentración-respuesta mostró que ellos, y por lo tanto los parámetros farmacodinámicos calculados a partir de ellos, son significativamente diferentes entre mAbs (P <0,0001). La respuesta máxima para el biosimilar fue 2,16 veces menor que la del producto de referencia. Estos resultados sugieren que los dos mAbs evaluados tienen diferentes capacidades para unir CD20 expresado en el membrane de las células leucémicas.
inducción CDC fue también en comparación con los dos mAbs. Referencias y biosimilares productos estimularon CDC en células Daudi de una manera dependiente de la concentración (Figura 2E). Es importante destacar que las concentraciones a las que los mAbs inducen CDC eran diferentes de los necesarios para la unión a la diana. Regresiones no lineales de los datos de los CDC mostraron r 2> 0,980 para ambos productos. La comparación estadística de las curvas de concentración-respuesta indica que son significativamente diferentes (P <0,01), haciendo que el biosimilar menos potente. Estos datos indican que la capacidad de inducir CDC es diferente para los mAbs analizados.
La Figura 1. En Vitro Target-unión de anti-CD20 terapéutico mAbs. Células Daudi GFP + se expusieron a diferirDe los mAbs (4,8 ng / ml a 5 μg / ml) y luego se tiñeron con anticuerpo secundario anti-humano conjugado con PE-Cy5. La intensidad de fluorescencia (FI) se midió por citometría de flujo en eventos individuales (A) , con tamaño y granularidad correspondientes a los de las células Daudi (B) . Para establecer los límites FI (C) se emplearon células no teñidas (gris claro), controles de isotipo (gris oscuro) y 5 μg / ml del rituximab de referencia (azul ) . Ambos evaluaron los mAbs unidos a células Daudi de una manera dependiente de la concentración (D) . Las respuestas (ΔMFI, véase el texto) se utilizaron para generar curvas de concentración-respuesta para referencia (azul) o biosimilar (negro) rituximab (E) . La comparación estadística de las regresiones no lineales mostró diferencias entre los mAb (P <0,0001, prueba exacta de Fisher). Haga clic aquí para ver una versión más grandeDe esta cifra.
Figura 2. Inducción de CDC por mAbs anti-CD20 Terapéuticos. Las células Daudi GFP + opsonizadas con diferentes concentraciones de mAbs fueron expuestas al complemento humano. La muerte celular se evaluó mediante tinción con 7-AAD y el análisis de citometría de flujo de intensidad de fluorescencia (FI) en eventos individuales (A) , con tamaño y granularidad correspondientes a las células Daudi (B) . Se incluyeron como controles (C) células GFP- (negro) y GFP + (verde) no teñidas y células muertas con etanol (rojo ) . La cuantificación de las células 7-AAD + en las muestras de control basal de muerte (gris) y rituximab (azul) permitió el cálculo de la citotoxicidad inducida por mAb (D) . Curvas de concentración-respuesta obtenidas para referencia (azul) o biosimilar (negro) rituximab (E). La comparación estadística de las regresiones no lineales mostró diferencias entre las respuestas inducidas por los dos mAbs (P <0,01, prueba exacta de Fisher). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Anticuerpos monoclonales aprobados para uso terapéutico, con células diana para el ensayo CDC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La expiración de la patente de un mAb terapéutico está promoviendo el desarrollo de los biosimilares. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos simples que pueden identificar diferencias en las actividades de relevancia clínica de estos productos. Se emplearon células CD20 + cultivadas para la evaluación de dos características funcionales clave de rituximab: unión a la diana y la inducción CDC. La actividad anterior requiere el reconocimiento de CD20 por la región Fab del mAb, mientras que el último depende principalmente de la interacción de la región Fc con su complemento 9. Por lo tanto, estos ensayos proporcionan una manera de ligar las características estructurales y funcionales de mAbs.
La unión de mAbs terapéuticos objetivo es por lo general evaluado por calorimetría de titulación isotérmica (ITC), resonancia de plasmón superficial (SPR), o interferometría biocapa 10, 11, 12. Estos ensayos permiten afFinity, pero requieren equipo especializado y entrenamiento. El protocolo descrito aquí evalúa la unión de diana en una comparación de lado a lado para identificar diferencias entre productos, incluso sin datos de afinidad. El método es simple y emplea un contexto celular relevante para la evaluación de la actividad. Por otro lado, la inducción de CDC por rituximab puede ser evaluada por la medición de ATP 13 , la cuantificación de lactato deshidrogenasa (LDH) 14 liberado o alamarBlue 15 y MTT ensayos [ 16] . El método descrito aquí, usando tinción con 7-AAD, tiene un fondo bajo y se puede combinar con otras manchas para análisis de citometría de flujo multiparamétrico.
En los experimentos representativos presentados, las curvas dosis-respuesta se ajustaron al modelo logístico de cuatro parámetros, lo que permitió el cálculo de la CE 50 , la pendiente de Hill y la respuesta máxima. Cabe destacar que los rangos de concentraciónons empleado para generar estas curvas eran diferentes para cada ensayo, poniendo de relieve la importancia de analizar y definir rangos adecuados en experimentos preliminares. Los cambios en los reactivos clave, tales como fluorocromos y complementos, o el uso de una línea celular con un nivel objetivo diferente, pueden desplazar el alcance efectivo de concentraciones.
El análisis estadístico identificó diferencias entre un lote de un rituximab biosimilar disponible comercialmente en Asia y el producto de referencia, tanto en unión a la diana y en la inducción de CDC. Es importante tener en cuenta que, incluso cuando el proceso de fabricación de los mAbs está estrechamente controlada, cada atributo del producto de referencia muestra un rango. En consecuencia, el número mínimo de lotes que debe ser probado durante la evaluación de un bioterapéutico similares depende de la medida de la variabilidad del producto de referencia y en la variabilidad del ensayo 4 .Así, estos protocolos deben aplicarse a différéNt durante la evaluación de comparabilidad.
Los métodos presentados se pueden extrapolar a otros pares de mAbs-objetivos terapéuticos, siempre y cuando las células que expresan el antígeno sean accesibles. La Tabla 1 enumera los mAbs terapéuticos distintos del rituximab para los cuales la inducción de CDC es relevante para la eficacia clínica y recopila información sobre los modelos celulares previamente informados para cada mAb.
En conclusión, los dos ensayos descritos aquí son simples, rápidos y económicos, permitiendo su ejecución en la mayoría de los laboratorios. Los métodos pueden utilizarse durante las primeras etapas del desarrollo biosimilar o después de la aprobación reglamentaria para la comparación de lote a lote durante la producción.
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, y SM-Pérez Tapia son empleados de UDIBI, que realiza estudios biosimilitud para varias compañías farmacéuticas.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
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