Summary
Este protocolo descreve a comparação in vitro de duas características funcionais chave de rituximab: ligação ao alvo e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de indução. Os métodos foram utilizados para uma comparação lado-a-lado entre o rituximab referência e um biossimilar rituximab. Estes ensaios podem ser empregues durante o desenvolvimento biológico similar, ou como um controlo de qualidade na sua produção.
Abstract
Os anticorpos monoclonais (mAbs) terapêuticas são relevantes para o tratamento de diversas patologias, incluindo cancros. O desenvolvimento de mAbs biossimilares pelas empresas farmacêuticas é uma oportunidade de mercado, mas também é uma estratégia para aumentar a acessibilidade de drogas e reduzir os custos associados de terapia. Os protocolos detalhados aqui descrever a avaliação da ligação ao alvo e a indução por CDC rituximab em células Daudi. Estas duas funções requerem diferentes regiões estruturais do anticorpo e são relevantes para o efeito clínico induzido pelo rituximab. Os protocolos permitem a comparação lado-a-lado de uma rituximab referência e um biossimilar rituximab comercializado. Os produtos avaliados apresentaram diferenças tanto na ligação ao alvo e indução CDC, sugerindo que existem diferenças físico-químicas subjacentes e destacando a necessidade de analisar o impacto de tais diferenças no ambiente clínico. Os métodos aqui apresentados constituem simples e barato in vitro </ Em> para a avaliação da atividade dos biossimilares de rituximab. Assim, podem ser úteis durante o desenvolvimento biossimilar, bem como para o controle de qualidade na produção biosimilar. Além disso, os métodos apresentados podem ser extrapolados para outros mAb terapêuticos.
Introduction
Os anticorpos terapêuticos são anticorpos monoclonais recombinantes (mAbs) desenvolvidos para o tratamento de diferentes patologias, incluindo cancros, doenças autoimunes e crónicas, distúrbios neurológicos e outros 1 . Atualmente, a FDA concedeu a aprovação de mais de 40 mAbs terapêuticos, e mais se espera que cheguem ao mercado nos anos seguintes.
Rituximab é um anticorpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidade aprovado para o tratamento de linfoma não Hodgkin de células B CD20 + (NHL), LNH folicular CD20 + , leucemia linfocítica crónica e artrite reumatóide 2 , 3 . O reconhecimento de CD20, que é sobre-expresso em células B, pelo rituximab induz apoptose; Ativação do complemento; E citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) 3 . As patentes desta droga expiraram na Europa e nos EUA em 2013 e 2016, Respectivamente. Assim, as empresas farmacêuticas em todo o mundo estão desenvolvendo rituximab biosimilares. Como em qualquer outro medicamento para consumo humano, biosimilares requerem aprovação de agências reguladoras. As diretrizes internacionais indicam que, para os mAbs, a biosimilaridade deve ser demonstrada através da comparação das características físico-químicas, farmacocinéticas, eficácia e segurança dos produtos novos e de referência 4 .
Consequentemente, as metodologias utilizadas nestas comparações devem avaliar as características estruturais e funcionais dos mAb, especialmente aqueles com relevância clínica. Para este fim, os ensaios in vitro mostram várias vantagens em relação às experiências in vivo (revisto em Chapman et al. ) 5 : i) os estudos in vitro são mais sensíveis às diferenças entre o biosimilar proposto eo produto de referência; Ii) estudos in vivo devem ser realizados em espécies relevantes, o que para muitos mAbs éprimatas não-humanos; e iii) uma vez que o mecanismo de acção, a toxicologia pré-clínicos, e os efeitos clínicos do produto de referência são bem conhecidas, em estudos in vivo com biosimilars pode não fornecer informação útil adicional. Assim, a orientação da União Europeia para biosimilares permite que os candidatos a entrar ensaios clínicos com base em robusta dados in vitro sozinho 6.
Aqui, apresentamos dois ensaios rápidos, econômicos e simples que avaliam a atividade biológica do rituximab usando células cultivadas CD20 +. Estes ensaios podem ser incluídos como parte do exercício de comparabilidade para os candidatos biossimilares rituximab.
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Protocol
1. Avaliação da ligação alvo por citometria de fluxo
- Preparação de materiais biológicos e reagentes
- Preparar 500 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor (H-IFBS).
- Cultura Daudi Burkitt Linfoma (Daudi) células e Daudi GFP + células utilizando RPMI e 75 cm 2 cultura frascos. Manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2 até atingir 6 - 9 x 10 5 células / mL.
- Fazer 50 mL de tampão de coloração diluindo 1/100 H-IFBS em PBS; Este tampão é estável a 2-8 ° C durante pelo menos um mês.
- Preparar as soluções de teste para os mAbs biosimilares e de referência. Faça dez diluições em série 1: 2 (500 μL cada) em tampão de coloração, a partir de 5 μg / mL.
- Utilizar tampão de coloração para diluir a IgG humana (controlo do isotipo) para 5 μg / mL e IgG anti-humano de rato PE-Cy5 (anticorpo secundário)centração sugerido pelo fabricante.
- Prepare a 4% de paraformaldeído em PBS (tampão de fixação).
- vinculativo alvo
- Recolhe-se o Daudi e suspensões de células de Daudi GFP + a partir dos frascos de cultura de 75 cm 2 e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
- Lavam-se as células por adição de 5 mL de PBS e centrifugação da suspensão de células a 400 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células em PBS e realizar uma contagem de células e análise de viabilidade com tripano azul. Use culturas com níveis de viabilidade celular ≥ 95% para a análise.
- Dilui-se a suspensão de células de 4 x 10 6 culas / ml com tampão de coloração frio.
- Em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 50 uL da suspensão de células a 100 ul de diferentes concentrações de ensaio de referência ou o mAb biológicos similares. Incluem repetições para cada condição experimental.
- Preparar tubos adicionais para oControlo de isotipo (IgG1 humana em vez de rituximab) e controlo negativo (anticorpo secund�io sem anticorpo prim�io).
- Incubar a 4 ° C durante 20 - 30 min.
- Lavar as células por adição de 1 mL de PBS e centrifugar a suspensão celular a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar o sobrenadante.
- Suspender as células em 100 μL do anticorpo secundário e incubar durante 20-30 min a 4 ° C, protegido da luz.
- Lavar as células duas vezes com PBS e suspendê-las em 200 μL de tampão de fixação.
- Analisar as células em um citómetro de fluxo.
NOTA: O sinal permanece estável durante vários dias se as amostras forem armazenadas a 4 ° C e protegidas da luz.
- Aquisição de dados
- Abra duas parcelas de pontos em uma planilha do software de operação do citómetro de fluxo. Defina o FSC-A versus FSC-H no primeiro eo FSC-A versus SSA-A no segundo. Abra um histograma para o canal PE-Cy5.
- No gráfico FSC-A versus FSC-H, faça um portão (R1) seleccionando eventos singuletos ( Figura 1A ).
- Defina a população R1 no gráfico de pontos FSC-A versus SSA-A e, em seguida, faça um novo gate (R2) selecionando células-alvo ( Figura 1B ). Defina a população R2 no histograma de intensidade PE-Cy5 para visualizar a distribuição de freqüência das células.
- Ajustar o limite inferior de intensidade de fluorescência (FI) para o canal PE-Cy5 usando o controle negativo e isotipo ( Figura 1C ).
- Adquirir 10.000 eventos dentro de R2 da amostra com a maior concentração do produto de referência. FI dessa amostra deve ser a mais alta esperada ( Figura 1C ).
- Adquirir o resto das amostras.
- Para cada amostra, obter a intensidade de fluorescência mediana (MFI) no canal PE-Cy5.
- Para amostras com o mAb de referência ou biossimilar, calcule a diferença entre a MFI da amostra e a do controlo do isotipo (ΔMFI).
2. Avaliação dos CDC
- Preparação de materiais biológicos e reagentes
- Preparar o meio de cultura celular e cultivar células Daudi e Daudi GFP + como descrito acima (passos 1.1.1 - 1.1.2).
NOTA: Adicionalmente, o ensaio CDC requer RPMI sem soro. - Diluir o complemento de soro humano normal (NHSC) 1: 2 com RPMI isento de soro. Preparar 2,5 mL.
- Preparar 1 mL de NHSC inactivado pelo calor (30 min / 56 ° C) diluído a 1: 2 com RPMI.
- Preparar conjuntos de soluções de testes para a referência e mAbs biossimilares em RPMI sem soro. Fazer dez diluições (200 μL cada) de 1 a 0,025 μg / mL.
- Preparar o meio de cultura celular e cultivar células Daudi e Daudi GFP + como descrito acima (passos 1.1.1 - 1.1.2).
- Ensaio de CDC
- Recolher as células Daudi e Daudi GFP + das culturas e quantificar a viabilidade celular (ver passos 1.2.1 - 1.2.3).
- Preparar uma suspensão celular com 4 x 10 5 células / mL em RPMI sem soro.
- Adicionar50 μL de suspensão celular a 50 μL de cada concentração de ensaio de mAb biosimilar ou de referência em microplacas de 96 poços com fundo cónico (V). Incluir réplicas para cada condição experimental.
- Preparar poços adicionais para o controlo negativo ( isto é, sem mAb), controlo de morte basal ( isto é, NHSC inactivado pelo calor na presença de mAb) e controlo positivo de coloração ( ie, células expostas a 50 μL de EtOH a 70%).
- Incubar as células durante 20-30 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2.
- Adicionar 50 μL de NHSC (diluído 1: 2) a cada poço e incubar as células opsonizadas durante 2,5 ha 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2. Use NHSC inativado pelo calor nos poços basais de controle da morte.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar o sobrenadante.
- Lavar as células por adição de 150 μL de PBS e centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 400 xg e 10 ° C. DiScard o sobrenadante.
- Mancha as amostras com 7-aminoactinomicina (7-AAD), como descrito anteriormente 7 , 8 .
- Analisar as células em um citómetro de fluxo no mesmo dia.
- Aquisição de dados
- Abra duas parcelas de pontos em uma planilha do software de operação do citómetro de fluxo. Defina essas parcelas como nas etapas 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Criar um terceiro enredo que é um dot-plot para GFP versus 7-AAD na população R2.
- Definir os limites FI adequados utilizando células Daudi, células Daudi GFP + e controlo positivo de morte ( Figura 2C ).
- Para cada amostra, medir a percentagem de células alvo 7-AAD + . Adquirir pelo menos 5.000 eventos do R2.
- Calcular a citotoxicidade específica induzida por mAb subtraindo a percentagem de 7-AAD + no controlo de morte basal a partir da percentagem encontrada em amostras com diferentesent concentrações de mAb (Figura 2D).
3. Análise Biosimilarity
- Introduzir os valores de concentração e de resposta em um programa gráfico.
- Gerar gráficos e calcular regressões não-lineares com as seguintes considerações: i) utilizar a transformação logarítmica da concentração de mAb como "X"; ii) utilizar o modelo matemático inclinação variável (Y = resposta mínima + (resposta máxima - resposta mínimo) / 1 + 10 ^ ((LogEc 50 -X) * Colina declive)); e iii) restringir os valores inferiores a zero, uma vez que a resposta basal foi subtraa.
Nota: As curvas com uma forma sigmoidal simétrica são esperadas. - Comparar os dois ataques não-lineares com um ajuste global, usando um teste-F (programas de software muitos gráficos incluir esse recurso).
NOTA: Esses testes estabelecer como a hipótese nula de que a resposta máxima, LogEc 50, eo declive de Hill são as mesmas para os dois conjuntos de dados, o que corresponde aQuestão biológica a ser abordada.
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Representative Results
Utilizando os protocolos descritos acima, a ligação de alvo e a indução de CDC do rituximab de referência foram comparadas em paralelo com as de um rituximab biosimilar produzido e comercialmente disponível na Ásia.
Em c�ulas de Daudi, ambos mAbs ligaram CD20 de uma forma dependente da concentra�o ( Figura 1D ). As regressões não-lineares dos dados de ligação mostraram um r 2 de 0,978 e 0,848 para referência e rituximab biosimilar, respectivamente ( Figura 1E ). A análise estatística das curvas concentração-resposta mostrou que eles, e portanto os parâmetros farmacodinâmicos calculados a partir deles, são significativamente diferentes entre mAbs (P <0,0001). A resposta máxima para o biossimilar foi 2,16 vezes menor que a do produto de referência. Estes resultados sugerem que os dois mAbs avaliados possuem diferentes capacidades para ligar CD20 expresso no meMbrano de células leucêmicas.
A indução de CDC também foi comparada com os dois mAbs. Os produtos de referência e biosimilares estimularam os CDC em células Daudi de uma forma dependente da concentração ( Figura 2E ). Importante, as concentrações às quais os mAc induziram CDC eram diferentes das necessárias para a ligação ao alvo. Regressões não-lineares dos dados CDC mostraram r 2 > 0,980 para ambos os produtos. A comparação estatística das curvas concentração-resposta indicou que elas são significativamente diferentes (P <0,01), tornando o biossimilar menos potente. Estes dados indicam que a capacidade de induzir CDC é diferente para os mAbs analisados.
Figura 1. Ligação In Vitro -alvo de mAbs Anti-CD20 Terapêuticos. Células Daudi GFP + foram expostas aent concentrações dos mAb (4,8 ng / ml a 5 ug / ml) e depois coradas com anticorpo secundário anti-humano PE-Cy5-conjugado. A intensidade de fluorescência (FI) foi medido por citometria de fluxo em eventos individuais (A), com um tamanho e granularidade correspondentes aos das células de Daudi (B). Células não coradas (cinzento claro), controlos de isotipo (cinzento escuro), e 5 ug / mL de rituximab a referência (azul) foram utilizados para definir os limites FI (C). Ambos os mAbs avaliados ligado células Daudi de uma forma dependente da concentração (D). Respostas (ΔMFI; ver texto) foram usados para gerar curvas de concentração-resposta para a referência (azul) ou (preto) rituximab biológico similar (E). A comparação estatística de regressões não-lineares mostrou diferenças entre os mAbs (P <0,0001; teste exacto de Fisher). Por favor clique aqui para ver uma versi maioresSobre esta figura.
Figura 2. Indução de CDC por mAbs anti-CD20 terapêuticos. As células Daudi GFP + opsonizadas com diferentes concentrações de mAbs foram expostas ao complemento humano. A morte celular foi avaliada pela coloração com 7-AAD e pela análise citométrica de fluxo da intensidade de fluorescência (FI) em eventos isolados (A) , com tamanho e granularidade correspondentes às células Daudi (B) . As células GFP (preto) e GFP + (verde) não coradas e as células mortas com etanol (vermelho) foram incluídas como controlos (C) . A quantificação das células 7-AAD + nas amostras de controlo basal-morte (cinzento) e rituximab (azul) permitiu o cálculo da citotoxicidade induzida por mAb (D) . Curvas de concentração-resposta obtidas para referência (azul) ou biosimilar (preto) rituximab (E). A comparação estatística de regressões não-lineares mostrou diferenças entre as respostas induzidas pelos dois mAb (P <0,01; teste exacto de Fisher). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Anticorpos monoclonais Aprovado para Uso Terapêutico, com células alvo para o CDC de Ensaio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A expiração da patente de um mAb terapêutico está a promover o desenvolvimento de biosimilares. Assim, existe a necessidade de métodos simples que possam identificar diferenças nas actividades clinicamente relevantes destes produtos. Utilizaram-se células cultivadas com CD20 + para a avaliação de duas características funcionais chave do rituximab: ligação ao alvo e indução de CDC. A actividade anterior requer o reconhecimento de CD20 pela região Fab do mAb, enquanto a última depende principalmente da interacção da região Fc com o seu complemento 9 . Por conseguinte, estes ensaios proporcionam uma forma de ligar as características estruturais e funcionais dos mAbs.
A ligação alvo de mAbs terapêuticos é usualmente avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmão de superfície (SPR) ou interferometria de biolayer 10 , 11 , 12 . Esses ensaiosFinity, mas requerem equipamento especializado e treinamento. O protocolo aqui descrito avalia a ligação do alvo numa comparação lado-a-lado para identificar diferenças entre produtos, mesmo sem dados de afinidade. O método é simples e emprega um contexto celular relevante para a avaliação da atividade. Por outro lado, a indução de CDC pelo rituximab pode ser avaliada pela medida de ATP 13 , a quantificação de lactato desidrogenase liberada (LDH) 14 ou alamarBlue 15 e ensaios MTT 16 . O método aqui relatado, utilizando colora�o com 7-AAD, tem um fundo baixo e pode ser combinado com outras manchas para an�ise de citometria de fluxo multiparam�rica.
Nas experiências representativas apresentadas, as curvas dose-resposta ajustaram o modelo logístico de quatro parâmetros, permitindo o cálculo da EC 50 , da inclinação de Hill e da resposta máxima. Em especial, os intervalos de concentraçãoons empregues para gerar tais curvas eram diferentes para cada ensaio, destacando-se a importância de analisar e definir gamas adequadas em experiências preliminares. Alterações na reagentes chave, tais como fluorocromos e complementos, ou o uso de uma linha de células com um nível alvo diferente, pode deslocar a gama eficaz de concentrações.
A análise estatística identificadas diferenças entre um lote de uma rituximab biológico similar disponível comercialmente na Ásia e o produto de referência, tanto na ligação ao alvo e na indução da CDC. É importante ter em conta que, mesmo quando o processo de fabricação os mAbs é rigidamente controlado, cada atributo do produto de referência mostra um intervalo. Por conseguinte, o número mínimo de lotes que deve ser testado durante a avaliação de um bioterapêutico semelhante depende do grau de variabilidade do produto de referência e com a variabilidade do ensaio 4 .Assim, estes protocolos deve ser aplicada a As difereNt durante a avaliação da comparabilidade.
Os métodos apresentados podem ser extrapolados para outros pares de mAbs-alvos terapêuticos, desde que as células que expressam o antigénio sejam acessíveis. A Tabela 1 lista mAb terap�ticos diferentes de rituximab para os quais a indu�o de CDC � relevante para a efic�ia cl�ica e compila informa�o sobre os modelos celulares previamente relatados para cada mAb.
Em conclusão, os dois ensaios aqui descritos são simples, rápidos e baratos, permitindo a sua execução na maioria dos laboratórios. Os métodos podem ser usados durante etapas iniciais de desenvolvimento biossimilar ou após aprovação regulamentar para comparação de lote a lote durante a produção.
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, e SM Pérez-Tapia são funcionários da UDIBI, que realiza estudos biosimilarity por várias empresas farmacêuticas.
Acknowledgments
Os autores não têm agradecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
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