Summary
Bu protokol, rituksimab iki önemli fonksiyonel özellikleri in vitro karşılaştırmasını tarif: hedef bağlanma ve tamamlayıcıya bağlı sitotoksisite (CDC) indüksiyonu. yöntem, referans rituksimab ve rituksimab biyobenzerin arasında bir yan-yana karşılaştırma için kullanılmıştır. Bu tahliller, biyobenzer geliştirme sırasında veya üretimlerinde bir kalite kontrol olarak kullanılabilir.
Abstract
Terapötik monoklonal antikorlar (mAb), kanserler de dahil olmak üzere farklı patolojilerin tedavisi için önemlidir. İlaç şirketleri tarafından biyobenzer mAb'lerin gelişimi bir pazar fırsatıdır, ancak aynı zamanda uyuşturucunun erişilebilirliğini artırmak ve terapi ile ilişkili maliyetleri azaltmak için bir stratejidir. Burada detaylandırılan protokoller, Daudi hücrelerinde rituksimab ile hedef bağlanma ve CDC indüksiyonunun değerlendirilmesini tanımlamaktadır. Bu iki işlev antikorun farklı yapısal bölgelerini gerektirir ve rituximab'ın indüklediği klinik etkiyle ilişkilidir. Protokoller, bir referans rituksimabın ve piyasaya sürülen rituksimab biyosimerlerinin yan yana karşılaştırılmasını sağlar. Değerlendirilen ürünler hem hedef bağlama hem de CDC indüksiyonunda farklılıklar gösterdi; bu, alttaki fizikokimyasal farklılıkların bulunduğunu ve klinik ortamdaki bu farklılıkların etkisini analiz etme ihtiyacının altını çizdi. Burada bildirilen yöntemler basit ve ucuz in vitro </ Em> rituximab biyosimilar aktivitesinin değerlendirilmesi için modeller. Bu nedenle, biyo-benzeri gelişim sırasında biyoeşdeğer üretimin kalite kontrolünde yararlı olabilirler. Dahası, sunulan yöntemler diğer terapötik mAb'lara ekstrapole edilebilir.
Introduction
Terapötik antikorlar kanser, oto bağışıklık ve kronik hastalıklar, nörolojik hastalıklar ve diğerleri 1 de dahil olmak üzere, farklı patolojilerin tedavisi için geliştirilmiş rekombinant monoklonal antikorlar (mAb'ler) bulunmaktadır. Şu anda FDA 40'dan fazla terapötik mAb'lere onayını veren ve daha sonraki yıllarda pazara ulaşması bekleniyor.
Rituksimab CD20 + B hücreli non-Hodgkin lenfoma (NHL), CD20 + foliküler NHL, kronik lenfositik lösemi, ve romatoid artrit, 2, 3 tedavisi için onaylanmıştır yüksek afiniteli bir kimerik monoklonal IgG1 antikoru. rituksimab tarafından B hücrelerinde aşırı eksprese olan CD20 tanınması, apoptozu indükler; kompleman aktivasyonu; ve antikora bağlı hücre aracılı sitotoksisite (ADCC) 3. Bu ilacın patent 2013 ve 2016 yılında ABD'de, Avrupa'da ve süresi dolmuş, sırasıyla. Böylece, dünya çapındaki ilaç firmaları rituximab biyosimilar geliştiriyor. İnsan tüketimi için diğer herhangi bir ilacın olduğu gibi, biyosimilarlar da düzenleyici kurumların onayını gerektirir. Uluslararası yönergeler, mAb'ler için yeni ve referans ürünlerin fiziko kimyasal özellikleri, farmakokinetiği, etkililiği ve emniyetini karşılaştırarak biyolojik benzerliğin gösterilmesi gerektiğini göstermektedir.
Buna göre, bu karşılaştırmalarda kullanılan metodolojiler mAb'lerin yapısal ve işlevsel özelliklerini, özellikle de klinik önemi olanları değerlendirmelidir. Bu amaçla, in vitro deneyler in vivo deneylere kıyasla birçok avantaj sağlar (Chapman ve ark. Gözden geçirilir) 5 : i) in vitro çalışmalar önerilen biyobenzer ile referans ürün arasındaki farklara daha duyarlıdır; Ii) in vivo çalışmalar ilgili türlerde yapılmalıdır, ki bu birçok mAb içininsan olmayan primatlar; ve iii) hareket mekanizması, klinik öncesi toksikoloji ve referans ürün ile ilgili klinik etkileri itibaren de ek yararlı bilgiler sağlamayabilir biyobenzerlerin ile in vivo çalışmalar, bilinmektedir. Buna göre, biyobenzerleri için Avrupa Birliği'nin Rehberlik adayları vitro verilere yalnız 6'da sağlam dayalı klinik deneylere girmek için izin verir.
Burada, CD20 + kültürlü hücreleri kullanılarak rituksimab biyolojik aktivitesini değerlendirmek iki hızlı, ekonomik ve basit deneyleri sunuyoruz. Bu tahliller, rituksimab Biyobenzer adaylar için karşılaştırılabilirlik çalışmasının bir parçası olarak dahil edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hedef Bağlamanın Akış Sitometresi ile Değerlendirilmesi
- Biyolojik materyal ve reaktiflerin hazırlanması
- % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (H-IFBS) ile takviye edilmiş 500 mL RPMI kültür ortamı yapın.
- Kültür Daudi Burkitt'in Lenfoma (Daudi) hücreleri ve Daudi GFP + hücreleri RPMI ve 75 cm2 kültür şişeleri kullanıyor. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosferde 6 - 9 x 10 5 hücre / mL'ye ulaşıncaya kadar muhafaza edin.
- PBS içinde 1/100 H-IFBS seyrelterek 50 mL boyama tamponu yapın; Bu tampon, 2-8 ° C'de en az bir ay boyunca kararlıdır.
- Referans ve biyoeşdeç mAb'ler için test çözümlerini hazırlayın. 5 μg / mL'den başlayarak, boyama tamponunda on 1: 2 seri dilüsyon (her biri 500 μL) yapın.
- Boyama tamponunu, insan IgG'sini (izotip kontrolü) 5 μg / mL'ye ve PE-Cy5 fare anti-insan IgG'sini (ikincil antikor) sulandırmak için kullanınÜreticinin önerdiği santrasyon.
- PBS (fiksasyon tamponu)% 4 paraformaldehid hazırlayın.
- Hedef ciltleme
- 75 cm2 kültür şişelerinden Daudi ve Daudi GFP + hücre süspansiyonlarını toplayın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin.
- 5 mL PBS ekleyerek ve 400 xg'de hücre süspansiyonunu 5 dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın.
- PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon ve tripan mavi ile bir hücre sayısı ve canlılık analizi yapın. Analiz için hücre canlılığı seviyeleri ≥% 95 olan kültürleri kullanın.
- Hücre süspansiyonunu soğuk boyama tamponu ile 4 x 10 6 hücre / mL'ye seyreltin.
- 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde, referans veya biosimilar mAb'lerin farklı test konsantrasyonlarına 100 uL hücre süspansiyonu 50 μL ekleyin. Her deneysel durum için tekrarlar ekleyin.
- Ek tüpler hazırlayın.izotip kontrol (yerine rituksimab insan IgG1) ve negatif kontrol (birincil antikor olmayan ikincil antikor).
- 30 dakika - 20 boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 1 ml PBS ilave edilerek ve 10 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj hücreleri yıkanır. Süpernatant atılır.
- ikincil antikor, 100 uL hücreler süspansiyon halinde tutulur ve 20 için inkübe -, ışıktan korunarak, 4 ° C'de 30 dakika.
- PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve sabitleme tampon 200 uL onları askıya alın.
- bir akış sitometresinde hücreleri analiz edin.
Not: örnekler 4 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunan eğer sinyal birkaç gün sabit kalır.
- Veri toplama
- işletim yazılımının akış sitometresinin bir çalışma sayfasında Açık iki nokta araziler. Birinci ve ikinci SSA-A karşı FSC A FSC H karşı FSC bir dizi. PE-Cy5 kanalı için bir histogram açın.
- FSC-A ve FSC-H arsalarında, singlet olaylarını seçerek bir geçit (R1) oluşturun ( Şekil 1A ).
- R1 popülasyonunu FSC-A'ya karşı SSA-A nokta-grafiğine ayarlayın ve sonra hedef hücreleri seçerek yeni bir kap (R2) yapın ( Şekil 1B ). Hücrelerin frekans dağılımını görmek için R2 popülasyonunu PE-Cy5 yoğunluk histogramında ayarlayın.
- Negatif ve izotip kontrolü ( Şekil 1C ) kullanarak PE-Cy5 kanalı için alt floresans yoğunluğu (FI) sınırını ayarlayın.
- Referans ürünün daha yüksek konsantrasyonda örneklemden R2 içerisinde 10.000 olay elde edin. Bu numunenin FI'sı beklenen en yüksek değer olmalıdır ( Şekil 1C ).
- Geri kalan örnekleri alın.
- Her örnek için, PE-Cy5 kanalında ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) elde edin.
- Referans veya biosimilar mAb'si olan numuneler için, MFI ile izotip kontrolünün (ΔMFI) arasındaki farkı hesaplayın.
2. CDC'nin Değerlendirilmesi
- Biyolojik materyal ve reaktiflerin hazırlanması
- Yukarıda açıklandığı gibi hücre kültür ortamı ve kültür Daudi ve Daudi GFP + hücreleri hazırlayın (adım 1.1.1 - 1.1.2).
NOT: Ek olarak, CDC tahlili serumsuz RPMI'yi gerektirir. - Serumsuz RPMI ile normal insan serum tamamlayıcısı (NHSC) 1: 2 seyreltin. 2.5 mL hazırlayın.
- RPMI ile 1: 2 seyreltilmiş 1 mL ısı ile inaktive (30 dakika / 56 ° C) NHSC hazırlayın.
- Serumsuz RPMI'de referans ve biyolojik olarak benzer mAb'ler için test setleri hazırlayın. 1 ila 0.025 μg / mL arasında on seyreltme (her biri 200 mcL) yapın.
- Yukarıda açıklandığı gibi hücre kültür ortamı ve kültür Daudi ve Daudi GFP + hücreleri hazırlayın (adım 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC tahlili
- Kültürlerden Daudi ve Daudi GFP + hücrelerini toplayın ve hücre yaşayabilirliğini ölçün (adım 1.2.1 - 1.2.3'e bakın).
- Serumsuz RPMI'de 4 x 10 5 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Eklemek96 pozitif konik (V) alt tabaka mikrofazarda her bir referansın 50 μL'sine 50 uL hücre süspansiyonu veya biosimilar mAb test konsantrasyonu. Her deneysel durum için tekrarlar ekleyin.
- Negatif kontrol ( yani mAb olmadan), bazal ölüm kontrolü ( örn., MAb varlığında ısı ile inaktive edilmiş NHSC) ve pozitif kontrol lekesi için ek kuyucuklar hazırlayın ( örn., 50 μL% 70 EtOH maruz bırakılan hücreler).
- Hücreleri,% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosferde 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.
- Her oyuğa 50 mcL NHSC (1: 2 oranında seyreltilmiş) ilave edin ve opsonize edilmiş hücreleri 37 ° C'de 2.5 saat süreyle% 5 CO 2 nemlendirilmiş atmosferde inkübe edin. Bazal ölüm kontrol kanallarında ısı ile inaktive NHSC'yi kullanın.
- 10 dakika boyunca 400 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- 150 uL PBS ekleyerek ve 400 xg ve 10 ° C'de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonunu santrifüj ederek hücreleri yıkayın. DiSüpernatant scard.
- Daha önce 7, 8 tarif edildiği gibi, 7-aminoactinomycin (7-AAD) ile örnekleri leke.
- Aynı gün bir akış sitometresinde hücreleri analiz edin.
- Veri toplama
- işletim yazılımının akış sitometresinin bir çalışma sayfasında Açık iki nokta araziler. 1.3.3 (Şekil 2A-B) - adımda 1.3.1 içinde olduğu gibi araziler ayarlayın. R2 nüfusa 7-AAD karşı GFP için bir nokta-komplodur üçüncü arsa oluşturun.
- Daudi hücreleri kullanılarak yeterli FI sınırlarını tanımlar, Daudi, GFP + hücreleri ve ölüm pozitif kontrol (Şekil 2C).
- Her bir örnek için, 7-AAD + hedef hücrelerin yüzdesini ölçer. R2, en az 5000 olayları elde edin.
- Farklı olan örneklerde bulunan yüzde bazal ölüm kontrol 7-AAD + 'nın yüzdesi çıkarılarak spesifik mAb kaynaklı sitotoksisiteyi hesaplamak( Şekil 2D ).
3. Biyoeşdeğerlik Analizi
- Konsantrasyon ve yanıt değerlerini bir grafik yazılımına girin.
- Grafikler üretin ve aşağıdaki hatalarla doğrusal olmayan regresyonları hesaplayın: i) mAb konsantrasyonunun log dönüşümünü "X" olarak kullanın; Ii) değişken eğim matematiksel modelini kullanın (Y = minimum tepki + (maksimum tepki - minimum tepki) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * tepe eğimi)); Ve iii) bazal tepki çıkarıldığından taban değerlerini sıfıra sınırlayın.
NOT: Simetrik sigmoidal şekle sahip eğrilerin olması beklenir. - Hem doğrusal olmayan uyumu F-testi (birçok grafik yazılım programı, bu özelliği içerir) kullanarak küresel uyumu ile karşılaştırın.
NOT: Bu tür testler, maksimum yanıt, logEC 50 ve Hill eğiminin, iki veri kümesi için aynı olduğu ve bu kütle ile uyuşan boş hipotez oluşturmaktadır.Ele alınması amaçlanan biyolojik soru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, bağlanma hedef ve referans rituksimab CDC indüksiyon Asya'da üretilen biyobenzer rituksimab o ve ticari olarak temin edilebilen paralel olarak karşılaştırıldı.
Daudi hücreleri, her iki mAb de, konsantrasyona bağlı bir şekilde (Şekil 1D) CD20 bağlandı. Bağlanma verilerinin doğrusal olmayan regresyon referans ve biyobenzer rituksimab, sırasıyla (Şekil 1 E) için 0.978 ile 0.848 arasında bir r 2 gösterilir. konsantrasyon-yanıt eğrileri istatistiksel analizi de, ve bu hesaplanan nedenle farmakodinamik parametreler, mAb (p <0.0001) arasında anlamlı bir farklılık olduğunu gösterdi. biyobenzerin için maksimal yanıt referans ürünün etkisinden daha düşük 2.16-kat. Bu sonuçlar iki değerlendirdi mAbler CD20 üzerime ifade bağlamak için farklı kapasitelere sahip olduğunu düşündürmektedirLösemi hücrelerinin mbranı.
CDC indüksiyonu da iki mAb ile karşılaştırıldı. Referans ve biyo-benzeri ürünler Daudi hücrelerinde CDC'yi konsantrasyona bağlı bir tarzda uyarmıştır ( Şekil 2E ). Önemlisi, mAb'lerin CDC'yi indüklediği konsantrasyonlar, hedef bağlama için gerekli olan konsantrasyonlardan farklıydı. CDC verilerinin doğrusal olmayan regresyonları, her iki ürün için de r 2 > 0.980 verdi. Konsantrasyon-cevap eğrilerinin istatistiksel karşılaştırması, biyobenzerleri daha az güçlü hale getiren, önemli ölçüde farklı olduklarını gösterdi (P <0.01). Bu veriler, CDC'yi indükleme kapasitesinin analiz edilen mAb'lar için farklı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. Anti-CD20 Terapötik mAb'lerin İn Vitro Hedefe Bağlanması. Daudi GFP + hücreleri,mAb'lerin ent konsantrasyonları (4.8 ng / ml 5 ug / mL) ve daha sonra PE-Cy5-konjüge edilmiş anti-insan sekonder antikor ile boyandı. Flüoresan yoğunluğu (FI) sitometrisi Daudi hücrelerine (B) karşılık gelen bir boyut ve ayrıntı tek sonuç (A), üzerinde akış ile ölçülmüştür. Boyanmamış hücreler (açık gri), izotip kontrol (koyu gri) ve 5 ug referans rituksimab (mavi) / mL FI sınırları (C) ayarlamak için kullanıldı. Her ikisi de değerlendirildi mAb'ler bir konsantrasyona bağlı bir şekilde (D) Daudi hücreleri bağlandı. Yanıtlar (ΔMFI; metne bakınız) referans (mavi) ya da biyobenzer (siyah) rituksimab (E) konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak için kullanıldı. Doğrusal olmayan regresyon istatistiksel karşılaştırma mAbs arasındaki farkları (Fisher kesin testi p <0.0001). Daha büyük Versi görmek için buraya tıklayınBu rakam üzerine.
Anti-CD20 Terapötik mAbs tarafından Şekil 2. CDC indüksiyonu. MAb'ler farklı konsantrasyonları ile opsonize Daudi GFP + hücreleri, insan tamamlayıcı maruz bırakılmıştır. Hücre ölümü 7-AAD boyama ve boyut ve parçalı Daudi hücrelerine (B) karşılık gelen tek sonuç (A), ilgili floresan yoğunluğu (Fİ) akış sitometrik analizi ile değerlendirilmiştir. Lekesiz GFP (siyah) ve GFP + (yeşil) hücreleri ve etanol öldürülmüş hücreler (kırmızı) kontroller (C) olarak alındı. MAb kaynaklı sitotoksisite (D) hesaplanması için izin verilen temel ölüm kontrol (gri) ve rituksimab örnekleri (mavi) 7-AAD + hücrelerinin miktarının belirlenmesi. Referans (mavi) ya da biyobenzer (siyah), rituksimab için elde edilen konsantrasyon-tepki eğrileri, (E). Doğrusal olmayan regresyonların istatistiksel karşılaştırması, iki mAb tarafından uyarılan yanıtlar arasında farklılıklar gösterdi (P <0.01; Fisher exact testi). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 1. CDC Testi için Hedef Hücrelerle Terapötik Kullanım İçin Onaylanan Monoklonal Antikorlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terapötik mAb'nin patent sona ermesi, biyosimilarların gelişimini desteklemektedir. Dolayısıyla, bu ürünlerin klinik olarak ilgili faaliyetlerindeki farklılıkları belirleyebilen basit yöntemlere ihtiyaç vardır. CD20 + kültürlü hücreler rituximabın iki önemli fonksiyonel özelliğinin değerlendirilmesi için kullanılmıştır: hedef bağlama ve CDC indüksiyonu. Önceki aktivite, CD20'nin mAb'nin Fab bölgesi tarafından tanınmasını gerektirirken, sonuncusu esasen Fc bölgesinin komplemanının etkileşimine bağlıdır 9 . Bu nedenle, bu tahliller mAb'lerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerini bağlamanın bir yolunu sağlar.
Terapötik mAb'lerin hedef bağlanması genellikle izotermal titrasyon kalorimetresi (ITC), yüzey plazmon rezonansı (SPR) veya biyolayer interferometri 10 , 11 , 12 ile değerlendirilir. Bu tahliller afFinite hesaplaması, ancak özel ekipman ve eğitim gerektirir. Burada açıklanan protokol, yakınsama verileri olmaksızın, ürünlerin arasındaki farklılıkları tanımlamak için hedef bağlamayı yan yana karşılaştırmada değerlendirir. Yöntem basittir ve aktivite değerlendirmesi için ilgili bir hücresel bağlam kullanmaktadır. Öte yandan, rituksimab ile CDC indüksiyonu ATP ölçümü 13 , salınan laktat dehidrogenaz (LDH) 14 veya alamarBlue 15 ve MTT analizleri 16 ile değerlendirilebilir. Burada bildirilen 7-AAD boyama metodu düşük arka plana sahiptir ve multiparametrik akış sitometrik analizi için diğer lekelerle kombine edilebilir.
Sunulan temsili deneylerde, doz-yanıt eğrileri, dört parametreli lojistik modeli taktı ve EC 50 , tepe eğimi ve maksimum yanıtın hesaplanmasına izin verdi. Özellikle, konsantrasyon aralıklarıons analiz etmek ve ön deneylerde yeterli aralıkları tanımlayan önemini vurgulamaktadır, bu eğriler, her bir deney için farklı oluşturmak için kullanılabilmektedir. Bu tür florokromlar ve tamamlayıcı veya farklı bir hedef düzeyine sahip bir hücre hattının kullanımı gibi önemli reaktifleri değişiklikler, konsantrasyon etkin çalışma alanına değiştirebilir.
İstatistiksel analiz hedef bağlanma bölgesi ve CDC indüksiyonu hem de bir Asya'da ticari olarak temin edilebilen bir biyobenzer rituksimab kesikli ve referans ürün arasındaki farklar tespit edilmiştir. MAb'lerin üretim süreci sıkı kontrol edilir bile, referans ürünün her özellik bir dizi görüntüler, göz önüne almak önemlidir. Bu duruma göre, benzer bir biyoterapötik değerlendirilmesinde test edilmelidir gruplar en az sayıda, bu protokoller Differe için uygulanması gereken .Thus referans ürün değişkenliği ölçüde ve deney değişkenliği 4 bağlıdırKarşılaştırılabilirlik değerlendirilirken nt yığınları.
Sunulan yöntemler, antijen eksprese eden hücrelere erişilebildikleri sürece diğer terapötik mAb-hedef çiftlerine ekstrapolasyon yapılabilir. Tablo 1 , CDC indüksiyonunun klinik etkinlikle ilişkili olduğu rituksimab dışındaki terapötik mAb'leri listeler ve her mAb için önceden bildirilen hücresel modeller hakkında bilgi derlemektedir.
Sonuç olarak, burada açıklanan iki tahlil, çoğu laboratuarda uygulanmasına izin veren basit, hızlı ve ucuzdur. Yöntemler, biyo-benzeri gelişimin ilk basamaklarında veya üretim sırasında partiden kıyaslamaya ilişkin yasal onayın ardından kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González ve SM Pérez-Tapia, çeşitli ilaç firmaları için biyolojik benzerlik çalışmaları yapan UDIBI çalışanlarıdır.
Acknowledgments
Yazarların onayları yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
