Abstract
Coltura cellulare monostrato non adeguato a modellare il comportamento in vivo dei tessuti, che comporta complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Tridimensionali tecniche di coltura (3D) delle cellule sono una recente innovazione sviluppata per colmare le lacune di coltura cellulare aderente. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare analoghi tessuti in vitro, questi metodi spesso sono complesse, costose da stabilire, richiedono attrezzature specializzate, e sono generalmente limitate dalla compatibilità con solo alcuni tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo rapida e flessibile per aggregare cellule in sferoidi 3D multicellulari di taglia costante che è compatibile con la crescita di una varietà di tumori e linee cellulari normali. Utilizziamo diverse concentrazioni di siero e metil cellulosa (MC) promuovere ancoraggio-indipendente generazione sferoide e prevenire la formazione di monostrati di cellule in un modo altamente riproducibile. Condizioni ottimali per indivlinee cellulari idual possono essere realizzati regolando MC o concentrazioni sieriche nel mezzo formazione sferoide. Gli sferoidi 3D generati possono essere raccolti per l'uso in una vasta gamma di applicazioni, tra cui segnalazione cellulare o studi di espressione genica, screening di farmaci candidati, o nello studio dei processi cellulari, come l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi clonali da singole cellule, e può essere adattato per valutare crescita ancoraggio-indipendente e anoikis-resistenza. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo facilmente modificabile per generare e utilizzare sferoidi cellulari 3D per ricapitolare microambiente 3D dei tessuti e modellare la crescita in vivo di cellule normali e tumorali.
Introduction
Biologicamente rilevanti valutazione del comportamento delle cellule tumorali è impegnativo utilizzando tradizionali bidimensionali (2D) metodologie di coltura cellulare, in parte perché questi non riflettono adeguatamente il microambiente delle cellule presenti in vivo. Approcci alternativi comprendenti componenti della matrice extracellulare nella cultura (ad esempio, Boyden saggi da camera) sono fisiologicamente più rappresentativi dell'ambiente tessuti in vivo. Tuttavia, possono essere limitati a valutazione del comportamento singola cella, e non ricapitolano complesso in combinazioni vivo di cellula-matrice e cellula-cellula interazioni che contribuiscono al tessuto o tumore crescita 1, 2, 3.
L'uso di sferoidi multicellulari è un approccio recente che riproduce più accuratamente l'architettura compatta nella crescita cellulare vivo 1,4. Sferoidi possono essere usati per studiare le interazioni cellula-matrice di cellule normali, ma può anche agire come analoghi tumorali per modellare caratteristiche della progressione tumorale, come la crescita metastatica o resistenza ai farmaci 4.
Sferoidi possono essere formati dalla proliferazione di cellule singole annegate in una matrice 5, o più rapidamente, promuovendo l'aggregazione di più celle per formare un unico cluster cellulare (per esempio, appendere goccia, metodi centrifugazione) 6, 7. Esistenti tecniche di aggregazione delle cellule possono richiedere materiali costosi o di attrezzature specializzate. Inoltre, questi sferoidi hanno una vasta gamma di dimensioni e morfologie e possono essere difficili da produrre in grandi quantità, fare confronti tra le condizioni di crescita o trattamenti difficili. Infine, sferoidi generati da questi metodi possono essere difficile isolare dal extracel proteinicomatrice lular in cui sono incorporati da utilizzare in altre applicazioni.
Qui, descriviamo una metodologia di aggregazione cellulare robusto e facilmente modificabile per la rapida formazione di sferoidi di cellule di dimensioni sempre utilizzando disponibili in commercio piastre di celle-repellente U-basso e una matrice di adesione di promozione inerte, metilcellulosa. Una volta formati, questi sferoidi multicellulari sono facilmente isolati per uso in una vasta gamma di applicazioni. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi attraverso la proliferazione cellulare, che può essere utilizzato per valutare altri processi cellulari. Qui, dimostriamo saggi di invasione delle cellule, quantificati da immunofluorescenza, e un saggio anoikis, a titolo di esempio le applicazioni di queste due differenti protocolli di formazione sferoide.
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Protocol
NOTA: Tutti i reagenti e materiali di consumo sono elencati nella Lista dei materiali.
1. Produzione Spheroid da Cell aggregazione
- Soluzione metil cellulosa: Preparare 100 ml di 100 mg / mL metil cellulosa.
- Calore 50 mL ultrapura H 2 O a 80 ° C. Aggiungere 10 g di polvere di cellulosa di metile e agitare fino a quando le particelle sono uniformemente disperse.
- Portare a volume finale con ultrapura freddo H 2 O e mescolare a 4 ° C fino a quando la soluzione diventa chiara, paglia di colore, e non contiene solidi visibili.
- Passare attraverso un filtro da 0,45 micron per rimuovere i solidi non disciolti. soluzione preparata possono essere aliquotato e conservato a 4 ° C fino a 12 mesi.
NOTA: Metil cellulosa funge non citotossica, inerte, agente di sospensione per migliorare l'adesione cellula-cellula e scoraggiare la formazione di un monostrato di cellule aderenti. Metil cellulosa è solubile in acqua e può essere lavato via dopo sphergenerazione OID.
- Media formazione Spheroid
NOTA: Preparare medio formazione sferoide immediatamente prima dell'uso. Non conservare.- Diluire soluzione metil cellulosa a 1-5 mg / ml nel terreno di coltura appropriato.
- Passare attraverso un filtro 0,22 micron per sterilizzare e rimuovere i solidi non disciolti.
- Tampone fosfato Dulbecco (PBS)
- Diluire a 1x e passare attraverso un filtro da 0,45 micron prima dell'uso. soluzione preparata può essere conservata indefinitamente a temperatura ambiente.
- Produzione di celle sferoide (Figura 1)
NOTA: Preparare tutti i reagenti in anticipo. È importante evitare la contaminazione delle soluzioni da polvere, fibre o altre particelle insolubili. La presenza di questi contaminanti avrà effetti negativi sulla formazione sferoide. Terreno di coltura e altre soluzioni devono essere fatti passare attraverso un filtro da 0.45 micron per rimuovere queste particelle quando posbile. Evitare l'uso di pipette di cotone filtrata durante il trasferimento di soluzioni come queste possono introdurre fibre supplementari.- monostrati cellulari Cultura al 70% di confluenza nella cultura appropriata medio supplementato con 10% di siero. Aspirare terreno di coltura e risciacquare con PBS 1x per rimuovere i detriti. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA (0,05% tripsina) di tampone di dissociazione a 10 cm piatto di coltura cellulare, e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
- Ispezionare le cellule al microscopio a 10X di ingrandimento per confermare il distacco. Neutralizzare tampone di dissociazione con 7 ml di terreno di coltura di siero-integrato.
- sospensione cellulare centrifugare a 500 xg per 10 min per le cellule delicatamente pellet.
- Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di media formazione sferoide con una pipetta P1000 con una punta di filtro.
NOTA: La sospensione cellulare deve essere priva di grumi.- Per triturare pellet cellulare, premere la punta della pipetta contro la parte inferiore del tubo con una leggera angolazione, mentrepipettaggio al taglio pellet cellulare. Evitare di triturazione più di 3 - 5 volte come questo può danneggiare le cellule. Pipetta lentamente e non espellere tutto il contenuto della punta della pipetta per evitare di creare bolle.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per 1 x 10 4 cellule / ml.
NOTA: Il numero di cellule può essere ottimizzato per generare sferoidi di varie dimensioni. Trypan blu colorazione delle cellule danneggiate può essere utilizzato per confermare la vitalità delle cellule risospese. - sospensione cellulare Trasferire in un serbatoio multicanale pipetta senza polvere sterili e utilizzare puntali con filtro per erogare 100 ml in ciascun pozzetto di una ben 96 piastra di cella-repellente U-bottom.
- Serbatoio di risciacquo con filtrata ultrapura H 2 O per rimuovere la polvere e le fibre.
- Mescolare la sospensione cellulare periodicamente mentre semina per impedire alle cellule di depositarsi sul fondo del serbatoio. Per evitare di creare bolle, utilizzare una tecnica di pipettaggio inverso durante la miscelazione e dispensing.
- Piastre di trasferimento di coltura tissutale incubatore (37 ° C e 5% di CO 2) e ispezionare tutti i giorni per la formazione sferoide. Le cellule devono depositarsi sul fondo di ciascun pozzetto entro 6 ore e generalmente aggregarsi in uno sferoide entro 24-48 h (Figura 2).
- Per la conferma della formazione sferoide successo, utilizzare una punta di p10 e delicatamente pipetta medie sopra la sferoide osservando al microscopio a 10X di ingrandimento. Correttamente sferoidi formate qualsiasi allentamento dalla piastra and roll, confermando la loro struttura 3D.
NOTA: metilcellulosa e le concentrazioni sieriche devono essere determinati per titolazione per ciascuna linea cellulare di cedere la formazione di un singolo sferoide per pozzetto. Condizioni ottimizzati in questo modo per linee cellulari selezionate sono mostrate in Tabella 1, ed esempi di sferoidi formate in Figura 2B. Sferoidi possono essere coltivate per più di indicata, ma man mano che diventano più grandi crescono progressivamente più difficileper gestire senza frammentazione. Se le cellule formano un monostrato, sferoidi satellitari, o non riescono a depositarsi sul fondo del pozzo, la concentrazione di metilcellulosa e siero può essere ulteriormente regolata per la formazione sferoide ottimale (Figura 3B). Non utilizzare sferoidi contenenti contaminanti quali fibre o polveri (figura 3A). sferoidi preformate possono essere trattati con composti di interesse, come fattori di crescita, le macchie di cellule vive, o inibitori per l'analisi.
2. Spheroid Invasion Assay (figura 4)
- collagene neutralizzato
- Raffreddare tutti i liquidi a 4 ° C e mantenere in ghiaccio quando si lavora con collagene per prevenire la polimerizzazione indesiderata.
- Preparare freschi 0,1 M e 0,01 M soluzioni di NaOH e fresco 0.1 M HCl in ultrapura H 2 O. Passo tutte le soluzioni attraverso 0,22 micron filtri.
- Mescolare tipo bovino 1 del collagene (3,1 mg / ml di), 0,01 M NaOH e 10x PBS (8: 1: 1 rapporto in volume) e regolare a pH 7,4 utilizzando freddo 0,1 M NaOH e HCl. La concentrazione finale di collagene è 2,5 mg / mL.
- Preparare abbastanza collagene neutralizzato per riempire il recipiente di imaging ad una profondità di 2-3 mm. è richiesto un minimo di 100 microlitri per ciascun pozzetto della 8 pozzetti di coltura tissutale vetrino da camera riportate nella tabella MATERIALI List.
- Incorporare sferoidi in collagene (figura 4)
- Rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una slitta 8 pozzetti camera di coltura tissutale con un minimo di 50 microlitri collagene neutralizzato.
- Usare la tecnica di pipettaggio inverso per evitare di creare bolle nel collagene. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere il collagene in modo uniforme su tutta la superficie bene.
NOTA: Questo strato di base di collagene terrà sferoidi in sospensione ed è di solito di spessore 1-2 mm. Lo strato di base minimizza la formazione di un menisco sullo strato superiore collagene. Se lo strato di base è troppo sottile, sferoidi possono entrare in contatto con il fondo della slitta da camera eformare un monostrato di cellule.
- Usare la tecnica di pipettaggio inverso per evitare di creare bolle nel collagene. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere il collagene in modo uniforme su tutta la superficie bene.
- Posizionare il vetrino da camera, e da 35 mm piatto di coltura di tessuti pieno di ultrapura H 2 O, in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Incubare a 37 ° C fino a quando il collagene viene polimerizzato, tipicamente 1 h. Conservare rimanendo neutralizzato collagene sul ghiaccio.
NOTA: Il 35 millimetri piatto pieno d'acqua fornirà l'umidità e prevenire l'essiccazione. La diapositiva camera deve rimanere in questa camera di umidità durante tutta la seduta. Lo strato di base di collagene può essere lasciato a polimerizzare durante la notte. incubazioni più lunghe provocano tipicamente un gel più rigida. - Utilizzando una punta di filtro P 1.000, raccogliere sferoidi preformate (step 1.4.7) dalla piastra cellulare repellente 96 pozzetti U-bottom in 1,5 ml scatto top tubi. Pipetta lentamente ed evitare ripetuti o pipettaggio vigorosa per ridurre al minimo fluido taglio di sferoidi. sferoidi multiple possono essere raggruppati in un unico tubo per il trasferimento di un bene del 8 pozzetti di coltura tissutale vetrino da camera.
- Centrifugare sferoidi raccolti in un tablETOP microcentrifuga a 2.000 xg per 2-5 s e rimuovere il surnatante con una pipetta p200. Evitare di centrifugazione più a lungo del necessario, in quanto ciò potrebbe causare sferoidi a rompere a pezzi o ciuffo insieme.
NOTA: dopo aver pipettato via la maggior parte del surnatante, il tubo può essere invertita con cura su un tovagliolo di carta pulito per allontanare il liquido in eccesso. Non permettere sferoidi ad asciugare. - Utilizzando una punta larga foro P200, risospendere delicatamente sferoidi in 50 microlitri di collagene neutralizzati. Fate questo per ogni tubo di sferoidi raccolti prima che sferoidi vengono trasferiti nella diapositiva camera. Mantenere sferoidi che sono state risospese in collagene neutralizzato in ghiaccio fino al momento per il trasferimento di diapositive da camera.
- Rimuovere scorrevole della camera da incubatore e pipetta accuratamente la miscela di sferoide-collagene in cima strato di base di collagene. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino collagene è polimerizzato.
- Non somministrare l'intero contenuto della pipetta per evitare di creare bolle. DropwISE pipettaggio riduce le possibilità di disturbare lo strato di base di collagene.
- Lentamente aggiungere un minimo di 100 microlitri riscaldato terreno di coltura contenente chemoattractants desiderati, inibitori o altri trattamenti per ogni pozzetto del vetrino camera. I contenenti sferoidi strato di collagene possono strappare se il liquido viene pipettato su di esso troppo energicamente. Terreno di coltura può essere erogato lentamente lungo il lato di un pozzo per non disturbare il collagene.
- Incubare vetrino camera a 37 ° C e 5% CO 2 per consentire l'invasione delle cellule. Cellulare invasione nella collagene circostante può essere osservato brightfield o fluorescenza imaging e quantificato da una varietà di metodi che utilizzano epifluorescenza, confocale microscopia foglio leggero.
- Rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una slitta 8 pozzetti camera di coltura tissutale con un minimo di 50 microlitri collagene neutralizzato.
3. Quantificazione di Invasion: Campo luminoso
- A intervalli di tempo prestabiliti, sferoidi immagine collagene-embedded ingrandimento 10x utilizzando un microscopio campo chiaro (fase 2.2.8).
NOTA: peresperimenti live-cella a lungo termine, una fase di microscopio riscaldata e di CO 2 da camera regolamentati possono essere utilizzati per mantenere sferoidi a 37 ° C e 5% di CO 2 durante l'imaging. - Quantificare invasività utilizzando software come ImageJ per misurare il numero di cellule che invadono nel collagene circostante e la distanza media invasa in ogni punto.
4. Quantificazione di Invasion: microscopia a fluorescenza con Live cellulare Stain
- Seguendo passo 2.2.8, integra il supporto nelle diapositive da camera con una macchia fluorescente, come DAPI, calceina AM, o altro composto di cellule-tracking appropriato alla linea cellulare secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Per la quantificazione di invasività, colorazione omogenea in tutto lo sferoide non è essenziale. Per applicazioni che richiedono una penetrazione più profonda di macchia, incubazione più lungo (> 3 ore), può essere necessario. - Rimuovere la macchia e sostituire con 500 microlitri di caldo PBS 1x. Incubate a 37 ° C per 10 minuti per rimuovere l'eccesso macchia. Ripetere almeno due volte.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza, acquisire sezioni ottiche attraverso sferoidi invasori.
NOTA: un'esposizione prolungata alla luce del laser deve essere ridotto al minimo durante l'imaging ripetitivo per limitare fototossicità e photobleaching. - Utilizzare software come ImageJ per generare un Z-proiezione, che può essere usato per quantificare la superficie totale dello sferoide, numero di cellule invasori, e distanze invaso nella matrice di collagene.
- Ad esempio, per quantificare l'invasione, regolare la soglia immagine escludere sfondo, evidenziando solo sferoide e invadere le cellule, e misurare la loro area. L'area dello sferoide originale può essere sottratto da questo totale quantificare invasività.
5. Quantificazione di Invasion: Immunofluorescenza
NOTA: Tutte le soluzioni e tamponi dovrebbero essere passati attraverso un filtro da 0,45 micron prima dell'uso Remove detriti, che possono influenzare negativamente la colorazione.
- Preparare il tampone di lavaggio PBS +. Preparare 1x PBS e aggiungere CaCl 2 e MgCl 2 ad una concentrazione finale di 0,1 mM. Non sterilizzare in autoclave buffer dopo CaCl 2 e MgCl 2 sono aggiunti. Soluzione può essere sterilizzata per filtrazione e conservati a temperatura ambiente.
- Preparare neutro buffer di fissazione in formalina tamponata (NBF). Aggiungere 5 gocce di NaOH 1 M a 0,6 g di paraformaldeide. Portare a 20 ml con PBS + e incubare a 60 ° C fino paraformaldeide viene sciolto (circa 1 h). Raffreddare a temperatura ambiente e aggiustare il pH a 7,4 con 1 M HCl.
NOTA: tampone fissaggio NBF dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell'uso. - Preparare albumina sierica bovina (BSA) tampone bloccante. Sciogliere BSA in PBS + al 3% w / v. Soluzione può essere sterilizzata per filtrazione e conservato a 4 ° C per diversi giorni, ma è meglio preparato fresco. Non riscaldare.
- Preparare permeabilizzazione buffer. Diluire Triton X-100al 0,2% v / v in PBS +.
NOTA: Permeabilizzazione tampone deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. - Facoltativamente, preparare Mowiol mezzo di montaggio. Combinare 2,4 g Mowiol, 6 g di glicerolo, e 6 mL ultrapura H 2 O. miscela per 3 ore in un rotore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubare con miscelazione a 50 ° C per 10 min.
- Centrifugare a 5000 xg per 15 min a pellet materiale insolubile. Aggiungere agente anti-imbianchimento, come ad esempio 2,5% DABCO. Conservare in 500 microlitri aliquote a -20 ° C.
- Immunofluorescenza di sferoidi (figura 5)
NOTA: Utilizzare una pipetta per aggiungere o rimuovere lentamente liquidi da slitta da camera. Evitare l'uso di un aspiratore, in quanto ciò può interrompere lo strato di collagene.- Preparare sferoidi e incorporare nelle diapositive da camera di collagene-riempita, come descritto nelle sezioni da 1 a 2.
NOTA: Il collagene autofluorescenza può essere minimizzato utilizzando strati sottili o piccoli volumi di collagen. - Rimuovere terreno di coltura il più possibile da ciascuna diapositiva camera.
- Brevemente risciacquare strato di collagene con 500 microlitri di tampone di lavaggio PBS + per rimuovere media residua.
- Aggiungere 500 microlitri di PBS fresco + tampone di lavaggio in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 minuti per lavare sferoidi. Ripetere due volte.
- Sostituire PBS + tampone di lavaggio con 500 microlitri di buffer NBF fissazione. Incubare a temperatura ambiente per 20 - 25 min.
- Rimuovere buffer di fissaggio NBF e risciacquare con 500 microlitri di tampone di lavaggio PBS +. Lavare per 5 minuti con PBS fresco + tampone di lavaggio da un minimo di 3 volte.
NOTA: fisso sferoidi possono essere conservati a 4 ° C in PBS fresco + tampone di lavaggio per diversi giorni. 0,01% di sodio azide può essere aggiunto al tampone di lavaggio per inibire la crescita microbica durante la conservazione. - Sostituire PBS + lavare tampone con 500 microlitri di buffer permeabilizzazione. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
- Facoltativamente, rimuovere BSA tampone bloccante. Utilizzando bisturi o forbici, spheroids accise e la circostante area di 3 millimetri x 3 mm dal livello di collagene. Utilizzando una punta larga foro p1000, rimuovere il blocco asportato del collagene sciacquando delicatamente con tampone BSA blocco fresco. Trasferimento a blocchi di collagene per 1,5 ml di tubo.
- Centrifugare a 2.000 xg per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Il tubo può essere attentamente invertita su un tovagliolo di carta pulito per allontanare il liquido in eccesso.
- Preparare sferoidi e incorporare nelle diapositive da camera di collagene-riempita, come descritto nelle sezioni da 1 a 2.
- Aggiungere l'anticorpo primario sferoidi ed incubare a temperatura ambiente per 1 h. Aggiungere un volume sufficiente di anticorpo primario tale che l'intero strato di collagene è uniformemente sommersa. I passaggi facoltativi sopra (5.6.8.1-5.6.8.2) tipicamente consentono l'utilizzo di piccoli volumi di anticorpi.
- Immergere vetrino da camera in un contenitore con almeno 10 ml di PBS + lavaggio bufFer per 10 minuti per lavare. Ripetere almeno due volte.
- Opzionale, se sferoidi sono stati asportati dallo strato di collagene in precedenza (punto 5.6.8.1), aggiungere un minimo di 1 ml di PBS + tampone di lavaggio al tubo 1,5 ml e agitare delicatamente. Lasciare a bagno per un minimo di 10 min.
- Rimuovere il più PBS + tampone di lavaggio possibile e ripetere il lavaggio con PBS + tampone di lavaggio da un minimo di due volte. Centrifugare a 2.000 xg per diversi minuti per far sedimentare blocco collagene.
NOTA: Pulire le superfici esterne del vetrino da camera strofinando con etanolo al 70% prima di immergersi nel tampone di lavaggio.
- Ripetere i passaggi 5.6.9-5.6.10 utilizzando appropriato anticorpo secondario.
NOTA: Se sferoidi sono state colorate direttamente nel vaso di imaging, passare al punto 5.6.13. - Opzionale, se sferoidi sono stati asportati dallo strato di collagene in precedenza (punto 5.6.8.1), pulite vetrini e vetrini microscopia confocale-compatibile con il 70% di etanolo.
- Rimuovere il tampone di lavaggio, per quanto possibile dal blocco collagene e risospendere in ultrapura H 2 O. Eseguire questo passo immediatamente prima del montaggio. Non lasciare i blocchi colorati ammollo in acqua.
- Utilizzando pinze fine punta, afferrare bordo del blocco collagene e trasferimento al vetrino.
- Utilizzando le pinze per tenere il collagene in luogo, utilizzare un batuffolo di cotone pulito per favorire il liquido in eccesso dal blocco collagene, facendo attenzione a non toccare direttamente il collagene.
NOTA: se il collagene diventa bloccato al tampone di cotone può essere rimosso con delicatezza o con pinze, o immergendo in acqua.
- Usando una tecnica pipettaggio inverso, dispensare 100 microlitri Mowiol mezzo di montaggio sul blocco di collagene e il luogo vetrino sul campione.
- Usare un tampone di cotone o un tovagliolo di carta per favorire l'eccesso Mowiol mezzo di montaggio e l'acqua da sotto il vetrino.
- Lasciare Mowiol mezzo di montaggio per indurire durante la notte a 4 °C. Seal bordi del coprioggetto con smalto.
- Immagine sferoidi macchiati utilizzando confocale o microscopia a fluorescenza per osservare la localizzazione delle proteine di interesse, formazione di strutture invasive, ecc (figure 5B, 5C).
NOTA: Stained sferoidi devono essere protetti dalla luce per evitare photobleaching.
6. anoikis Assay
NOTA: Il protocollo formazione sferoide si adatta facilmente a quantificare la crescita ancoraggio-indipendente e resistenza anoikis in una varietà di tipi cellulari.
- Semina cellule per l'analisi anoikis (Figura 6)
- Seguire le istruzioni per la produzione sferoide nella sezione 1.4, ma usare un minimo di 30 mg / mL metil cellulosa per la preparazione di media formazione sferoide.
NOTA: Quando riscaldato, 30 mg / mL metilcellulosa dovrebbe produrre un gel denso che contiene cellule in sospensione. - Incubare le cellule per diversi giorni o settimane e inspetto regolarmente a 10X di ingrandimento utilizzando un microscopio. Le cellule che resistono anoikis dovrebbero proliferare e formare colonie.
- Quantificare anoikis misurando il numero e le dimensioni delle colonie formate in ciascun pozzetto.
NOTA: Una volta formati colonie, possono essere lavati per rimuovere la metilcellulosa e utilizzati per saggi sferoidali basato, come descritto.
- Seguire le istruzioni per la produzione sferoide nella sezione 1.4, ma usare un minimo di 30 mg / mL metil cellulosa per la preparazione di media formazione sferoide.
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Representative Results
Descriviamo un metodo flessibile ed efficace per generare sferoidi discreti utilizzando piastre di celle-repellenti e mezzi di formazione sferoide integrato con MC. Nelle condizioni appropriate di MC e siero, singole cellule depositano ed aderiscono insieme al centro del pozzo per formare sferoidi con minima aderenza al fondo del pozzetto. Usando questo protocollo, sferoidi sono stati generati da una varietà di linee cellulari (Figura 2B). Titolazione di MC e le concentrazioni sieriche è richiesto per ogni linea cellulare di individuare le condizioni ottimali in cui si forma solo un singolo sferoide che è abbastanza robusta da permettere la manipolazione, senza frammentazione. In modo ottimale, gli sferoidi sono tra 200 e 500 micron di diametro, e consistevano di cellule strettamente aderenti con detriti cellulari minima. Spheroids sopravvissuti manipolazione delicata senza danni, permettendo loro di essere raccolti e utilizzati in un'ampia varietà di saggi.
(Figura 3a), che ha portato in aggregati di cellule morte. In presenza di polvere o altre contaminazioni fibra, multipla o gruppi di cellule di forma irregolare che sono stati solo debolmente aggregati formatisi e sferoidi risultanti facilmente dissolte durante il maneggiamento. Formazione Spheroid è stato influenzato anche da concentrazioni non ottimali di MC o siero nel mezzo di formazione sferoide (Figura 3B). Nel nostro test, molte linee cellulari erano in grado di aderire alle piastre cellula-repellenti in assenza o a basse concentrazioni, di MC, e portato alla formazione di uno sferoide circondato da un monostrato di cellule (Figura 3B-ii). crescita cellulare BxPC-3 in condizioni subottimali MC è mostrato come un esempio. In generale, più alta concentrazione di MC impedito cellule di aderire al pozzo, ma troppo elevata concentrazione di MC ridotta adesione cellula-cellula, e le cellule impeditosedimentazione al fondo del pozzo, causando la formazione di aggregati sciolti e numerosi sferoidi satellitari (Figura 3B-i). La concentrazione di siero influenzata anche sopravvivenza cellulare, e cellula-cellula e cellula-plastica e doveva essere ottimizzata per diverse linee cellulari. Per le linee cellulari come HCT-116 e PANC-1, una concentrazione troppo alta sierica provocato eccessiva proliferazione cellulare e produzione di sferoidi di grandi dimensioni che sono stati danneggiati da manovre, o di promuovere l'adesione delle cellule alla plastica bene e la formazione di un monostrato ( Figura 3B-iii). È interessante notare che gli effetti di siero insufficiente differivano tra linee cellulari. la sopravvivenza delle cellule HCT-116 è stato ridotto e le sferoidi formate erano piccoli, contenente una grande percentuale di cellule morte in basso siero. In contrasto, cellule PANC-1 erano vitali in assenza di siero, ma divennero più aderenti, e ha formato molteplici aggregati nonché un monostrato di cellule (Figura 3B-iv, v).
Una modifica del protocollo descritto formazione sferoide, in cui le singole cellule sono sospese in maggiore concentrazione MC (30 mg / mL) possono essere utilizzati per monitorare la resistenza anoikis. A queste concentrazioni MC, medio può ancora essere trasferito dalla pipetta mentre fresco, ma addensato in un gel solido a 37 ° C. Cellule anoikis resistente risospese in questo mezzo rimaste in sospensione e proliferare in un periodo di 2-4 settimane, formando sferoidi sospesi di varie dimensioni (Figura 6B). cellule Anchorage-dipendenti non formano sferoidi in queste condizioni. Siamo stati in grado di quantificare anoikis resistenza contando il insensibileer di sferoidi formata in ciascun pozzetto.
Figura 1: Panoramica dei 3D Spheroid Formazione protocollo. Le cellule in coltura monostrato sono dissociate, contati, in pellet, e risospese in mezzo di formazione sferoide integrato con metilcellulosa (MC) e siero (I-IV). La sospensione viene seminato in una piastra di cella repellente U-bottom alla densità desiderata per permettere la formazione di sferoidi delle dimensioni desiderate (v), e la piastra è incubata per produrre un singolo, discreta sferoide cellule in ciascun pozzetto (vi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ottimizzato sferoide Formazione condizioni.(A) formazione Spheroid in condizioni ottimali per le cellule SH-SY5Y. 1.000 cellule seminate in piastre cellulari repellente U-bottom in mezzi addizionato con 5% di siero e 1 mg / mL MC aggregati in sferoidi compatti entro 24 h. (B) Immagini rappresentative della sferoidi formate da varie linee cellulari in condizioni ottimali indicati nella tabella 1. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Formazione Spheroid Sotto non ottimali condizioni. (A) Spheroids formate in presenza di contaminanti. La contaminazione microbica ha provocato la morte delle cellule e sferoidi liberamente aggregati. In presenza di contaminanti insolubili, come polvere o fibre, cellule aderito a questi materiali e non AGGREGmangiò. (B) la formazione Spheroid in media formazione sferoide non ottimale. BxPC-3 cellule seminate in presenza di un eccesso di MC (10 mg / mL) formano numerosi sferoidi satellite (i), mentre insufficienti MC (0 mg / mL) portato in aggregati di cellule che hanno aderito al fondo del pozzetto e formano un monostrato (ii ). sono stati osservati risultati simili per altre linee cellulari testate (non mostrati). siero in eccesso (20%) ha comportato un aumento HCT-116 proliferazione cellulare e monostrato formazione (iii). siero insufficiente (0%) ha avuto effetti specifiche della linea di cellule che vanno dalla morte cellulare nelle HCT-116 (iv) per la formazione di sferoidi satellitari in PANC-1 (v). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Invasion Assay Utilizzando Spheroids. (A) Overview del saggio di invasione sferoide. Il vaso di imaging è pre-rivestito con uno strato di collagene neutralizzato ed incubata per polimerizzare il collagene (I-II). sferoidi preformati sono raccolti in provette da 1,5 ml e risospese in collagene neutralizzato (III-VI). La miscela sferoide-collagene è sovrapposto alla base-strato di collagene e incubato per polimerizzare il collagene (vii-viii). terreno di coltura contenente composti desiderato viene quindi sovrapposto strato sferoide-collagene polimerizzato e incubato per permettere l'invasione delle cellule (ix-x). (B) In presenza di un fattore chemiotattico, le cellule sono presenti invadere nella matrice di collagene surrounding un incorporato PANC-1 sferoide nei punti temporali indicati. Ogni pannello mostra l'immagine di un contrasto di fase acquisite utilizzando un obiettivo 10X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: immunofluorescenza colorazione di Spheroids Collagene-embedded. (A) Presentazione di protocollo per immunofluorescenza di sferoidi. sferoidi incorporati vengono lavati, fissi (NBF), e bloccato (BSA) direttamente nel recipiente di imaging. Sferoidi possono essere colorati direttamente, o asportati e colorate in un volume più piccolo, ad esempio una provetta da 1,5 ml. Sferoidi devono essere lavati con il tampone in eccesso dopo ogni macchia di ridurre al minimo fluorescenza di fondo. sferoidi Stained possono essere esposte direttamente in nave o montati sotto un coprioggetto per l'imaging e la conservazione. Immagini (B) Immunofluorescenza di uno sferoide cellule TPC-1 incorporato in collagene e permesso di invadere per 24 h. (C) immagini che mostrano le cellule falloidina colorate tipiche di regioni di cui B. Ogni pannello mostra a 20 micron Z-proiezione (0,2 micron passi) ha acquisito utilizzando un obiettivo 60X: cellule all'interno della sferoide body circa 20 micron dalla superficie (1), cellule sporgenti in collagene (2), e le cellule invadenti attraverso collagene (3). Barre di scala = 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Formazione Spheroid anoikis Assay. (A) Presentazione di protocollo per il dosaggio anoikis. Le cellule sono preparati come descritto nella figura 1, ma sono risospese in terreno formazione sferoide contenente almeno 30 mg / mL MC che forma uno strato spesso per tenere singole cellule in sospensione e prevenire l'aggregazione cellulare (i-ii). La sospensione cellulare è seminato in piastre cellulari repellente U-bottom e incubato (iii-iv). Le cellule in sospensione possono essere monitorati per la formazione sferoide dalla proliferazione, indicando la resistenza anoikis. (
| Cell Line | MC (mg / ml) | Serum (%) | incubazione approssimativa tempo |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 ore |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 a 5 giorni |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 a 7 giorni |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 a 4 giorni |
| TT | 1 | 10 | 7 a 10 giorni |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 a 2 giorni |
Tabella 1: Optimal Formazione Spheroid Media Composizione e di incubazione per linee cellulari convalidato.
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Discussion
Vi presentiamo un metodo rapido e flessibile per la produzione di sferoidi di cellule 3D per modellare l'architettura dei tessuti in vivo utilizzando reagenti poco costosi e facilmente reperibili. Il nostro protocollo sfrutta le proprietà non citotossiche e adesione di promozione di MC 8, 9 per mediare l'aggregazione delle cellule e ridurre al minimo la formazione di monostrato cellulare. Diversamente matrici a base di proteine isolate da fonti animali, MC è inerte, non contiene fattori di crescita, ed è facilmente rimosso mediante lavaggio, consentendo isolamento di sferoidi per uso in una varietà di applicazioni senza la presenza di matrice di residuo. Il nostro protocollo utilizza una rapida aggregazione di numeri di cellulare coerenti per generare sferoidi omogeneamente dimensioni, consentendo confronti diretti di sferoidi coltivate in varie condizioni sperimentali. Questo metodo può essere adattato per colture miste per modellare in crescita tumorale in vivo combinando numeri fissi di più tipi di cellule tumore-associati (ad esempio, i fibroblasti, leucociti, cellule stromali) per rappresentare con maggiore precisione l'ambiente del tumore.
Modifiche delle nostre cellule del protocollo utilizzando seminate in alte concentrazioni di MC possono essere fatte per monitorare la crescita ancoraggio-indipendente di cellule capaci di proliferare in sospensione, e possono essere impiegate come dosaggio anoikis (Sezione 6) per identificare o quantificare trasformazione cellulare. Sferoidi generati dal nostro protocollo sono ideali per applicazioni quali lo screening di stupefacenti, permettendo il confronto della crescita cellulare, il metabolismo, la sopravvivenza, e l'invasività tra le condizioni di trattamento. Isolati sferoidi possono anche essere incorporati in una matrice extracellulare, come il collagene, per valutare e quantificare l'invasività delle cellule in un 3D-microambiente (Sezione 2.2, figura 4), che più precisamente modelli in crescita tumorale in vivo. Inoltre, la nostra protocollo può essere utilizzata per isolare grandi quantità di sferoidi dalla matrice MC per proteine o preparato RNA, permettendo users per valutare segnale cellulare o di espressione genica cambiamenti in risposta a condizioni di trattamento o di crescita.
Il nostro protocollo formazione sferoide richiede l'ottimizzazione di siero e le concentrazioni MC, e il numero di cellule seminate per ciascuna linea cellulare. Caratteristiche Cell Line-specifici, come vitalità cellulare, cellula-cellula e cellula-adesività plastica, possono influenzare significativamente la facilità con cui si formano sferoidi. In generale, le linee cellulari con scarsa vitalità nella cultura monostrato tenuti concentrazioni sieriche più elevate per promuovere la formazione sferoide, mentre le concentrazioni più elevate MC sono stati preferiti per linee cellulari ad alta aderenza. Si consiglia pertanto di titolazioni di siero e MC essere eseguiti per determinare le condizioni ottimali per la sopravvivenza delle cellule (concentrazione sierica), riducendo al minimo monostrato e la formazione sferoidale satellitare (concentrazione MC). Queste condizioni dovrebbero comportare generazione di un singolo sferoide discreta per bene senza satelliti. dimensione ottimale per sferoideanalisi dipende dall'applicazione ed è influenzata dal numero di cellule seminate e concentrazione sierica (Fase 1.4.7). Semina minor numero di cellule produce aggregati più piccoli che sono più facilmente omogeneo macchiato, ma non può riprodurre in vivo cellula-cellula e le interazioni cellula-microambiente. Aumentando il numero di cellule seminate genera sferoidi più grandi, che possono contenere un fisiologicamente rappresentante nucleo ipossica 10 che può influenzare il comportamento delle cellule ed alterare interpretazioni dei saggi di crescita o la sopravvivenza. Tuttavia, quando troppo grande, sferoidi possono essere fragili e sono facilmente spezzato o danneggiato durante l'isolamento. Sferoidi più grandi sono anche molto più difficile da visualizzare, senza piattaforme di imaging specifiche per sezionamento ottico (ad es microscopio a fluorescenza foglio di luce) o incorporando o criosezionamento e la colorazione delle sezioni trasversali attraverso la sferoide 11. Si consiglia una dimensione di destinazione sferoide di 200-500 micron per la flessibilità efacilità di manipolazione per la maggior parte delle applicazioni. Nel complesso, è fondamentale per ottimizzare le condizioni per la formazione sferoide sia modo linea cellulare-specifica e specifica per l'applicazione.
protocolli di produzione sferoide richiedono una particolare attenzione per evitare la contaminazione di sferoidi da polvere e altre particelle. Le cellule aderiscono alla polvere e altri contaminanti insolubili, con conseguente forma irregolare, vagamente cellule aderenti aggregati non utilizzabili nelle analisi (Figura 3A). Fonti di contaminazione possono essere minimizzati passando tutte le soluzioni attraverso un filtro da 0,45 micron, lavando il monostrato cellulare con il mezzo filtrato prima di dissociazione (Step 1.4.1), e risciacquo multicanale serbatoi pipetta con acqua ultrapura filtrata immediatamente prima dell'uso (Step 1.4.6.1). Inoltre, pipette sierologiche cotone-filtrata, che possono gettare le fibre in soluzioni, dovrebbero essere evitati. Anche se non è critica, la polvere può essere ulteriormente ridotto passando dissociatcellule ED attraverso un colino cella di 100 micron prima della semina (Step 1.4.6). Perdita per evaporazione del mezzo è una considerazione tecnica, in particolare per tempi di incubazione superiori a 1 settimana, come quelli richiesti da certe linee cellulari per la formazione sferoide (tabella 1) o durante saggi anoikis (Sezione 6). L'evaporazione può essere minimizzata mediante inseminazione di cellule in pozzi nella regione centrale di piastre multi-pozzetto, riempiendo perimetrale pozzi con acqua ultrapura, e liberamente sigillando i bordi della lastra o racchiudendo la piastra in una camera umidificata.
sferoidi cellulari 3D sono un valido modello per lo studio del comportamento sia delle cellule normali e tumorali e fisiologia. Il nostro protocollo è un metodo rapido ed economico per la generazione di sferoidi cellulari 3D dimensioni costantemente che possono essere utilizzati in un assortimento di saggi e applicazioni. Questi sferoidi rappresentano validi strumenti per la caratterizzazione delle interazioni crescita tumorale e microambiente così come modelli per prla valutazione eClinical di nuove terapie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
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- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
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