Abstract
Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.
Introduction
Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e célula-célula que contribuem para o crescimento de tecido de tumor ou 1, 2, 3.
O uso de esferóides multicelulares é uma abordagem recente que reproduz de forma mais precisa a arquitectura compacta de crescimento celular in vivo em 1,4. Os esferóides podem ser utilizados para investigar interacções célula-matriz de células normais, mas também podem actuar como análogos de tumor para modelar as características de progressão tumoral, tais como o crescimento metastático ou resistência a drogas 4.
Os esferóides podem ser formados pela proliferação de células individuais embebidas numa matriz de 5, ou mais rapidamente, através da promoção da agregação de várias células de modo a formar um conjunto único de células (por exemplo, gota em suspensão, os métodos de centrifugação) 6, 7. técnicas de agregação de células existentes pode exigir materiais caros ou equipamento especializado. Além disso, estes esferóides possuem uma vasta gama de tamanhos e morfologias e pode ser difícil de produzir em grandes quantidades, tornando a comparação entre condições de crescimento ou tratamentos difíceis. Finalmente, esferóides gerados por estes métodos podem ser difíceis de isolar a partir do extracel proteicolular matriz em que se encontram inseridas para utilização em outras aplicações.
Aqui, nós descrevemos um método de agregação celular robusta e facilmente controlável para a rápida formação de esferóides de células dimensionados de forma consistente utilizando placas disponíveis comercialmente de fundo em U de células-repelente e uma matriz de promoção de adesão inerte, celulose de metilo. Uma vez formados, estes esferóides multicelulares são prontamente isolados para utilização numa vasta gama de aplicações. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides através da proliferação de células, o que pode ser utilizado para avaliar outros processos celulares. Aqui, mostramos ensaios de invasão celular, quantificados pela técnica de imunofluorescência, e um ensaio anoikis, como exemplos de aplicações destes dois protocolos de formação esferóide diferentes.
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Protocol
Nota: Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Lista de Materiais.
1. Produção Spheroid por agregação celular
- Solução de metil-celulose: preparar 100 ml de 100 mg / ml de celulose de metilo.
- Calor 50 mL ultrapura H2O a 80 ° C. Adicionar 10 g de pó de metil-celulose e agite até que as partículas são uniformemente dispersos.
- Levar o volume final com ultrapura frio H2O e agita-se a 4 ° C, até a solução se tornar clara, cor de palha, e não contém os sólidos visíveis.
- Filtrar através de um filtro de 0,45 um para remover os sólidos não dissolvidos. solução preparada pode ser dividido em alíquotas e armazenado a 4 ° C durante até 12 meses.
NOTA: Metil celulose serve como um não-citotóxico, agente inerte, suspende para aumentar a adesão célula-célula e desencorajar a formação de uma monocamada de células aderentes. A metilcelulose é solúvel em água e pode ser lavada a seguir sphergeração oid.
- Meio de formação esferóide
NOTA: Prepare meio de formação esferóide imediatamente antes da utilização. Não guarde.- Diluir solução de metilcelulose a 1-5 mg / mL no meio de cultura apropriado.
- Filtrar através de um filtro de 0,22 uM para esterilizar e remover os sólidos não dissolvidos.
- Salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)
- Diluir até 1x e passar através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. solução preparada pode ser armazenada indefinidamente à temperatura ambiente.
- A produção celular esferóide (Figura 1)
NOTA: Prepare todos os reagentes com antecedência. É importante evitar a contaminação de soluções de pó, fibras ou outras partículas insolúveis. A presença destes contaminantes irá afectar de forma adversa a formação de esferóides. O meio de cultura e outras soluções deve ser passado através de um filtro de 0,45 um para remover estas partículas quando possível. Evitar o uso de pipetas filtrada de algodão durante a transferência de soluções como estas podem introduzir fibras adicionais.- As monocamadas de células de cultura para 70% de confluência no meio de cultura apropriado suplementado com soro a 10%. meio de cultura Aspirar e lavar com 1x PBS para remover detritos. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) de tampão de dissociação para um prato de cultura de células de 10 cm, e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Inspecione células sob microscópio em aumento de 10x para confirmar o desapego. Neutralizar tampão de dissociação com 7 ml de meio de cultura suplementado com soro.
- suspensão de células centrifugar a 500 xg durante 10 min para as células suavemente pelotas.
- Remover o sobrenadante. sedimento de células ressuspender em 1 médio formação esferóide mL utilizando uma pipeta P1000 com uma ponta de filtro.
NOTA: A suspensão de células deve ser livre de grumos.- Para triturar pellet celular, pressione a ponta da pipeta contra o fundo do tubo com uma ligeira inclinação, enquantopipetagem ao cisalhamento sedimento celular. Evitar trituração mais de 3 - 5 vezes como este pode danificar as células. Pipeta devagar e não expelir todo o conteúdo da ponta da pipeta para evitar a criação de bolhas.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e diluídas suspensão de células a 1 x 10 4 células / ml.
NOTA: O número de células pode ser otimizado para gerar esferóides de tamanhos variados. Tripano coloração com azul de células danificadas podem ser usadas para confirmar a viabilidade das células ressuspensas. - suspensão de células para uma transferência estéril, pipeta multicanal reservatório livre de poeira e utilizar pontas de filtro para dispensar 100 uL em cada poço de uma placa de 96 poços-célula-repelente de fundo em U.
- Reservatório de lavagem com filtrada ultrapura H2O para remover a poeira e fibras.
- Misture a suspensão de células periodicamente enquanto sementeira para evitar que as células se deposite no fundo do reservatório. Para evitar a criação de bolhas, use uma técnica de pipetagem inversa, enquanto a mistura e Dispensing.
- Transferência de placas para cultura de tecidos incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) e inspeccionar diária para a formação de esferóides. As células devem assentar no fundo de cada cavidade dentro de 6 h e, geralmente, agregar-se em um esferóide dentro de 24-48 h (Figura 2).
- Para confirmação da formação esferóide bem sucedido, use uma ponta de p10 e gentilmente pipeta médio sobre o esferóide, observando sob um microscópio no aumento de 10x. Corretamente esferóides formados vai soltar a partir da placa and roll, confirmando a sua estrutura 3D.
NOTA: metil-celulose e as concentrações séricas deve ser determinada por titulação para cada linha de células para produzir a formação de um único esferóide por poço. Condições optimizadas desta forma para as linhas de células seleccionadas são apresentados na Tabela 1, e exemplos dos esferóides formado na Figura 2B. Os esferóides podem ser cultivadas por mais tempo do que o indicado, mas tornam-se maiores à medida que elas crescem progressivamente mais difícilpara lidar com sem fragmentação. Se as células formam uma monocamada, esferóides de satélite, ou não conseguem depositar-se no fundo do poço, a concentração de celulose de metilo e de soro podem necessitar de ser ajustado para a formação de esferóides óptimo (Figura 3B). Não utilizar esferóides contendo contaminantes, tais como fibras ou de pó (Figura 3A). esferóides pré-formados podem ser tratadas com os compostos de interesse, tais como factores de crescimento, as manchas de células vivas, ou inibidores para análise.
2. Ensaio de Invasão esferoidal (Figura 4)
- colágeno neutralizado
- Arrefecer todos os líquidos a 4 ° C e manter em gelo quando se trabalha com colágeno para evitar a polimerização indesejada.
- Prepare frescos soluções de NaOH e fresco HCl 0,1 M 0,1 M e 0,01 M em ultrapura H 2 O. Passe todas as soluções através de filtros de 0,22 um.
- Misture bovino tipo 1 do colágeno (3,1 mg estoque / mL), NaOH 0,01 M e 10x PBS (8: 1: 1 razão em volume) e se ajustar a pH 7,4 usando NaOH 0,1 M frio e HCl. A concentração final de colagénio é de 2,5 mg / mL.
- Prepare colagénio neutralizado suficiente para encher o vaso de imagem a uma profundidade de 2-3 mm. É necessário um mínimo de 100 uL para cada poço da corrediça câmara de cultura de tecidos de 8 poços listados na Lista de Materiais.
- Incorporação esferóides em colágeno (Figura 4)
- Cubra o fundo de cada poço de uma corrediça câmara de cultura de tecidos de 8 poços com um mínimo de 50 ul de colagénio neutralizado.
- Use técnica de pipetagem inversa para evitar a criação de bolhas no colágeno. Utilize a ponta da pipeta para espalhar o colagénio uniformemente sobre a superfície do poço.
NOTA: Esta camada de base de colágeno vai realizar esferóides em suspensão e é tipicamente 1-2 mm de espessura. A camada de base minimiza a formação de um menisco sobre a camada superior de colagénio. Se a camada base for demasiado fina, esferóides podem fazer contacto com o fundo da câmara e corrediçaformar uma monocamada de células.
- Use técnica de pipetagem inversa para evitar a criação de bolhas no colágeno. Utilize a ponta da pipeta para espalhar o colagénio uniformemente sobre a superfície do poço.
- Colocar a lâmina de câmara, e um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos preenchido com ultrapura H2O, numa placa de 10 cm de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C até que o colagénio é polimerizada, tipicamente 1 h. Loja restantes neutralizado colágeno no gelo.
NOTA: A 35 milímetros prato cheio de água irá fornecer umidade e evitar a secagem. O slide câmara deve permanecer nesta câmara de umidade ao longo do ensaio. A camada de base de colagénio pode ser deixado a polimerizar durante a noite. incubações mais longas tipicamente resultar num gel mais rígida. - Usando uma ponta de filtro P1,000, recolher esferóides pré-formadas (passo 1.4.7) da placa de células-repelente de 96 poços de fundo em U em 1,5 mL tirar os tubos de topo. Pipeta lentamente e evitar repetidas ou pipetagem vigorosa para minimizar fluido de corte de esferóides. Várias esferóides podem ser reunidos num único tubo de transferência para uma cavidade de corrediça a câmara de cultura de tecidos de 8 poços.
- Centrifugar os esferóides recolhidos em um tablETOP microcentrífuga a 2.000 xg por 2-5 s e remover o sobrenadante com uma pipeta p200. Evite centrifugação por mais tempo do que o necessário, pois isso pode fazer com que os esferóides se quebre ou se aglutinarem.
NOTA: Depois de pipetagem a maior parte do sobrenadante, o tubo pode ser invertido cuidadosamente sobre uma toalha de papel limpa para afastar o excesso de líquido. Não permita que esferóides para secar. - Usando uma grande ponta bore p200, delicadamente ressuspender esferóides em 50 ul colágeno neutralizado. Faça isso para cada tubo de esferóides recolhidos antes de qualquer esferóides são transferidos para o slide de câmara. Manter esferóides que foram ressuspensas em colagénio neutralizado em gelo até estar pronto para a transferência para lâminas de câmara.
- Remover slides câmara da incubadora e pipeta com cuidado a mistura esferóide-colágeno no topo da camada de base de colágeno. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 até colagénio é polimerizada.
- Não dispensam o conteúdo total do pipeta para evitar a criação de bolhas. Dropwise pipetagem reduz as chances de perturbar a camada de base de colágeno.
- Adiciona-se lentamente um mínimo de 100 uL aquecida meio de cultura contendo quimioatractores desejados, inibidores, ou outros tratamentos para cada poço da câmara de corrediça. Os contendo esferóides camada de colágeno pode rasgar se o líquido é pipetado para ele com muita força. O meio de cultura pode ser lentamente dispensado para o lado de um poço para evitar a perturbação do colágeno.
- Incubar corrediça câmara a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir a invasão celular. invasão celular para o colagénio circundante pode ser observada por imagiologia de campo claro ou de fluorescência e quantificada por uma variedade de métodos utilizando epifluorescência, microscopia confocal ou folha de luz.
- Cubra o fundo de cada poço de uma corrediça câmara de cultura de tecidos de 8 poços com um mínimo de 50 ul de colagénio neutralizado.
3. Quantificação de Invasion: Brightfield Microscopia
- Em intervalos de tempo definidos, esferóides imagem colágeno embutido no aumento de 10x utilizando um microscópio de campo claro (passo 2.2.8).
NOTA: Paraexperimentos em células vivas, a longo prazo, um estágio do microscópio aquecida e CO 2 câmara regulada pode ser usado para manter esferóides a 37 ° C e CO 2, enquanto imagens de 5%. - Quantificar invasividade utilizando o software ImageJ tal como para medir o número de células invasoras para o colagénio circundante e a distância média invadido em cada ponto de tempo.
4. Quantificação de Invasion: microscopia de fluorescência com mancha de células vivas
- Seguindo o passo 2.2.8, suplementar o meio nas lâminas de câmaras com um corante fluorescente, tal como DAPI, calceína AM, ou outro composto de localização de células apropriado para a linha celular de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Para a quantificação da capacidade de invasão, coloração homogénea em todo o esferóide não é essencial. Para aplicações que requerem uma penetração mais profunda da mancha, incubações longas (> 3 h) podem ser necessárias. - Remover a mancha e substituir com 500 mL quente 1x PBS. DentroCubate a 37 ° C durante 10 min para remover o excesso de corante. Repetir um mínimo de duas vezes.
- Usando um microscópio de fluorescência, através de secções ópticas adquirir os esferóides invasores.
NOTA: A exposição prolongada à luz do laser deve ser minimizada durante a imagem repetitivo para limitar fototoxicidade e fotodegradação. - Usar o software ImageJ tal como para gerar um Z-projecção, que pode ser utilizada para quantificar a área total do esferóide, números de células invasoras, e as distâncias invadido no interior da matriz de colagénio.
- Como um exemplo, para quantificar a invasão, ajustar o limiar de imagem para excluir fundo, destacando apenas o esferóide e invadir as células, e medir a sua área. A área do esferóide original pode ser subtraído a partir deste total para quantificar invasividade.
5. A quantificação da Invasão: Imunofluorescência
Nota: Todas as soluções e tampões devem ser passados através de um filtro de 0,45 um antes da utilização para remove detritos, o que pode afetar negativamente a coloração.
- Prepare tampão de lavagem PBS +. Prepare 1x PBS e adicionar CaCl2 e MgCl2 para uma concentração final de 0,1 mM. Não autoclave buffer depois de CaCl 2 e MgCl 2 são adicionados. Solução e pode ser armazenado à temperatura ambiente esterilizada por filtração.
- Prepare tampão de fixação neutra de formalina tamponada (NBF). Adicionam-se 5 gotas de NaOH 1 M a 0,6 g de paraformaldeído. Traga a 20 mL com PBS + e incuba-se a 60 ° C até paraformaldeído é dissolvido (aproximadamente 1 h). Arrefecer até à temperatura ambiente e ajustar o pH para 7,4 com HCl 1M.
NOTA: tampão de fixação NBF deve ser preparada imediatamente antes da utilização. - Prepare a albumina de soro bovino (BSA) a tampão de bloqueio. Dissolve-se BSA em PBS + 3% w / v. A solução pode ser esterilizada por filtração e armazenada a 4 ° C durante vários dias, mas é melhor preparado fresco. Não aqueça.
- Preparar tampão de permeabilização. Dilui-se Triton X-100a 0,2% v / v em PBS +.
NOTA: tampão permeabilização deve ser preparada imediatamente antes da utilização. - Opcionalmente, preparar MOWIOL meio de montagem. Combinar 2,4 g de MOWIOL, 6 g de glicerol, e 6 mL de H 2 O. ultrapura mistura durante 3 h, num rotor a temperatura ambiente. Adicionar 12 mL de 0,2 M de Tris-Cl (pH 8,5). Incubar, com mistura, a 50 ° C durante 10 min.
- Centrifugar a 5.000 xg durante 15 min para sedimentar o material insolúvel. Adicionar agente anti-branqueamento, tais como 2,5% de DABCO. Loja em 500 mL alíquotas a -20 ° C.
- Coloração por imunofluorescência de esferóides (Figura 5)
NOTA: Use uma pipeta para adicionar lentamente ou remover líquidos de slides câmara. Evitar o uso de um aspirador, pois isso pode perturbar a camada de colágeno.- Prepare esferóides e incorporar em lâminas de câmara cheia de colágeno, conforme descrito nos pontos 1 e 2.
NOTA: O colágeno autofluorescência podem ser minimizados utilizando camadas finas ou pequenos volumes de collagen. - Remova o meio de cultura, tanto quanto possível de cada slide câmara.
- Resumidamente lavar camada de colágeno com 500 mL de tampão de lavagem PBS + para remover o meio residual.
- Adicionar 500 ul de PBS + tampão de lavagem fresco a cada poço e incubar a 37 ° C durante 5 minutos para lavar esferóides. Repita duas vezes.
- Substitua PBS + tampão de lavagem com 500 tampão de fixação mL NBF. Incubar à temperatura ambiente durante 20-25 min.
- Remover o tampão de fixação NBF e lavar com 500 mL de tampão de lavagem PBS +. Lavar durante 5 min com PBS fresco + tampão de lavagem de um mínimo de 3 vezes.
NOTA: Fixa esferóides podem ser armazenadas a 4 ° C em tampão de lavagem PBS + fresco durante vários dias. 0,01% de azida de sódio pode ser adicionado ao tampão de lavagem para inibir o crescimento microbiano durante o armazenamento. - Substitua PBS + tampão de lavagem com 500 tampão de permeabilização mL. Incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Opcionalmente, remover o tampão de bloqueio de ASB. Usando bisturi ou tesouras, esferóides especiais de consumo e os 3 mm Área mm x 3 mm em torno da camada de colagénio. Usando uma grande ponta bore P1000, desalojar o bloco excisadas de colágeno por lavagem suavemente com tampão BSA bloqueio fresco. Transferir bloco colágeno a 1,5 tubo mL.
- Centrifugar a 2000 xg durante 2 minutos e remover o sobrenadante. O tubo pode ser cuidadosamente invertida sobre uma toalha de papel limpa para afastar o excesso de líquido.
- Prepare esferóides e incorporar em lâminas de câmara cheia de colágeno, conforme descrito nos pontos 1 e 2.
- Adicionar anticorpo primário para esferóides e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionar um volume suficiente de anticorpo primário de tal forma que a camada de colagénio está uniformemente toda submersa. Os passos opcionais acima referidas (tipicamente 5.6.8.1-5.6.8.2) permitir a utilização de menores volumes de anticorpo.
- Submergir slides câmara em um recipiente com pelo menos 10 mL PBS + buf lavagemfer durante 10 minutos para lavar. Repetir um mínimo de duas vezes.
- Opcional, se esferóides foram excisados a partir de camada de colagénio anteriormente (Passo 5.6.8.1), adicionar um mínimo de 1 ml de PBS + tampão de lavagem para o tubo de 1,5 ml e agitar suavemente. Deixar na água durante um mínimo de 10 min.
- Remover o máximo + tampão de lavagem de PBS e possível repetir a lavagem com PBS + tampão de lavagem de um mínimo de duas vezes. Centrifugar a 2.000 xg durante vários minutos para sedimentar o colagénio bloco.
NOTA: limpar as superfícies externas da corrediça da câmara de limpeza com etanol 70% antes de mergulhar em tampão de lavagem.
- Repita os passos 5.6.9-5.6.10 utilizando anticorpo secundário apropriado.
NOTA: Se esferóides foram coradas directamente no vaso de imagem, vá para o passo 5.6.13. - Opcional, se esferóides foram excisadas a partir da camada de colágeno anteriormente (Passo 5.6.8.1), lâminas de vidro limpas e lamelas de microscopia confocal compatível com etanol 70%.
- Remover o tampão de lavagem, tanto quanto possível a partir do bloco de colágeno e ressuspender em ultrapura H 2 O. Execute esta etapa imediatamente antes da montagem. Não deixe blocos manchadas imersão em água.
- Utilizando uma pinça fina com ponta, segure borda do bloco de colágeno e transferência para lâmina de vidro.
- Usando a pinça para segurar o colágeno no lugar, use um cotonete de algodão limpo para pavio excesso de líquido do bloco de colágeno, tomando cuidado para não tocar o colágeno diretamente.
NOTA: Se o colágeno torna-se preso a cotonete pode ser gentilmente removidos ou usando uma pinça, ou por submersão em água.
- Utilizando uma técnica de pipetagem inversa, dispensar 100 L MOWIOL meio de montagem para o bloco de colágeno e lugar lamela sobre a amostra.
- Use um cotonete ou toalha de papel para pavio excesso de meio de montagem MOWIOL e água para fora sob a lamela.
- Permitir MOWIOL meio de montagem para endurecer durante a noite a 4 °C. Selo bordas da lamela com unha polonês.
- Imagem esferóides coradas utilizando microscopia confocal de fluorescência ou de observar a localização de proteínas de interesse, a formação de estruturas invasoras, etc (Figuras 5B, 5C).
NOTA: manchado esferóides deve ser protegido da luz para evitar a fotodegradação.
6. anoikis Assay
NOTA: O protocolo formação esferóide é facilmente adaptado para quantificar o crescimento independente de ancoragem e resistência anoikis em uma variedade de tipos de células.
- Sementeira células para ensaio anoikis (Figura 6)
- Siga as instruções para a produção de esferóide na secção 1.4, mas usar um mínimo de 30 mg de metil-celulose / mL para preparar meio de formação esferóide.
NOTA: Quando aquecida, a 30 mg / mL de metil-celulose devem produzir um gel espesso que mantém as células em suspensão. - Incubar as células durante vários dias a semanas e emspect regularmente a 10X de ampliação utilizando um microscópio. As células que resistem a anoikis deverão proliferar e formar colónias.
- Quantificar anoikis através da medição do número e tamanho das colónias formadas em cada poço.
Observação: Uma vez que as colónias são formadas, elas podem ser lavadas para remover a metil celulose e utilizada para ensaios baseados em esferóide, tal como descrito.
- Siga as instruções para a produção de esferóide na secção 1.4, mas usar um mínimo de 30 mg de metil-celulose / mL para preparar meio de formação esferóide.
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Representative Results
Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B). Titulação de MC e as concentrações séricas é requerida para cada linha de células para identificar as condições óptimas em que apenas um único esferóide é formado que seja robusto o suficiente para permitir a manipulação, sem fragmentação. Optimamente, os esferóides tinham entre 200 a 500 um de diâmetro, e consistia de células firmemente aderentes com restos de células mínima. Esferóides sobreviveram manuseamento suave, sem danos, o que lhes permite ser recolhido e utilizado em uma ampla variedade de ensaios.
(Figura 3A), o que resultou em agregados de células mortas. Na presença de poeira ou outros contaminantes de fibra, múltiplos ou grupos de células de formato irregular que foram apenas fracamente agregados formados, e os esferóides resultantes facilmente se separaram quando manuseado. Formação esferóide também foi afetada pelas concentrações sub-óptimas de MC ou soro no meio de formação esferóide (Figura 3B). Nos nossos testes, muitas linhas de células foram capazes de aderir às placas células-repelentes, na ausência, ou em concentrações baixas, da MC, e resultou na formação de um esferóide rodeado por uma monocamada de células (Figura 3B-II). crescimento celular BxPC-3 em condições sub-óptimas MC é mostrado como um exemplo. Em geral, concentrações mais elevadas de células MC impedida de aderir à bem, mas uma concentração demasiado elevada de MC reduzida adesão célula-célula, e as células impedidos dedeposite no fundo do poço, resultando na formação de agregados soltos e numerosos esferóides de satélite (Figura 3B-I). A concentração de soro também afectada a sobrevivência da célula, e célula-célula e adesão célula-plástico e necessário para ser optimizada para diferentes linhas de células. Para as linhas de células, tais como HCT-116 e PANC-1, uma concentração demasiado elevada de soro resultou em proliferação celular excessiva e produção de esferóides de grandes dimensões que foram facilmente danificadas por manuseio, ou promovidos adesão celular ao poço de plástico e a formação de uma monocamada ( A Figura 3B-III). Curiosamente, os efeitos de soro insuficiente diferiram entre linhas celulares. a sobrevivência das células HCT-116 foi reduzida e os esferóides formadas eram pequenos, contendo uma grande proporção de células mortas em baixa soro. Em contraste, as células PANC-1 eram viáveis na ausência de soro, mas tornou-se mais aderentes, e formaram agregados múltiplos, bem como uma monocamada de células (Figura 3B-IV, V).
Uma modificação do protocolo de formação de esferóides descrito, em que as células individuais são suspensas numa concentração mais elevada de MC (30 mg / mL) pode ser utilizado para monitorizar a resistência anoikis. A estas concentrações MC, forma ainda pode ser transferido com uma pipeta, enquanto fresco, mas engrossado num gel sólido a 37 ° C. Anoikis células resistentes ressuspensas neste meio permaneceram em suspensão e proliferaram ao longo de um período de 2-4 semanas, formando esferóides suspensão de tamanhos variados (Figura 6B). As células dependentes de ancoragem, não formar esferóides sob estas condições. Fomos capazes de quantificar anoikis resistência através da contagem do dormenteer de esferóides formada em cada poço.
Figura 1: Visão geral do 3D Spheroid Formação Protocolo. As células cultivadas em cultura em monocamada são dissociados, contadas, sedimentadas e ressuspensas em meio de formação de esferóides suplementado com metilcelulose (MC) e soro (i-iv). A suspensão é semeada numa placa de células-repelente de fundo em U a densidade desejada para permitir a formação de esferóides do tamanho desejado (v), e a placa é incubada para produzir um único esferóide de células discreta em cada poço (VI). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Optimized Spheroid Formação Condições.(A) a formação esferóide em condições ideais para células SH-SY5Y. 1.000 células semeadas em placas de alvéolos repelente de fundo em U, em meio suplementado com soro a 5% e 1 mg / mL de MC agregados em esferóides compactos dentro de 24 h. (B) Imagens representativas de esferóides formadas por várias linhas de células sob condições ideais mostrados na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Formação esferoidal Sob condições menos favoráveis. Os esferóides (A) formado na presença de contaminantes. contaminação microbiana resultou na morte celular e esferóides frouxamente agregadas. Na presença de contaminantes insolúveis, tais como poeiras ou fibras, as células aderiram a estes materiais e não AGGREGcomeu. (B) a formação esferóide em meio de formação esferóide abaixo do ideal. BxPC-3 de células semeadas na presença de MC excesso (10 mg / mL) formado numerosas esferóides satélite (I), enquanto insuficiente MC (0 mg / ml) resultou em agregados de células que aderiram ao cavidades de fundo e formaram uma monocamada (ii ). Foram observados resultados semelhantes para outras linhas de células testadas (não mostrado). O excesso de soro (20%) resultou num aumento da proliferação celular e formação de monocamada de HCT-116 (iii). Insuficiente soro (0%) tinha efeitos específicos de linha de células que vão desde a morte celular em HCT-116 (iv) para a formação de esferóides por satélite em PANC-1 (v). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Invasion ensaio utilizando Spheroids. (A) Overview de ensaio de invasão esferóide. O vaso de formação de imagens é pré-revestido com uma camada de colagénio neutralizado e incubada para polimerizar o colagénio (I-II). esferóides pré-formados são recolhidos em tubos de 1,5 ml e ressuspenso em colagénio neutralizado (III-VI). A mistura esferóide-colágeno é sobreposto na base da camada de colágeno e incubadas para polimerizar o colagénio (vii-viii). O meio de crescimento contendo compostos desejados é então revestida sobre a camada de esferóides por colagénio polimerizado e incubada para permitir a invasão de células (IX-X). (B) na presença de um quimioatractor, as células são mostrados invadindo na matriz de colagénio em torno de um incorporado PANC-1 esferóide nos pontos de tempo indicados. Cada painel mostra uma imagem de contraste de fase obtidas utilizando uma objetiva de 10X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coloração por imunofluorescência de esferóides colagénio-incorporados. (A) Visão de protocolo para imunofluorescência de esferóides. esferóides embutidos são lavadas, fixadas (NBF), e bloqueados (BSA) directamente no vaso de imagiologia. Os esferóides podem ser marcadas directamente, ou cortado e corado num volume mais pequeno, tal como um tubo de 1,5 mL. Esferóides deverá ser lavado com tampão de excesso após cada mancha para minimizar a fluorescência de fundo. esferóides manchadas podem ser visualizados diretamente no vaso ou montado sob uma lamela para geração de imagens e armazenamento. Imagens (B) de imunofluorescência de um esferóide de células TPC-1 incorporados em colagénio e deixou-se invadir durante 24 h. (C) Imagens mostrando células phalloidin manchado típico de regiões indicadas no B. Cada painel mostra um 20 um Z-projeção (0,2 mm passos) adquiridos utilizando um objetivo 60X: Células dentro do esferóide bOdy cerca de 20 um a partir da superfície (1), salientes em células de colagénio (2), e células invasoras através de colagénio (3). Barras de escala = 25 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Formação esferoidal anoikis Ensaio. (A) Visão de protocolo para o ensaio anoikis. As células são preparadas como descrito na Figura 1, mas são ressuspensas em meio de formação de esferóides contendo um mínimo de 30 mg / ml de CM, que forma uma camada de espessura para manter as células individuais em suspensão e prevenir a agregação das células (I-II). A suspensão de células é semeada em placas de alvéolos repelente de fundo em U e foram incubadas (iii-iv). As células em suspensão pode ser monitorizada quanto à formação de esferóides por proliferação, indicando resistência anoikis. (
| Linha celular | MC (mg / ml) | Serum (%) | incubação aproximado Tempo |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 horas |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 a 5 dias |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 a 7 dias |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 a 4 dias |
| TT | 1 | 10 | 7 a 10 dias |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 a 2 dias |
Tabela 1: Optimal Formação Spheroid composição do meio e incubação Times por Linhas de célula validada.
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Discussion
Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC 8, 9 para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes animais, MC é inerte, não contém factores de crescimento, e é facilmente removido por lavagem, permitindo o isolamento de esferóides para utilização numa variedade de aplicações, sem a presença de matriz residual. Nosso protocolo utiliza uma rápida agregação de números de células consistentes para gerar esferóides tamanho homogéneo, permitindo comparações directas dos esferóides cultivadas sob diversas condições experimentais. Este método pode ser adaptado para culturas mistas de modelar o crescimento do tumor in vivo, em combinação por um número fixo de vários tipos de células associados ao tumor (por exemplo, f ibroblastos, leucócitos, células estromais) para representar mais exactamente a ambiente tumoral.
Modificações das nossas células protocolo utilizando semeadas em concentrações elevadas de MC pode ser feita para monitorar o crescimento independente de ancoragem de células capazes de proliferar em suspensão, e pode ser empregue como um ensaio anoikis (Secção 6) para identificar ou quantificar a transformação celular. Esferóides gerados pelo nosso protocolo são ideais para aplicações tais como o rastreio de fármacos, permitindo a comparação do crescimento celular, metabolismo, a sobrevivência, a invasividade e entre as condições de tratamento. Isolado esferóides também pode ser incorporado em uma matriz extracelular, tais como o colagénio, para avaliar e quantificar a invasividade de células em um 3D-microambiente (Secção 2.2, Figura 4) que mais precisamente em modelos de crescimento de tumor in vivo. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para isolar grandes quantidades de esferóides a partir da matriz de MC para a proteína ou preparação de ARN, permitindo users para avaliar de sinal celular ou expressão gênica mudanças em resposta ao tratamento ou de crescimento condições.
Nosso protocolo de formação de esferóides requer optimização de soro e concentrações MC, e o número de células semeadas para cada linha celular. características específicas de linha de células, tais como a viabilidade celular, célula-célula e célula-adesividade de plástico, pode afectar significativamente a facilidade com que os esferóides são formados. Em geral, as linhas celulares com falta de viabilidade em cultura de monocamada necessárias concentrações mais elevadas de soro para promover a formação de esferóides, enquanto que as concentrações mais elevadas foram MC preferido para linhas celulares altamente adesivas. Portanto, recomendamos que as titulações de soro e MC ser realizados para determinar as condições ideais para a sobrevivência das células (concentração sérica), minimizando monocamada e formação esferóide por satélite (concentração MC). Estas condições devem resultar na geração de um único esferóide discreta por poço sem satélites. tamanho ideal para esferóideanálise é dependente da aplicação e é afectada pelo número de células semeadas e concentração de soro (Passo 1.4.7). Semeando menos células produz agregados menores que são mais facilmente homogeneamente coradas, mas podem não reproduzir em célula-célula vivo e interações celulares-microambiente. O aumento do número de células semeadas gera esferóides maiores, que podem conter um núcleo hipóxico fisiologicamente representante 10 que podem afectar o comportamento das células e alterar interpretações de ensaios de crescimento ou de sobrevivência. No entanto, quando muito grande, os esferóides podem ser frágeis e são facilmente quebrada ou danificada durante o isolamento. Esferóides maiores também são muito mais difíceis de visualizar sem plataformas de imagem especializadas para corte óptico (por exemplo folha de microscópio de fluorescência de luz) ou por incorporação ou cryosectioning e coloração das secções transversais através do esferóide 11. Recomendamos um tamanho de destino esferóide de 200-500 mm para flexibilidade efacilidade de manuseio para a maioria das aplicações. Em geral, é crítica para optimizar as condições para a formação de esferóides de forma específica tanto da linha de células e específicos de aplicação.
protocolos de produção esferóides requerem uma atenção especial para evitar a contaminação de esferóides por poeira e outras partículas. As células aderem a poeira e outros contaminantes insolúveis, resultando em uma forma irregular, vagamente agregados de células aderentes inadequados para utilização em análises (Figura 3A). As fontes de contaminação pode ser minimizado fazendo passar todas as soluções através de um filtro de 0,45 um, enxaguar a monocamada de células com meio de filtrado antes de dissociação (passo 1.4.1), e enxaguar reservatórios pipeta multicanal com água ultrapura filtrada imediatamente antes da utilização (Passo 1.4.6.1). Além disso, pipetas serológicas filtrou-algodão, que podem lançar fibras em soluções, devem ser evitados. Apesar de não ser crítica, a poeira pode ser ainda mais reduzida, passando dissociated células através de um coador de células de 100 um antes da sementeira (Passo 1.4.6). Perda por evaporação do meio é uma consideração técnica adicional, especialmente para tempos de incubação superiores a uma semana, tais como os exigidos por determinadas linhas celulares para a formação de esferóides (Tabela 1) ou durante ensaios anoikis (Secção 6). A evaporação pode ser minimizado por células de sementeira em poços na região do centro de placas de poços múltiplos, enchendo perímetro poços com água ultrapura, e frouxamente selagem dos bordos da chapa ou colocando a placa em uma câmara humidificada.
esferóides de células 3D são um modelo válido para o estudo de ambos o comportamento celular normal e de tumor e fisiologia. Nosso protocolo é um método rápido e económico para a produção de esferóides de células 3D tamanho consistente que podem ser usados em uma variedade de ensaios e aplicações. Estes esferóides representam ferramentas valiosas para a caracterização de interações crescimento do tumor e do microambiente, bem como modelos para pravaliação eClinical de novas terapias.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
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- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
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