Abstract
Monolag cellekultur ikke tilstrekkelig modellere in vivo-oppførsel av vev, som involverer komplekse celle-celle og celle-matriks-interaksjoner. Tre-dimensjonale (3D) cellekulturteknikker er en ny oppfinnelse er utviklet for å løse manglene ved tilhenger cellekultur. Mens flere teknikker for å generere analoger vev in vitro er blitt utviklet, er disse metodene er ofte kompliserte, kostbare å etablere, krever spesialisert utstyr, og er generelt begrenset av kompatibilitet med bare visse celletyper. Her beskriver vi en rask og fleksibel protokoll for aggregering av celler inn i flercellede 3D sfæroider med ensartet størrelse som er kompatibel med vekst av en rekke tumor og normale cellelinjer. Vi bruker varierende konsentrasjoner av serum og metylcellulose (MC) for å fremme forankrings-uavhengig sfæroide generasjon og hindre dannelsen av cellemonolagene i en meget reproduserbar måte. Optimale forhold for individual cellelinjer kan oppnås ved å justere MC eller serumkonsentrasjoner i den sfæroide formasjonen medium. 3D-kuler som genereres kan samles for bruk i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert cellesignalisering eller genuttrykkstudier, legemiddelkandidat screening, eller i studiet av cellulære prosesser som tumorcelleinvasjon og migrering. Protokollen er også lett tilpasset for å generere klonale kuler fra enkeltceller, og kan være innrettet til å vurdere forankrings-uavhengig vekst og anoikis-motstand. Samlet gir vår protokoll et enkelt modifiser fremgangsmåte for å generere og bruke 3D-celleklumper for å rekapitulere 3D-mikromiljøet av vev og modellere in vivo vekst av normale og tumorceller.
Introduction
Biologisk relevant vurdering av tumorcelle oppførsel er utfordrende å bruke tradisjonelle to-dimensjonale (2D) cellekulturmetoder, blant annet fordi disse ikke gjenspeiler den cellemikro funnet in vivo. Alternative fremgangsmåter som omfatter ekstracellulære matrikskomponenter inn i kulturen (f.eks Boyden kammer analyser) er mer fysiologisk representative for in vivo vev miljø. De kan imidlertid være begrenset til vurdering av individuell celle oppførsel, og ikke rekapitulere komplekset in vivo kombinasjoner av celle-matrise- og celle-celle-interaksjoner som bidrar til vev eller tumorvekst 1, 2, 3.
Bruken av flercellede sfæroider er en ny tilnærming som mer nøyaktig gjengir den kompakte arkitekturen av in vivo-cellevekst 1,4. Sfæroidene kan brukes til å undersøke celle-matriks-interaksjoner av normale celler, men kan også fungere som tumor-analoger, for å modellere egenskapene til tumorprogresjon, slik som metastatisk vekst eller medikamentresistens 4.
Sfæroider kan dannes ved spredning av enkeltceller innleiret i en matrise 5, eller raskere, ved å fremme aggregeringen av flere celler til å danne en enkelt celle område (for eksempel hengende dråpe, sentrifugeringsmetoder) 6, 7. Eksisterende celle aggregering teknikker kan kreve kostbare materialer eller spesialisert utstyr. I tillegg har disse kuler har et bredt spekter av størrelser og morfologi, og kan være vanskelig å fremstille i store mengder, noe som gjør sammenligninger mellom vekstbetingelser eller behandlinger vanskelig. Endelig kan sfæroidene som genereres av disse metodene være vanskelig å isolere fra det proteinholdige extracellular matriks hvori de er innleiret for bruk i andre anvendelser.
Her beskriver vi en robust og lett modifiserbar celle aggregering metode for rask dannelse av konsekvent dimensjonerte celleklumper ved hjelp av kommersielt tilgjengelige U-bunn celle-avstøtende plater og et inert klebeformidler matrise, metylcellulose. Straks de var dannet, er disse flercellede sfæroider isoleres lett for bruk i en lang rekke applikasjoner. Protokollen er også lett tilpasses for å generere kuler gjennom celleproliferasjon, som kan brukes til å vurdere andre celleprosesser. Her viser vi celle invasjon analyser, kvantifisert ved immunofluorescens-farging, og en anoikis assay, som beskrevet i Eksempel anvendelser av disse to forskjellige sfæroide formasjons protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle reagenser og forbruksvarer er oppført i Materials List.
1. spheroid Produksjon av Cell Aggregation
- Metylcelluloseløsning: Fremstill 100 ml 100 mg / ml metylcellulose.
- Varme 50 ml ultrarent H2O til 80 ° C. Tilsett 10 g metylcellulose pulver og agitere til partiklene er jevnt dispergert.
- Bring til sluttvolum med kald ultrarent H2O og omrørt ved 4 ° C inntil løsningen blir klar, stråfarget, og inneholder ingen synlige faststoffer.
- Passere gjennom et 0,45 um filter for å fjerne uoppløste faststoffer. Klare løsning kan alikvotert og lagret ved 4 ° C i opp til 12 måneder.
MERK: Metyl-cellulose tjener som et ikke-cytotoksisk, inert, suspenderingsmiddel for å forbedre celle-celle adhesjon og hindre dannelsen av en tilhenger celle monolag. Metylcellulose er vannløselige og kan vaskes bort etter spherOID generasjon.
- Spheroid formasjon medium
MERK: Forbered spheroid formasjon medium umiddelbart før bruk. Ikke lagre.- Fortynn metylcellulose løsning til 1-5 mg / ml i passende kulturmediet.
- Passerer gjennom en 0,22 mikrometer filter for å sterilisere og fjerne uoppløste faste stoffer.
- Dulbeccos fosfatbufret saltvann (PBS)
- Spe til 1x og passerer gjennom en 0,45 mikrometer filter før bruk. Klare oppløsning kan oppbevares i ubegrenset tid ved værelsetemperatur.
- Cell spheroid produksjon (figur 1)
MERK: Klargjør alle reagenser på forhånd. Det er viktig å unngå forurensing av løsninger av støv, fibre eller andre uoppløselige partikler. Tilstedeværelsen av slike forurensninger vil ha negativ innvirkning sfæroide formasjonen. Kulturmediet og andre løsninger skal føres gjennom et 0,45 um filter for å fjerne disse partiklene når poslig. Unngå bruk av bomull-filtrert pipetter ved overføring løsninger som disse kan innføre ytterligere fibre.- Kultur cellemonolagene til 70% konfluens i passende dyrkingsmedium supplert med 10% serum. Aspirer kulturmedium og skyll med 1 x PBS for å fjerne rusk. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin) dissosiasjon buffer til en 10 cm cellekulturskål, og inkubere cellene ved 37 ° C og 5% CO2.
- Inspiser cellene under mikroskop på 10X forstørrelse for å bekrefte avløsning. Nøytraliser dissosiasjon buffer med 7 ml av serum-supplert kulturmedium.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 xg i 10 min til forsiktig pellet celler.
- Fjern supernatant. Resuspender cellepelleten i 1 ml spheroid dannelsen medium med en P1000 pipette med et filter tips.
MERK: Cellesuspensjonen bør være fri for klumper.- Å triturer celle pellet, trykker pipettespissen mot bunnen av røret med en liten vinkel, menspipettering å klippe celle pellet. Unngå triturating mer enn 3 - 5 ganger, da dette kan skade cellene. Pipetter sakte og ikke utvise hele innholdet i pipetten tips for å unngå å skape bobler.
- Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og fortynnet cellesuspensjon til 1 x 10 4 celler / ml.
MERK: celleantallet kan optimeres for å generere kuler av varierende størrelser. Trypan blå farging av skadede celler kan bli anvendt for å bekrefte levedyktighet av resuspenderte celler. - Overføring cellesuspensjonen til en steril, støvfritt multikanal pipette reservoaret og bruke filterspisser for å dispensere 100 ul i hver brønn av en 96-brønn U-bunn celle avvisende plate.
- Skyll reservoar med filtrert ultra H 2 O for å fjerne støv og fibre.
- Bland cellesuspensjonen med jevne mellomrom mens såing for å hindre at celler feste seg til bunnen av reservoaret. For å unngå å skape bobler, bruke en omvendt pipetteringsteknikk mens miksing og dispensing.
- Overføre platene til vevskultur-inkubator (37 ° C og 5% CO2) og inspisere daglig for sfæroide formasjonen. Celler som skulle sette seg på bunnen av hver brønn i løpet av 6 timer og vanligvis samlet inn i en sfæroide innen 24-48 timer (figur 2).
- For bekreftelse på vellykket spheroid formasjonen, bruke en p10 tips og forsiktig pipette medium over spheroid mens observere under et mikroskop på 10X forstørrelse. Riktig dannet kuler vil løsne fra platen og rull, bekrefter deres 3D-struktur.
MERK: metylcellulose og serumkonsentrasjoner bør bestemmes ved titrering for hver cellelinje for å gi dannelsen av en enkelt sfæroide per brønn. Betingelser optimalisert på denne måten i valgte cellelinjene er vist i tabell 1, og eksempler på kulene dannet i figur 2B. Sfæroider kan dyrkes for lengre tid enn angitt, men etter hvert som de blir større de blir stadig vanskeligereå håndtere uten fragmentering. Dersom cellene danner et monolag, satellitt sfæroider, eller mislykkes i å sette seg på bunnen av brønnen, kan konsentrasjonen av metylcellulose og serum trenger å bli ytterligere justert for optimal sfæroide dannelse (figur 3B). Ikke bruk kuler som inneholder miljøgifter som fiber eller støv (figur 3A). Pre-dannede kuler kan behandles med forbindelser av interesse, slik som vekstfaktorer, levende celle flekker, eller inhibitorer for analyse.
2. spheroid Invasion analysen (figur 4)
- nøytralisert kollagen
- Avkjøl alle væsker til 4 ° C og hold på is når du arbeider med kollagen for å hindre uønsket polymerisasjon.
- Klargjør ferske 0,1 M og 0,01 M oppløsninger av NaOH og frisk 0,1 M HCl i ultra H 2 O. Pass alle løsninger gjennom 0,22 mikrometer filter.
- Bland bovin type 1 kollagen (3,1 mg / ml lager), 0,01 M NaOH og 10x PBS (8: 1: 1 volumforhold) og juster til pH 7,4 ved hjelp av kald 0,1 M NaOH og HCl. Den endelige konsentrasjonen av kollagen er 2,5 mg / ml.
- Fremstille nok nøytralisert kollagen til å fylle avbildning fartøyet til en dybde på 2-3 mm. Et minimum på 100 ul er nødvendig for hver brønn av den 8-brønners vevskultur kammeret lysbilde som er oppført i materialliste.
- Embedding kuler i kollagen (figur 4)
- Belegge bunnen av hver brønn av en 8-brønners vevskultur kammer lysbilde med et minimum av 50 ul nøytralisert kollagen.
- Bruk omvendt pipetteringsteknikk å unngå å skape bobler i kollagen. Bruk pipettespissen å spre kollagen jevnt over brønnoverflaten.
MERK: Dette kollagen underlag vil holde kulene i suspensjon og er vanligvis 1-2 mm tykk. Basislaget minimerer dannelsen av en menisk på det øvre kollagensjikt. Dersom basislaget er for tynt, kan sfæroidene komme i kontakt med bunnen av kammeret og glidedanner en celle monolag.
- Bruk omvendt pipetteringsteknikk å unngå å skape bobler i kollagen. Bruk pipettespissen å spre kollagen jevnt over brønnoverflaten.
- Plasser kammeret lysbildet, og en 35 mm vev kultur tallerken fylt med ultra H 2 O, i en 10 cm vev kultur parabolen. Inkuber ved 37 ° C inntil kollagen er polymerisert, typisk 1 time. Oppbevar rester nøytralisert kollagen på is.
MERK: vannfylte 35 mm fatet vil gi fuktighet og hindre uttørking. Kammeret lysbilde bør forbli i denne fuktighetskammeret i løpet av analysen. Kollagen Basislaget kan etterlates for å polymerisere over natten. Lengre inkubasjoner resulterer typisk i et mer rigid gel. - Ved hjelp av en filtertupp p1,000, samle pre-dannede kuler (trinn 1.4.7) fra 96-brønners U-bunn celle-avstøtende plate i 1,5 ml feste topp rør. Pipetter langsomt og unngå gjentatt eller kraftig pipettering for å redusere væske klipping av kuler. Flere kuler kan bli slått sammen i et enkelt rør for overføring til en brønn av den 8-brønners vevskultur kammeret lysbilde.
- Sentrifuger samles kulene i en tabletop mikrosentrifuge ved 2000 xg i 2-5 s og fjerne supernatanten ved hjelp av en P200 pipette. Unngå sentrifugering lenger enn nødvendig, da dette kan føre til at kulene gå i stykker eller klumpe seg sammen.
MERK: Etter pipettering av mesteparten av supernatanten, røret kan vendes forsiktig over et rent papirhåndkle for å transportere bort overflødig væske. Ikke la kulene til tørk. - Ved hjelp av en bred boring P200 tips, forsiktig resuspender kulene i 50 mL nøytralisert kollagen. Gjør dette for hvert rør av innsamlede kuler før noen kuler blir overført inn i kammeret lysbildet. Hold kuler som har blitt resuspendert i nøytralisert kollagen på is inntil de er klare for overføring til kammer lysbilder.
- Fjern kammer lysbilde fra inkubatoren og nøye pipette spheroid-kollagen blandingen på toppen av kollagen underlag. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 inntil kollagen er polymerisert.
- Ikke dispensere hele innholdet i pipetten å unngå å skape bobler. Dropwise pipettering reduserer sjansene for å forstyrre kollagen underlaget.
- Tilsett langsomt et minimum av 100 ul varmet kulturmedium inneholdende de ønskede kjemotiltrekkende midler, inhibitorer, eller andre behandlinger til hver brønn av kammeret lysbildet. De kollagen lag som inneholder kuler kan rive dersom væske pipettert på det for kraftig. Kultur medium kan sakte dispenseres ned på siden av en brønn for å unngå å forstyrre kollagen.
- Inkuber kammeret lysbilde ved 37 ° C og 5% CO2 for å tillate celle invasjon. Celle invasjon inn i den omgivende kollagen kan observeres ved lysfelt eller fluorescens avbildning og kvantifiseres ved en rekke fremgangsmåter ved hjelp av epifluorescens, konfokal eller lys ark mikroskopi.
- Belegge bunnen av hver brønn av en 8-brønners vevskultur kammer lysbilde med et minimum av 50 ul nøytralisert kollagen.
3. Kvantifisering av Invasion: Lysfelt Mikroskopi
- Til faste tidsintervaller, bilde kollagen-embedded kuler på 10X forstørrelse ved hjelp av et lysfelt mikroskop (trinn 2.2.8).
MERK: Forlangsiktige live celleforsøk, et oppvarmet mikroskop scene og CO 2 regulert kammer kan brukes til å opprettholde kuler ved 37 ° C og 5% CO 2, mens bildebehandling. - Kvantifisere invasivitet ved hjelp av programvare, for eksempel ImageJ for å måle antall celler invaderer inn i det omkringliggende kollagen og den gjennomsnittlige avstanden invaderte ved hvert tidspunkt.
4. Kvantifisering av Invasion: Fluorescensmikroskopi med levende celle Stain
- Etter trinn 2.2.8, supplere medium i kammeret lysbilder med en fluoriserende flekk som DAPI, Calcein AM, eller andre celle-sporing sammensatte hensiktsmessig for cellelinje i henhold til produsentens anvisninger.
MERK: For kvantifisering av invasivitet, er ikke avgjørende homogen flekker over hele spheroid. For anvendelser som krever dypere penetrasjon av flekken, lengre inkubasjoner (> 3 h) kan være nødvendig. - Fjern flekken og erstatte med 500 mL varm 1x PBS. Icubate ved 37 ° C i 10 min for å fjerne overskudd av flekken. Gjenta minst to ganger.
- Ved hjelp av en fluorescens mikroskop, erverve optiske seksjoner gjennom de invaderende kulene.
MERK: Langvarig eksponering for laserlys bør minimaliseres ved seriebilde å begrense fototoksisitet og fotobleking. - Bruke programvare som ImageJ å generere en Z-fremspring, som kan brukes til å kvantifisere det totale areal av den sfæroide, antall av invaderende celler, og avstander invadert inn i kollagenmatriksen.
- Som et eksempel, for å kvantifisere invasjon, justere bildet terskelen for å utelukke bakgrunn, fremhever bare spheroid og invadere cellene, og måle sitt område. Arealet av den opprinnelige spheroid kan trekkes fra det totale å kvantifisere invasivitet.
5. Kvantifisering av Invasion: immunfluorescens
NOTE: Alle oppløsninger og buffere skal føres gjennom et 0,45 um filter før bruk til Remove rusk, som kan negativt påvirke farging.
- Forbered PBS + vaskebuffer. Forbered 1 x PBS og tilsett CaCl2 og MgCl2 til en endelig konsentrasjon på 0,1 mM. Ikke autoklaver buffer etter CaCl 2 og MgCl2 er lagt til. Løsningen kan være filtersterilisert og lagret ved romtemperatur.
- Forbered nøytral bufret formalin (NBF) fiksering buffer. 5 dråper av 1 M NaOH til 0,6 g paraformaldehyd. Bring til 20 ml med PBS + og inkuber ved 60 ° C inntil paraformaldehyd oppløst (ca. 1 time). Avkjøl til romtemperatur og juster pH til 7,4 med 1 M HCl.
MERK: NBF fiksering buffer bør tilberedes umiddelbart før bruk. - Forbered bovint serumalbumin (BSA) blokkeringsbuffer. Oppløs BSA i PBS + 3% vekt / volum. Oppløsningen kan bli filtersterilisert og lagret ved 4 ° C i flere dager, men som ikke er forberedt frisk. Ikke varm.
- Forbered permeabiliseringsbuffer. Fortynnet Triton X-1000,2% volum / volum i PBS +.
MERK: permeabiliseringsbuffer skal tilberedes umiddelbart før bruk. - Eventuelt forberede Mowiol monteringsmedium. Kombiner 2,4 g Mowiol, 6 g glycerol og 6 ml ultrarent H2O Bland i 3 timer i en rotator ved romtemperatur. Tilsett 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Inkuber med blanding ved 50 ° C i 10 min.
- Sentrifuger ved 5000 xg i 15 minutter for å pelletere uoppløselig materiale. Legg anti-blekemiddel, så som 2,5% DABCO. Oppbevares i 500 mL alikvoter ved -20 ° C.
- Immunfluorescens farging av kulene (figur 5)
MERK: Bruk en pipette til å sakte legge til eller fjerne væske fra kammer lysbilde. Unngå bruk av en vifte, da dette kan forstyrre kollagen laget.- Forbered kuler og bygge inn i kollagen fylte kammer lysbilder, som beskrevet i kapittel 1 til 2.
MERK: Kollagen autofluorescens kan reduseres ved å bruke tynne lag eller små volumer av collagen. - Fjern så mye dyrkingsmedium som mulig fra hvert kammer lysbilde.
- Kort renset kollagensjikt med 500 ul PBS + vaskebuffer for å fjerne gjenværende medium.
- Legg 500 mL fersk PBS + vaskebuffer til hver brønn og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter for å vaske kulene. Gjenta to ganger.
- Bytt PBS + vaskebuffer med 500 mL NBF fiksering buffer. Inkuber ved romtemperatur i 20 - 25 min.
- Fjern NBF fiksering buffer og skyll med 500 mL PBS + vaskebuffer. Vask i 5 minutter med fersk PBS + vaskebuffer minst 3 ganger.
MERK: Fast kuler kan lagres ved 4 ° C i frisk PBS + vaskebuffer i flere dager. 0,01% natriumazid kan tilsettes til vaskebufferen for å hemme mikrobiell vekst under lagring. - Bytt PBS + vaskebuffer med 500 mL permeabiliseringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur i 10-15 min.
- Eventuelt fjerne BSA blokkeringsbuffer. Ved hjelp av skalpell eller saks, avgifts sfæroider og den omgivende 3 mm x 3 mm område fra kollagensjikt. Ved hjelp av en bred boring P1000 spissen, løsne skåret blokk av kollagen ved å skylle forsiktig med frisk BSA blokkering buffer. Overfør kollagen blokk til 1,5 ml rør.
- Sentrifuger ved 2000 x g i 2 minutter og fjerne supernatanten. Røret kan være nøye invertert over ren papirhåndkle for å transportere bort overflødig væske.
- Forbered kuler og bygge inn i kollagen fylte kammer lysbilder, som beskrevet i kapittel 1 til 2.
- Legg primært antistoff til kulene og inkuber ved værelsestemperatur i 1 time. Tilsett tilstrekkelig volum av primært antistoff slik at hele kollagen laget er jevnt under vann. De valgfrie trinnene ovenfor (5.6.8.1-5.6.8.2) vanligvis tillate bruk av mindre mengder antistoff.
- Senk kammer lysbilde i en beholder med minst 10 ml PBS + vask buffer i 10 min for å vaske. Gjenta minst to ganger.
- Valgfritt, hvis kulene ble fjernet fra kollagen laget tidligere (trinn 5.6.8.1), legge til minimum 1 ml PBS + vaskebuffer til 1,5 ml rør og forsiktig agitere. La det virke i minst 10 min.
- Fjerne så mye PBS + vaskebuffer som mulig, og gjenta vasking med PBS + vaskebuffer minst to ganger. Sentrifuger ved 2000 xg i flere minutter for å pelletere kollagen blokken.
MERK: Rengjør utvendige flater av kammeret lysbildet ved å tørke med 70% etanol før nedsenke i vaskebuffer.
- Gjenta trinn 5.6.9-5.6.10 bruker passende sekundært antistoff.
MERK: Hvis kulene ble farget direkte i bilde fartøyet, fortsett til trinn 5.6.13. - Valgfritt, hvis kulene ble fjernet fra kollagen laget tidligere (trinn 5.6.8.1), rene glassplater og Konfokalmikroskopi-kompatibel Dekk med 70% etanol.
- Fjern så mye vaskebuffer som mulig fra kollagen blokk og resuspender i ultra H 2 O. Utfør dette trinnet umiddelbart før montering. Ikke la farget blokker soaking i vann.
- Bruke fin tippet tang, gripe kanten av kollagen blokk og overføring til glass lysbilde.
- Ved hjelp av pinsett til å holde kollagen på plass, bruk en ren bomullspinne for å transportere overflødig væske fra kollagen blokken, og pass på at du ikke berører kollagen direkte.
MERK: Hvis kollagen blir sittende fast i bomullspinne det kan lett fjernes enten ved hjelp av pinsett, eller ved å senke i vann.
- Bruke omvendt pipetteringsteknikk fordeles 100 mL Mowiol montering medium på kollagen blokken og sted dekkglass over prøven.
- Bruk en bomullsdott eller papirhåndkle å transportere overflødig Mowiol monteringsmedium og vann ut fra under dekkglass.
- Tillat Mowiol monteringsmedium for å herde over natten ved 4 °C. Seal kantene dekkglass med neglelakk.
- Bilde farget kuler ved hjelp confocal eller fluorescens mikroskopi å observere lokalisering av proteiner av interesse, dannelsen av invasive strukturer, etc. (Tall 5B, 5C).
MERK: Farget kuler bør beskyttes mot lys for å hindre fotobleking.
6. Anoikis analyse
MERK: sfæroide formasjon protokollen er lett tilpasses for å kvantifisere forankrings-uavhengig vekst og anoikis motstand i en rekke forskjellige celletyper.
- Såing celler for anoikis analysen (figur 6)
- Følg instruksjonene for spheroid produksjon i kapittel 1.4, men bruker et minimum av 30 mg / ml methyl cellulose for å forberede spheroid formasjon medium.
MERK: Når varmet, bør 30 mg / ml methyl cellulose produsere en tykk gel som holder celler i suspensjon. - Inkuber cellene i flere dager til uker, og iSPECT regelmessig på 10X forstørrelse ved hjelp av et mikroskop. Celler som motstår anoikis skal spre seg og danne kolonier.
- Kvantifisere anoikis ved å måle antallet og størrelsen av kolonier som dannes i hver brønn.
Merk: Når koloniene er dannet, kan de vaskes for å fjerne metylcellulose og anvendt for sfæroide baserte analyser, som beskrevet.
- Følg instruksjonene for spheroid produksjon i kapittel 1.4, men bruker et minimum av 30 mg / ml methyl cellulose for å forberede spheroid formasjon medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en fleksibel og effektiv metode for å generere diskrete kuler ved bruk av celle tette plater og sfæroide formasjons media supplert med MC. Under passende betingelser med hensyn MC og serum, individuelle celler seg og holder seg sammen i midten av brønnen for å danne kuler med minimal tilslutning til brønnbunnen. Ved hjelp av denne protokollen, ble sfæroider generert fra en rekke forskjellige cellelinjer (figur 2B). Titrering av MC og serumkonsentrasjon er nødvendig for hver cellelinje for å identifisere optimale forhold hvor bare en enkelt celleklump blir dannet som er robust nok til å tillate håndtering uten å fragmentere. Optimalt sfæroidene var mellom 200 og 500 pm i diameter, og består av tett heftende celler med minimal celleavfall. Sfæroidene levde skånsom håndtering uten å skades, slik at de kan samles og brukes i en rekke forskjellige analyser.
(figur 3a), noe som resulterte i aggregater av døde celler. I nærvær av støv eller annen forurensning fiber, flere eller uregelmessig formede cellegruppene som var bare svakt aggregert dannet, og de resulterende kuler lett gikk i stykker når det håndteres. Spheroid formasjonen ble også påvirket av suboptimale konsentrasjoner av MC eller serum i spheroid formasjonen medium (figur 3B). Testing viser mange cellelinjer var i stand til å følge celle tette plater i fravær, eller ved lave konsentrasjoner, av MC, og resulterte i dannelse av en sfæroide omgitt av en celle-monolag (figur 3B-ii). BxPC-tre cellevekst i suboptimale MC forholdene er vist som et eksempel. Generelt vil høyere konsentrasjoner av MC hindret celler fra å feste seg til brønnen, men en for høy konsentrasjon av MC redusert celle-celle-adhesjon, og hindret fra cellenesettling til bunnen av brønnen, noe som resulterer i dannelsen av løse aggregater og et mangfold av satelitt kulene (figur 3B-i). Konsentrasjonen av serum også påvirket celleoverlevelse, og celle-celle og celle-adhesjon plast og trengte å bli optimalisert for forskjellige cellelinjer. For cellelinjer så som HCT-116 og PANC-1, en for høy serumkonsentrasjon resulterte i overdreven celleproliferasjon og produksjonen av overdimensjonerte kuler som ble lett skades ved håndtering, eller fremmet celle adhesjon til plast brønnen og dannelse av et monolag ( Figur 3B-iii). Interessant, effekten av utilstrekkelig serum varierte mellom cellelinjer. HCT-116-celle overlevelse ble redusert og kulene dannet var små, inneholdende en stor andel av døde celler i lavt serum. I motsetning til dette, PANC-1-celler var levedyktige i fravær av serum, men ble mer vedheftende og er dannet av flere aggregater, samt en celle monolag (figur 3B-iv, v).
En modifikasjon av den beskrevne sfæroide formasjonen protokollen, hvor individuelle celler blir suspendert i høyere konsentrasjon MC (30 mg / ml) kan brukes til å overvåke anoikis motstand. Ved disse MC konsentrasjoner kan medium fortsatt bli overført med pipette mens kul, men tyknet til en fast gel ved 37 ° C. Anoikis-resistente celler resuspendert i dette mediet forble i suspensjon og proliferert i løpet av en periode på 2-4 uker, danner suspenderte kuler av varierende størrelser (figur 6B). Forankringsavhengige celler som ikke danner kuler under disse betingelser. Vi var i stand til å kvantifisere anoikis-motstand ved å telle nummeneh av sfæroider som dannes i hver brønn.
Figur 1: Oversikt over 3D spheroid Formation protokollen. Celler dyrket i monolagskultur blir dissosiert, telles, pelletert og resuspendert i sfæroide formasjon medium supplert med metylcellulose (MC) og serum (i-iv). Suspensjonen blir sådd ut i en U-bunn celle-avstøtende plate på ønsket densitet for å tillate dannelse av kuler med ønsket størrelse (v), og platen inkuberes for å frembringe et enkelt, diskret celle sfæroide i hver brønn (vi). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Optimalisert spheroid Formasjon betingelser.(A) sfæroide formasjon under optimale betingelser for SH-SY5Y celler. 1.000 celler podet i U-bunn celle-avstøtende plater i medier supplert med 5% serum og 1 mg / mL MC samles i kompakte kuler i løpet av 24 timer. (B) Representative bilder av kuler som er dannet av ulike cellelinjer under optimale forhold er vist i Tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: spheroid formasjon under suboptimale betingelser. (A) Spheroids dannes i nærvær av forurensninger. Mikrobiell forurensning resulterte i celledød og løst aggregerte kuler. I nærvær av uløselige forurensninger, såsom støv eller fibre, celler som klebet til disse materialene og ikke aggregspiste. (B) spheroid formasjonen i suboptimal spheroid formasjon medium. BxPC-3-celler utsådd i nærvær av overskudd av MC (10 mg / ml) som er dannet et mangfold av satelitt kuler (i), mens utilstrekkelig MC (0 mg / ml) resulterte i celleaggregater som festet til bunnen av brønnen og dannet et monolag (ii ). Lignende resultater ble observert for andre testede cellelinjer (ikke vist). Overskytende serum (20%) resulterte i øket HCT-116 celle-proliferasjon og monolaget dannelse (iii). Utilstrekkelig serum (0%) hadde cellelinjespesifikke effekter som strekker seg fra celledød i HCT-116 (iv) til dannelse av satellitt sfæroider i PANC-1 (volum). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Invasion Assay Bruke Spheroids. (A) Overview av spheroid invasjon analysen. Den bilde Fartøyet er forhåndsbelagt med et lag av kollagen og nøytralisert inkubert for å polymerisere kollagen (i-ii). Pre-dannede kuler er samlet i 1,5 ml rør og resuspendert i nøytralisert kollagen (iii-vi). Den sfæroide-kollagen blanding blir lagt oppå kollagenbaselaget og inkubert for å polymerisere kollagen (VII-VIII). Vekstmedium inneholdende ønskede forbindelser blir deretter lagt over det polymeriserte sfæroide-kollagensjikt og inkubert for å tillate celle invasjon (ix-x). (B) I nærvær av en kjemoattraktant blir cellene vist invaderer inn i den omgivende kollagen matriksen fra en innebygd PANC-1 sfæroide ved de indikerte tidspunkter. Hvert panel viser en fasekontrast bilde ervervet ved hjelp av en 10X objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Immunofluorescensanalyse Farging av kollagen-innebygde Spheroids. (A) Oversikt over protokoll for immunfluorescens farging av kuler. Embedded kuler er vasket, fikset (NBF), og blokkert (BSA) direkte i bilde fartøyet. Sfæroidene kan farges direkte, eller skåret ut og farget i et mindre volum, for eksempel et 1,5 ml rør. Kuler bør vaskes med overskudd av buffer etter hvert flekken for å minimalisere bakgrunnsfluorescens. Stained kuler kan avbildes direkte i fartøyet eller montert under et dekkglass for bildebehandling og lagring. (B) immunfluorescens bilder av en TPC-1 celle sfæroid innleiret i kollagen og lov til å invadere i 24 timer. (C) Bilder som viser phalloidin farget celler typisk for regionene som er angitt i B. Hvert panel viser en 20 mikrometer Z-projeksjon (0,2 mikrometer trinn) ervervet ved hjelp av en 60X objektiv: Celler i spheroid body ca. 20 pm fra overflaten (1), celler som strekker seg inn kollagen (2), og celler invaderer gjennom kollagen (3). Skala barer = 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: spheroid Formation Anoikis analysen. (A) Oversikt over protokoll for anoikis analysen. Celler blir fremstilt som beskrevet i figur 1, men resuspenderes i sfæroide formasjon medium inneholdende et minimum på 30 mg / ml MC som danner et tykt lag for å holde individuelle celler i suspensjon, og forhindre aggregering celle (i-ii). Cellesuspensjonen blir sådd ut i U-bunn celle-avstøtende plater og inkubert (III-IV). De suspenderte celler kan overvåkes med hensyn til sfæroide dannelse ved spredning, hvilket indikerer anoikis motstand. (
| celle~~POS=TRUNC | MC (mg / ml) | Serum (%) | omtrentlig inkubasjon tid |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 timer |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 til 5 dager |
| PANC-en | 5 | 5 | 5 til 7 dager |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 til 4 dager |
| TT | 1 | 10 | 7 til 10 dager |
| TPC-en | 3 | 5 | 1 til 2 dager |
Tabell 1: Optimal spheroid Dannelse Medium Sammensetning og Inkubasjon Times for Validerte cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en rask og fleksibel metode for fremstilling av 3D-celle-kuler for å modellere den arkitekturen av in vivo vev ved bruk av rimelige og lett tilgjengelige reagenser. Vår protokoll utnytter ikke-cytotoksiske og heft fremmende egenskaper MC 8, 9 for å megle celle aggregering og minimere cellemonolayer formasjonen. I motsetning til proteinbaserte matrikser isolert fra animalske kilder, er MC inert, ikke inneholder noen vekstfaktorer, og kan lett fjernes ved vasking, slik at isolering av sfæroider for bruk i en rekke anvendelser uten tilstedeværelse av resterende matrise. Vår protokollen bruker rask aggregering av ensartede celle tall å generere homogent store kuler, slik at direkte sammenligninger av kuler dyrket under ulike eksperimentelle forhold. Denne fremgangsmåten kan tilpasses for blandede kulturer for å modellere in vivo tumorvekst ved å kombinere faste antall av flere tumor-assosierte celletyper (f.eks fibroblaster, leukocytter, stromale celler) for mer nøyaktig å representere den tumormiljøet.
Modifikasjoner av våre protokoll ved hjelp av celler utsådd i høye konsentrasjoner av MC kan bringes til å overvåke forankrings-uavhengig vekst av celler i stand til å formere seg i suspensjon, og kan anvendes som et anoikis assay (Section 6) for å identifisere eller kvantifisere celletransformasjon. Spheroids generert av vår protokoll er ideelle for applikasjoner som narkotika screening, slik at sammenligning av cellevekst, metabolisme, overlevelse, og invasivitet mellom behandlingsforhold. Isolerte sfæroider kan også være innebygd i en ekstracellulær matriks, så som kollagen, for å vurdere og kvantifisere celle invasivitet i et 3D-mikromiljøet (avsnitt 2.2, figur 4) som mer nøyaktig modeller in vivo-tumorvekst. Videre kan vår protokoll anvendes for å isolere store mengder av kuler fra MC matrise for protein eller RNA-preparat, slik at uSers å vurdere celle signal eller genuttrykk endringer i respons til behandling eller vekstvilkår.
Vår sfæroid formasjon protokollen krever optimalisering av serum og MC-konsentrasjoner, og antall celler sådd for hver cellelinje. Cellelinje-spesifikke egenskaper, som for eksempel celle levedyktighet, celle-celle og celle-plast klebrighet, kan påvirke hvor enkelt kuler dannes. Generelt er cellelinjer med dårlig levedyktighet i monolagskultur kreves høyere serumkonsentrasjoner for å fremme celleklump formasjon, mens høyere konsentrasjoner MC ble foretrukket for sterkt klebende cellelinjer. Vi anbefaler derfor at titreringer av serum og MC utføres for å bestemme de optimale forhold for celleoverlevelse (serumkonsentrasjon), mens mono og satellitt spheroid dannelse (MC konsentrasjon) minimeres. Disse betingelsene bør resultere i genereringen av en enkelt diskret sfæroide per brønn uten satellitter. Optimal spheroid størrelse foranalyse er avhengig av programmet og påvirkes av det antall celler podet og serumkonsentrasjon (trinn 1.4.7). Seeding færre celler produserer mindre aggregater som er lettere homogent farget, men kan ikke reprodusere in vivo celle-celle og celle-mikromiljøet interaksjoner. Ved å øke antall celler sådd genererer større sfæroider, som kan inneholde et fysiologisk representant hypoksisk kjerne 10 som kan påvirke celle-adferd og endre tolkninger av vekst eller overlevelse analyser. Men når for stor, kan kulene være skjør og blir lett ødelagt hverandre eller skadet under isolasjon. Større kuler er også mye vanskeligere å visualisere uten spesialiserte bilde plattformer for optisk snitting (f.eks lys ark fluorescerende mikroskop) eller ved å bygge eller cryosectioning og farging av tverrsnitt gjennom spheroid 11. Vi anbefaler et mål spheroid størrelse på 200-500 nm for fleksibilitet oglette å håndtere for de fleste bruksområder. Alt i alt er det viktig å optimalisere betingelsene for sfæroid dannelse i både en cellelinje-spesifikk og applikasjonsspesifikk måte.
Sfæroide produksjonsprotokoller krever spesiell oppmerksomhet for å unngå forurensning av sfæroider av støv og andre partikler. Celler holde støv og andre uoppløselige forurensninger, som resulterer i uregelmessig formet, løst vedheftende celleaggregater uegnet for anvendelse i analyser (figur 3A). Forurensningskilder kan minimeres ved å føre alle løsninger gjennom et 0,45 um filter, skylling den cellemonolaget med filtrerte medium før dissosiasjon (trinn 1.4.1), og skylling multikanalspipette reservoarer med filtrert ultrarent vann umiddelbart før bruk (Trinn 1.4.6.1). Videre, bomull-filtrert serologiske pipetter, som kan kaste fibrene i oppløsninger, bør unngås. Selv om det ikke er kritisk, kan støv reduseres ytterligere ved å føre dissociated celler gjennom en 100 mikrometer celle sil før såing (trinn 1.4.6). Fordampningstap av medium er en ytterligere teknisk vurdering, særlig for inkubasjonstider på over en uke, slik som de som kreves ved visse cellelinjer for sfæroide dannelse (tabell 1) eller under anoikis assays (punkt 6). Fordampning kan minimeres ved såing av celler i brønner i senterområdet av multi-brønnplater, fylle omkretsen brønner med ultrarent vann, og løst forsegle kantene av platen eller omslutter platen i et fuktet kammer.
3D-celleklumper er en verdifull modell for studiet av både normale og tumorcelle-adferd og fysiologi. Vår protokoll er en rask og økonomisk metode for generering av gjennomgående størrelse 3D-celleklumper som kan anvendes i et utvalg av analyser og applikasjoner. Disse kulene representerer verdifulle verktøy for karakterisering av tumorvekst og mikromiljøet interaksjoner samt modeller for preclinical evaluering av nye behandlingsformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
