Abstract
Monolayer - Zellkultur - Modell nicht ausreichend das in vivo Verhalten von Geweben, die Wechselwirkungen komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix beinhaltet. Dreidimensionale (3D) Zellkulturtechniken sind eine neue Innovation entwickelt, um die Mängel der adhärenten Zellkultur zu adressieren. Während verschiedene Techniken zur Gewebe Analoga in vitro Erzeugung entwickelt wurden , sind diese Verfahren häufig komplex, teuer herzustellen, erfordern spezielle Ausrüstung und durch Kompatibilität mit nur bestimmte Zelltypen beschränkt. Hier beschreiben wir eine schnelle und flexible Protokoll für Zellen in vielzelligen 3D Sphäroide konsistenter Größe aggregieren, die mit Wachstum einer Vielfalt von Tumor- und normalen Zelllinien kompatibel ist. Wir verwenden verschiedene Konzentrationen von Serum und Methylcellulose (MC) verankerungsunabhängigen Sphäroid Erzeugung und verhindern die Bildung von Zell-Monoschichten in einer hoch reproduzierbaren Weise zu fördern. Optimale Bedingungen für indivIdual Zelllinien kann durch Einstellen MC oder Serumkonzentrationen in der Sphäroidbildung Medium erreicht werden. Die 3D-Sphäroiden erzeugt wird, kann für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gesammelt werden, einschließlich Zellsignalisierung oder Genexpressionsstudien, Kandidat Wirkstoff-Screening oder bei der Untersuchung von zellulären Prozessen wie Tumorzellinvasion und Migration. Das Protokoll wird auch klonale Sphäroide aus einzelnen Zellen zu erzeugen, ohne weiteres angepasst und angepasst werden kann, verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit zu bewerten. Insgesamt bietet unser Protokoll eine leicht modifizierbare Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von 3D - Zell Sphäroide, um die 3D - Mikroumgebung von Geweben und modellieren das in vivo Wachstum von normalen und Tumorzellen zu rekapitulieren.
Introduction
Biologisch relevante Beurteilung der Tumorzellverhalten ist eine Herausforderung mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturmethoden, zum Teil , weil diese nicht in angemessener Weise die Zelle Mikroumgebung in vivo gefunden reflektieren. Alternative Ansätze enthält extrazellulären Matrixkomponenten in die Kultur (zB Boyden - Kammer - Assays) sind physiologisch repräsentativ für die in vivo Gewebeumgebung. Jedoch können sie für die Beurteilung der einzelnen Zellverhaltens begrenzt, und nicht den Komplex in vivo Kombinationen von Zell-Matrix- und Zell-Zell - Wechselwirkungen rekapitulieren, die Gewebe- oder Tumorwachstum 1, 2, 3 tragen.
Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroiden ist ein neuer Ansatz, der genauer die kompakte Architektur von in vivo Zellwachstum 1 wiedergibt ,4. Sphäroide können verwendet werden , Zell-Matrix - Wechselwirkungen von normalen Zellen zu untersuchen, sondern kann auch als Tumor - Analoga wirken Charakteristika der Tumorprogression, wie metastatische Wachstum oder drug resistance 4 zu modellieren.
Sphäroide können in einer Matrix 5 oder schneller eingebettet durch Vermehrung von Einzelzellen gebildet werden, durch die Aggregation von mehreren Zellen fördern 7 eine Einzelzellcluster (zB hängenden Tropfen, Zentrifugationsverfahren) 6, zu bilden. Bestehende Zellaggregation Techniken können teure Materialien oder spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus haben diese Sphäroide eine Vielzahl von Größen und Morphologien und schwierig sein kann, in großen Mengen, so dass Vergleiche zwischen den Wachstumsbedingungen oder Behandlungen schwer herzustellen. Schließlich wird durch diese Verfahren erzeugten Sphäroide kann schwierig sein, von dem proteinischen extracel zu isolierenin anderen Anwendungen zellulären Matrix, in der sie für den Einsatz eingebettet.
Hier beschreiben wir eine robuste und einfach modifizierbar Zellaggregation Methode für die schnelle Bildung von einheitlich bemessen Zelle Sphäroide mit handelsüblichen U-bottom zellabweisenden Platten und ein inertes haftungsvermittelnden Matrix, Methylcellulose. Einmal gebildet, werden diese mehrzellige Sphäroide für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gut isoliert. Das Protokoll ist auch leicht zu erzeugen Sphäroide durch Zellproliferation geeignet, die verwendet werden können, andere Zellprozesse zu beurteilen. Hier zeigen wir Zellinvasionsassays, durch Immunfluoreszenzfärbung quantifiziert, und ein anoikis Assay, wie beispielsweise Anwendungen dieser zwei unterschiedlichen Sphäroidbildung Protokolle.
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Protocol
HINWEIS: Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialliste aufgeführt.
1. Sphäroid-Produktion von Zellaggregation
- Methylcellulose - Lösung: Herstellung von 100 ml einer 100 mg / ml Methylcellulose.
- Wärme 50 ml ultrareines H 2 O bis 80 ° C. In 10 g Methylcellulosepulver und rühren, bis alle Partikel gleichmäßig verteilt sind.
- Bringen Sie auf das Endvolumen mit kaltem Reinst - H 2 O und rühren bei 4 ° C , bis die Lösung klar wird, strohfarben, und enthält keine sichtbaren Feststoffe.
- Fahren Sie durch einen 0,45 um Filter, um ungelöste Feststoffe zu entfernen. Hergestellte Lösung kann für bis zu 12 Monate bei 4 ° C aliquotiert und gelagert werden.
HINWEIS: Methylcellulose dient als nicht-zytotoxisch, inert, Suspendiermittel Zell-Zell-Adhäsion zu verbessern und die Bildung einer anhaftenden Zellschicht verhindern. Methylcellulose ist wasserlöslich und kann entfernt spher folgende gewaschen werdenoid Generation.
- Sphäroidformation Medium
HINWEIS: Bereiten Sphäroidbildung Medium unmittelbar vor der Verwendung. Nicht lagern.- Verdünnte Methylcellulose-Lösung auf 1-5 mg / mL in dem geeigneten Kulturmedium.
- Fahren Sie durch einen 0,22 um Filter zu sterilisieren und nicht gelöste Feststoffe zu entfernen.
- Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
- Verdünnt und durch ein 0,45-um-Filter vor dem Gebrauch passieren auf 1x. Vorbereitete Lösung kann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Zell - Sphäroiden Produktion (Abbildung 1)
HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien im Voraus. Es ist wichtig, eine Kontamination der Lösungen durch Staub, Fasern oder andere unlösliche Partikel zu vermeiden. Das Vorhandensein dieser Verunreinigungen werden nachteilig Sphäroidbildung beeinflussen. Kulturmedium und andere Lösungen sollten durch einen 0,45 um Filter geleitet werden, um diese Partikel zu entfernen, wenn poswortlich. Vermeiden Sie die Verwendung von Baumwolle gefilterten Pipetten bei der Übertragung von Lösungen, da diese zusätzlichen Fasern einführen können.- Kulturzellmonolayern auf 70% Konfluenz in dem geeigneten Kulturmedium, das mit 10% Serum ergänzt. Aspirat Kulturmedium und Spülen mit 1x PBS Schmutz zu entfernen. 3 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin) Dissoziationspuffer zu einer 10 cm Zellkulturschale und inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Untersuchen Zellen unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung Ablösung zu bestätigen. Neutralisieren Dissoziationspuffer mit 7 ml Serum-ergänztem Kulturmedium.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 xg für 10 min sanft Pellet-Zellen.
- Überstand entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml Sphäroidformation Medium eine p1000 Pipette mit einer Filterspitze mit.
HINWEIS: Die Zellsuspension sollte frei von Klumpen sein.- Verreiben Zellpellet, drücken Sie die Pipettenspitze an der Unterseite des Rohres in einem leichten Winkel, währendPipettieren zu scheren Zellpellet. Vermeiden Verreiben mehr als 3 bis 5 mal, da dies die Zellen beschädigen können. Pipette langsam und sie vertreiben nicht gesamten Inhalt der Pipettenspitze Blasen verursachen zu vermeiden.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnte Zellsuspension auf 1 x 10 4 Zellen / mL.
HINWEIS: Die Zellzahl optimiert werden kann Sphäroiden unterschiedlicher Größe zu erzeugen. Trypan-Blau-Färbung von beschädigten Zellen kann verwendet werden, die Lebensfähigkeit von resuspendierten Zellen zu bestätigen. - Transfer Zellsuspension in einen sterilen, staubfreien Mehrkanalpipette Reservoir und verwenden Filterspitzen 100 & mgr; l in jede Vertiefung einer 96-Well-U-Boden zellabweisenden Platte verzichtet werden kann.
- Rinse Behälter mit gefiltertem Reinst - H 2 O Staub und Fasern zu entfernen.
- Mischen der Zellsuspension periodisch während Animpfen Zellen zu verhindern, um den Boden des Behälters absetzen. Um zu vermeiden, Blasen erstellen, verwenden Sie eine Reverse Pipettiertechnik beim Mischen und dispensinG.
- Übertragungsplatten zu Gewebekultur - Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) und untersuchen täglich für Sphäroidbildung. Die Zellen sollten innerhalb von 6 h auf den Boden jeder Vertiefung absetzen und aggregieren im Allgemeinen in ein Sphäroid innerhalb von 24-48 Stunden (Abbildung 2).
- Zur Bestätigung der erfolgreichen Sphäroidformation, verwenden Sie eine p10 Spitze und sanft Medium über die Sphäroid pipettieren, während sie unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung beobachtet. Richtig wird gebildet Sphäroiden von der Platte und Rolle lösen, ihre 3D-Struktur zu bestätigen.
HINWEIS: Methylcellulose und Serumkonzentrationen sollten durch Titration bestimmt werden, für jede Zelllinie pro Vertiefung Bildung eines einzigen Sphäroid zu ergeben. Bedingungen auf diese Weise optimiert für die ausgewählten Zellinien sind in der Tabelle 1, und Beispiele für die Sphäroide in 2B gezeigt gebildet. Sphäroiden kann länger gehalten werden als angegeben, aber wie sie größer werden, wachsen sie immer schwierigerohne Fragmentierung zu behandeln. Wenn Zellen eine Monoschicht bilden, Satelliten - Sphäroiden oder nicht an den Boden des Bohrlochs zu regeln, muss die Konzentration von Methylcellulose und Serum kann weiter für eine optimale Sphäroidbildung (3B) angepasst werden. Verwenden keine Sphäroide Verunreinigungen wie Fasern oder Staub (3A) enthält. Vorgeformte Sphäroiden können mit Verbindungen von Interesse, wie Wachstumsfaktoren, lebenden Zellen Flecken oder Inhibitoren für die Analyse behandelt werden.
2. Spheroid Invasion Assay (Figur 4)
- neutralisiert Kollagen
- Cool Alle Flüssigkeiten bis 4 ° C und halten Sie auf dem Eis, wenn sie mit Kollagen arbeiten unerwünschte Polymerisation zu verhindern.
- Bereiten Sie frisch 0,1 M und 0,01 M Lösungen von NaOH und frisch 0,1 M HCl in Reinst - H 2 O - Pass alle Lösungen durch 0,22 & mgr; m - Filter.
- Mischen Sie Rinder-Typ-1-Kollagen (3,1 mg / ml Stamm), 0,01 M NaOH und 10x PBS (8: 1: 1-Verhältnis von Volumen) und auf pH 7,4 mit kaltem 0,1 M NaOH und HCl einzustellen. Die Endkonzentration an Kollagen beträgt 2,5 mg / mL.
- Bereiten genug neutralisiert Kollagen des Abbildungsgefäß bis zu einer Tiefe von 2-3 mm zu füllen. Ein Minimum von 100 & mgr; l wird für jede Vertiefung der 8-Well-Gewebekulturkammer Schieber in der Materialliste aufgeführt erforderlich.
- Einbetten von Sphäroiden in Kollagen (Figur 4)
- Mantel der Boden jedes Wells eines 8-Well-Gewebekulturkammerobjektträger mit einem Minimum von 50 & mgr; l neutralisiert Kollagen.
- Verwenden Reverse Pipettiertechnik zu vermeiden Blasen im Kollagen zu schaffen. Verwenden Sie die Pipettenspitze das Kollagen gleichmäßig über die Erdoberfläche zu verbreiten.
HINWEIS: Diese Kollagen-Basisschicht wird Sphäroiden in der Schwebe zu halten und ist in der Regel 1-2 mm dick. Die Basisschicht minimiert die Bildung eines Meniskus auf der oberen Kollagenschicht. Wenn die Basisschicht zu dünn ist, Sphäroiden Kontakt mit dem Boden der Kammer Rutsche machen kann undbilden eine Zellmonoschicht.
- Verwenden Reverse Pipettiertechnik zu vermeiden Blasen im Kollagen zu schaffen. Verwenden Sie die Pipettenspitze das Kollagen gleichmäßig über die Erdoberfläche zu verbreiten.
- Legen Sie die Kammer Rutsche und eine 35 - mm - Gewebekulturschale gefüllt mit Reinstwasser H 2 O, in einer 10 cm Gewebekulturschale. bei 37 ° C inkubieren, bis das Kollagen polymerisiert wird, in der Regel 1 h. Shop verbleibende Kollagen auf Eis neutralisiert.
HINWEIS: Das mit Wasser gefüllte 35-mm-Schale wird Feuchtigkeit liefern und Austrocknen zu verhindern. Die Kammer Schieber sollte während des Tests in dieser Feuchtigkeitskammer bleiben. Die Kollagenbasisschicht kann über Nacht zu polymerisieren gelassen werden. Längere Inkubationen führen typischerweise zu einem steiferen Gel. - Mit Hilfe eines p1,000 Filterspitze, sammeln vorgeformten Sphäroiden (Schritt 1.4.7) aus der 96-Well-U-Boden zellabweisenden Platte in 1,5 ml Röhrchen mit Snap. Pipette langsam und vermeiden Sie wiederholt oder heftiges Pipettieren Fluid-Scherung von Sphäroiden zu minimieren. Mehrere Sphäroide können in einem einzigen Rohr für die Übertragung auf eine Vertiefung des 8-Well-Gewebekulturkammer slide gepoolt werden.
- Zentrifugieren Sie die gesammelten Sphäroiden in einer tabletop Mikro bei 2.000 × g für 2-5 s und entfernen Überstand eine p200 Pipette. Vermeiden Zentrifugation länger als erforderlich, da dies die Sphäroide verursachen auseinander oder zusammenklumpen zu brechen.
HINWEIS: Nach den meisten der Überstand Abpipettieren kann das Rohr vorsichtig über einem sauberen Papiertuch invertiert werden, um überschüssige Flüssigkeit abzusaugen. Nicht in Sphäroiden zu trocknen. - Mit einer breiten Bohrung p200 Spitze, sanft resuspendieren Sphäroiden in 50 & mgr; l neutralisiert Kollagen. Tun Sie dies für jedes Röhrchen der gesammelten Sphäroiden, bevor Sphäroiden in die Kammer Träger übertragen werden. Halten Sie Sphäroiden, die für die Übertragung an die Kammer gleitet in neutralisierten Kollagen auf Eis, bis sie bereit suspendiert wurden.
- Entfernen Kammer Folie aus Inkubator und Pipette vorsichtig die Sphäroid-Kollagen-Mischung auf der Kollagen-Basisschicht. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum Kollagen polymerisiert wird.
- Sie verzichten nicht gesamte Inhalt der Pipette zu schaffen Blasen zu vermeiden. Dropwise Pipettieren reduziert die Chancen, die Kollagen-Basisschicht zu stören.
- Langsam ein Minimum von 100 & mgr; l Kulturmedium erwärmt gewünschte chemische Lockstoffe, Inhibitoren enthalten, oder andere Behandlungen zu jeder Vertiefung der Kammer Rutsche. Die Kollagenschicht, die Sphäroiden reißen kann, wenn Flüssigkeit zu stark auf sie pipettieren. Kulturmedium langsam auf die Seite eines gut verzichtet gelegt werden kann Störung des Kollagens zu vermeiden.
- Inkubieren Kammerobjektträger bei 37 ° C und 5% CO 2 Zellinvasion zu ermöglichen. Zellinvasion in die umgebende Kollagen kann durch Hellfeld- oder Fluoreszenzbildgebung und quantifiziert durch eine Vielzahl von Verfahren unter Verwendung von Epifluoreszenz, konfokaler oder Lichtbogen-Mikroskopie beobachtet werden.
- Mantel der Boden jedes Wells eines 8-Well-Gewebekulturkammerobjektträger mit einem Minimum von 50 & mgr; l neutralisiert Kollagen.
3. Quantifizierung der Invasion: Hellfeldmikroskopie
- Zu bestimmten Zeitintervallen Bild Kollagen eingebetteten Sphäroiden mit 10facher Vergrößerung ein Hellfeldmikroskop mit (Schritt 2.2.8).
HINWEIS:längerfristige Lebendzellexperimenten, ein beheizbarer Mikroskoptisch und CO 2 reguliert Kammer kann verwendet werden , Sphäroide zu halten , bei 37 ° C und 5% CO 2 während Bildgebung. - Quantifizierung der Invasivität mit Software wie ImageJ die Anzahl der Zellen zu messen eindringenden in das umgebende Kollagen und den durchschnittlichen Abstand zu jedem Zeitpunkt eindrangen.
4. Quantifizierung der Invasion: Fluoreszenzmikroskopie mit Live Cell Stain
- Nach dem Schritt 2.2.8 ergänzen das Medium in der Kammer gleitet mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie DAPI, Calcein AM, oder anderen zell Tracking Verbindung entsprechend der Zelllinie gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Für die Quantifizierung der Invasivität, homogene Färbung im gesamten Sphäroid nicht wesentlich ist. Für Anwendungen, die ein tieferes Eindringen von Flecken, längere Inkubationszeiten (> 3 h) erforderlich sein. - Entfernen Sie den Fleck und ersetzen mit 500 & mgr; l warmem 1x PBS. Imcubate bei 37 ° C für 10 min überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Wiederholen mindestens zweimal.
- Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops, erwerben optische Schnitte durch die eindringenden Sphäroiden.
HINWEIS: Bei längerer Exposition gegenüber Laserlicht sollte während wiederholter Bildgebung minimiert werden Phototoxizität und Photobleaching zu begrenzen. - Verwenden Software wie ImageJ eine Z-Projektion zu erzeugen, die verwendet werden können, die Gesamtfläche des Sphäroids, der Anzahl der eindringenden Zellen zu quantifizieren, und Entfernungen in die Kollagenmatrix eingedrungen.
- Als Beispiel Invasion zu quantifizieren, stellen Sie die Bild Schwelle Hintergrund auszuschließen, Hervorhebung nur die Sphäroid und eindringenden Zellen und ihre Umgebung zu messen. Die Fläche des ursprünglichen Sphäroid kann von dieser Summe abgezogen werden Invasions zu quantifizieren.
5. Quantifizierung der Invasion: Immunofluoreszenz
HINWEIS: Alle Lösungen und Puffer sollten durch einen 0,45 um Filter geleitet werden vor der Verwendung zu Remove Trümmer, die sich negativ auf Färbung beeinflussen können.
- Bereiten PBS + Waschpuffer. Bereiten 1x PBS und fügen CaCl 2 und MgCl 2 zu einer Endkonzentration von 0,1 mM. Autoklaven nicht Puffer nach CaCl 2 und MgCl 2 zugesetzt werden. Lösung kann bei Raumtemperatur sterilfiltriert und gespeichert werden.
- Bereiten Sie neutral gepuffertem Formalin (NBF) Fixierungspuffer. 5 Tropfen 1 M NaOH auf 0,6 g Paraformaldehyd. Bringen Sie zu 20 ml mit PBS + und Inkubation bei 60 ° C bis Paraformaldehyd gelöst ist (ca. 1 h). Abkühlen auf Raumtemperatur und pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl.
HINWEIS: NBF Fixierung Puffer unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden sollen. - Bereiten Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungspuffer. Auflösen BSA in PBS + 3% w / v. Lösungsfilter kann für mehrere Tage bei 4 ° C sterilisiert und gelagert, sondern wird am besten frisch zubereitet. Nicht erhitzen.
- Bereiten Sie Permeabilisierungs Puffer. Verdünnte Triton X-100bis 0,2% v / v in PBS +.
HINWEIS: Die Permeabilisierung Puffer unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden sollen. - MOWIOL Eindeckmediums Optional vorzubereiten. Kombinieren 2,4 g MOWIOL, 6 g Glycerol und 6 ml ultrareines H 2 O - Mischung für 3 h in einem Rotator bei Raumtemperatur. Hinzufügen 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Inkubieren mit 10 min bei 50 ° C gemischt wird .
- Zentrifuge bei 5.000 xg für 15 min unlösliche Material zu pelletieren. Hinzufügen Antibleichmittel, wie beispielsweise 2,5% DABCO. Store in 500 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C.
- Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden (Figur 5)
HINWEIS: eine Pipette können Sie langsam Flüssigkeiten aus der Kammer Folie hinzuzufügen oder zu entfernen. Vermeiden die Verwendung einer Saugvorrichtung, wie dies die Kollagenschicht unterbrechen können.- Bereiten Sie Sphäroiden und einbetten in Kollagen gefüllte Kammer gleitet, wie in den Abschnitten 1 bis 2 beschrieben.
HINWEIS: Collagen Autofluoreszenz kann durch die Verwendung dünner Schichten oder kleine Mengen von c minimiert werdenollagen. - Entfernen Sie so viel Kulturmedium wie möglich von jeder Kammer Rutsche.
- Spülen Sie kurz Kollagenschicht mit 500 & mgr; l PBS + Waschpuffer Restmedium zu entfernen.
- In 500 ul frischem PBS + Waschpuffer in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 5 min Sphäroiden zu waschen. Zweimal wiederholen.
- Ersetzen PBS + Waschpuffer mit 500 & mgr; l NBF Fixierung Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 bis 25 min.
- Entfernen Sie NBF Fixierung Puffer und spülen mit 500 & mgr; l PBS + Waschpuffer. Waschen Sie für 5 min mit frischer PBS + Wasch mindestens 3 mal puffern.
HINWEIS: Fest Sphäroiden kann bei 4 ° C in frischem PBS + Waschpuffer für mehrere Tage aufbewahrt werden. 0,01% Natriumazid zu dem Waschpuffer zugesetzt werden, um mikrobielles Wachstum während der Lagerung zu hemmen. - Ersetzen PBS + Puffer mit 500 & mgr; l Permeabilisierung Puffer waschen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10-15 min.
- BSA Blockierungspuffer Optional entfernen. Verwendung Skalpell oder eine Schere, den Verbrauch Sphäroide und den umgebenden 3 mm x 3 mm Bereichs aus der Kollagenschicht. Unter Verwendung eine große Bohrung p1000 Spitze abzulösen den ausgeschnittenen Block von Kollagen durch vorsichtig mit frischem BSA Blockierungspuffer gespült. Übertragen Kollagen Block zu 1,5 ml-Röhrchen.
- Zentrifuge bei 2000 × g für 2 min und Überstand entfernen. Das Rohr kann vorsichtig über sauberes Papiertuch umgedreht werden, um überschüssige Flüssigkeit nach außen ab.
- Bereiten Sie Sphäroiden und einbetten in Kollagen gefüllte Kammer gleitet, wie in den Abschnitten 1 bis 2 beschrieben.
- In primären Antikörper zu Sphäroiden und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Gebe ausreichend Volumen des primären Antikörpers, so dass die gesamte Kollagenschicht gleichmäßig eingetaucht ist. Die optionalen obigen Schritte (5.6.8.1-5.6.8.2) ermöglichen typischerweise die Verwendung von kleineren Mengen des Antikörpers.
- Unterzutauchen Kammerobjektträger in einem Behälter mit mindestens 10 ml PBS + wash buffer für 10 min zu waschen. Wiederholen mindestens zweimal.
- Optional, wenn Sphäroiden aus Kollagenschicht herausgeschnitten wurden vorher (Schritt 5.6.8.1), ein Minimum von 1 ml PBS hinzufügen + waschen , um die 1,5 - ml - Röhrchen Puffer und vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie für mindestens 10 Minuten einweichen.
- Zu entfernen , so viel PBS + Waschpuffer wie möglich und wiederholen Waschen mit PBS + wash mindestens zweimal puffern. Zentrifuge bei 2000 × g für mehrere min Kollagen Block zu pelletieren.
HINWEIS: Reinigen Sie Außenflächen der Kammer Rutsche durch mit 70% Ethanol abgewischt vor Waschpuffer eingetaucht in.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.6.9-5.6.10 geeigneten sekundären Antikörper verwendet wird.
HINWEIS: Wenn Sphäroiden wurden direkt im Abbildungsgefäß gefärbt, gehen 5.6.13 zu treten. - Optional, wenn Sphäroiden wurden aus Kollagenschicht ausgeschnitten zuvor (Schritt 5.6.8.1), saubere Glasobjektträger und der konfokalen Mikroskopie-kompatible Deck mit 70% Ethanol.
- Entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich aus dem Kollagenblock und resuspendieren in ultrareinem H 2 O Führen Sie diesen Schritt unmittelbar vor der Montage. Lassen Sie keine gefärbten Blöcke in Wasser einweichen.
- Mit feinen Spitze einer Pinzette greifen Rand von Kollagen Block und Transfer zum Glasträger.
- mit der Pinzette das Kollagen an Ort und Stelle mit einem sauberen Wattestäbchen zu halten, überschüssige Flüssigkeit aus dem Kollagen Block Docht, um sicherzustellen, nicht das Kollagen direkt zu berühren.
HINWEIS: Wenn Kollagen Wattestäbchen stecken wird, kann es leicht entweder mit einer Pinzette entfernt werden, oder durch Untertauchen im Wasser.
- Mit Reverse Pipettiertechnik werden 100 & mgr; l MOWIOL Montagemedium auf die Kollagenblock und Eindecken über die Probe.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder Papiertuch unter dem Deck Überschuss MOWIOL Eindeckmediums und Wasser aus Docht.
- Lassen Sie MOWIOL Eindeckmediums über Nacht bei 4 ° zu härtenC. Siegel Kanten von Deck mit Nagellack.
- Bild gefärbten Sphäroide konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie Lokalisierung von Proteinen von Interesse zu beobachten, die Bildung von invasive Strukturen usw. (Figuren 5B, 5C).
HINWEIS: Befleckt Sphäroiden sollte vor Licht geschützt werden Photobleichens zu verhindern.
6. Anoikis Assay
HINWEIS: Die Sphäroidbildung Protokoll ist einfach angepasst verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit in einer Vielzahl von Zelltypen zu quantifizieren.
- Aussäen Zellen für anoikis Assay (Figur 6)
- Folgen Sie den Anweisungen für die Sphäroid-Produktion in Abschnitt 1.4, aber ein Minimum von 30 mg / ml Methylcellulose verwenden, um Sphäroidformation Medium herzustellen.
HINWEIS: Wenn erwärmt, 30 mg / ml Methylcellulose ein dickes Gel erzeugen sollte, die Zellen in Suspension hält. - Inkubiere Zellen für mehrere Tage bis Wochen und inspect regelmäßig bei 10-facher Vergrößerung mit einem Mikroskop. Zellen, die anoikis widerstehen sollten Kolonien vermehren und bilden.
- Quantifizierung anoikis durch Messen der Anzahl und Grße der Kolonien in jeder gebildet gut.
HINWEIS: Sobald Kolonien gebildet sind, werden sie gewaschen werden, um die Methylcellulose und für Sphäroid basierenden Assays zu entfernen, wie beschrieben.
- Folgen Sie den Anweisungen für die Sphäroid-Produktion in Abschnitt 1.4, aber ein Minimum von 30 mg / ml Methylcellulose verwenden, um Sphäroidformation Medium herzustellen.
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Representative Results
Wir beschreiben eine flexible und effiziente Methode diskreten Sphäroiden zu erzeugen, unter Verwendung von zellabstoßenden Platten und Sphäroidbildung Medien mit MC ergänzt. Unter den geeigneten Bedingungen von MC und Serum, siedeln einzelnen Zellen und halten uns zusammen in der Mitte des Brunnens Sphäroiden zu bilden, mit minimaler Einhaltung des Näpfchenboden. Unter Verwendung dieses Protokolls, Sphäroide wurden aus einer Vielzahl von Zelllinien (2B) erzeugt wird . Titration von MC und Serumkonzentrationen für jede Zelllinie erforderlichen optimalen Bedingungen zu ermitteln, in denen nur eine einzige Sphäroid gebildet wird, die robust genug ist, Manipulation zu ermöglichen, ohne fragmentieren. Optimal ist die Sphäroide lagen zwischen 200 bis 500 & mgr; m im Durchmesser, und bestand aus dicht anhaftenden Zellen mit minimaler Zelltrümmer. Sphäroide überlebt schonende Behandlung ohne Schaden zu, so dass sie in einer Vielzahl von Assays gesammelt und verwendet werden.
(3A) beeinträchtigt werden könnte, die in Aggregaten von toten Zellen führte. In Gegenwart von Staub oder anderen Faser Kontamination, Mehrfach- oder unregelmäßig geformte Zellhaufen, die nur schwach aggregiert gebildet wurden und die resultierende Sphäroide leicht auseinander brach bei der Handhabung. Sphäroid - Bildung wurde auch durch suboptimale Konzentrationen von MC oder Serum in der Sphäroidbildung Medium (3B) berührt. In unseren Tests waren viele Zelllinien können zellabweisenden Platten in Abwesenheit oder bei geringen Konzentrationen von MC und führte zur Bildung eines Sphäroids mit einer Zellmonoschicht (3B-ii) umgeben zu haften. BxPC-3-Zellwachstum suboptimal MC Bedingungen wird als ein Beispiel gezeigt. Im allgemeinen höhere Konzentrationen von MC verhindert Zellen zum gut anhaftende, aber eine zu hohe Konzentration von MC reduziert Zell-Zell-Adhäsion und verhindert Zellen auszum Boden des Bohrlochs Absetzen, zur Bildung von losen Aggregaten und zahlreichen Satelliten Sphäroide (3B-i) führt. Die Konzentration des Serums auch das Überleben der Zelle beeinflusst und Zell-Zell- und Zell-Kunststoff-Adhäsions- und benötigt für verschiedene Zelllinien optimiert werden. Für Zelllinien wie HCT-116 und PANC-1, eine zu hohe Serumkonzentration führte zu einer übermäßigen Zellproliferation und der Produktion von übergroßen Sphäroiden, die durch die Handhabung leicht beschädigt wurden oder die Zelladhäsion an dem Kunststoff gut gefördert und die Bildung einer Monoschicht ( 3B-iii). Interessanterweise unterschieden sich die Wirkungen nicht ausreichend Serum zwischen Zelllinien. HCT-116 wurde das Überleben der Zelle reduziert und die gebildeten Sphäroiden klein waren, einen großen Anteil an toten Zellen in niedrigen Serum enthält. Im Gegensatz dazu waren lebensfähig PANC-1 - Zellen in Abwesenheit von Serum, jedoch wurde mehr adhärenten und bildeten mehrere Aggregate sowie eine Zell - Monoschicht (3B-iv, v).
Eine Modifikation der Sphäroidbildung Protokoll beschrieben, bei dem einzelne Zellen in höherer Konzentration MC suspendiert (30 mg / mL) verwendet werden anoikis Widerstand zu überwachen. Bei diesen MC-Konzentrationen Medium kann noch mit einer Pipette, während kühl übertragen werden, aber bei 37 ° C in ein festes Gel verdickt. Anoikis beständig in dieses Medium resuspendierten Zellen blieben in Suspension proliferiert und über einen Zeitraum von 2-4 Wochen, suspendiert Sphäroide unterschiedlicher Größe (6B) bildet. Verankerungsabhängigen Zellen bilden keine Sphäroide unter diesen Bedingungen. Wir waren in der Lage anoikis-Resistenz zu quantifizieren, indem die taub Zählener von Sphäroiden in jeder Vertiefung gebildet wird.
Abbildung 1: Überblick über die 3D - Sphäroidformation Protokoll. Zellen in Monolayer-Kultur gezüchtet werden dissoziiert, gezählt, pelletiert und in Sphäroidbildung Medium mit Methylcellulose (MC) und Serum (i-iv) ergänzt resuspendiert. Die Suspension wird ausgesät in eine U-bottom zellabweisenden Platte an gewünschten Dichte Bildung von Sphäroiden mit der gewünschten Größe zu ermöglichen, (v), und die Platte wird in jede Vertiefung (vi) eine einzelne, diskrete Zell-Sphäroiden zu erzeugen inkubiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Optimierte Sphäroidformation Bedingungen.(A) Sphäroidformation unter optimalen Bedingungen für SH-SY5Y - Zellen. 1000 Zellen ausgesät in U-Boden zellabweisenden Platten in Medium mit 5% Serum ergänzt und 1 mg / ml MC aggregiert in kompakte Sphäroide innerhalb von 24 h. (B) Repräsentative Bilder von verschiedenen Zelllinien unter optimalen Bedingungen gebildet Sphäroiden in Tabelle 1 gezeigt Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Sphäroidformation unter suboptimalen Bedingungen. (A) Sphäroide in Gegenwart von Verunreinigungen gebildet. Die mikrobielle Kontamination führte zu Zelltod und lose aggregiert Sphäroiden. In Anwesenheit von unlöslichen Verunreinigungen, wie beispielsweise Staub oder Fasern, auf diese Materialien adhärierten Zellen und nicht AGGREGaß. (B) Sphäroidbildung in suboptimal Sphäroidbildung Medium. BxPC-3 ausgesäten Zellen in Gegenwart von überschüssigem MC (10 mg / mL) zahlreiche Satelliten Sphäroide (i) gebildet, während unzureichende MC (0 mg / ml) führte zu Zellaggregaten, die mit dem Vertiefungsboden geklebt und eine Monoschicht gebildet wird (ii ). Ähnliche Ergebnisse wurden für die anderen getesteten Zelllinien beobachtet (nicht gezeigt). Überschüssiges Serum (20%) führte zu einer erhöhten HCT-116-Zellproliferation und der Monoschichtbildung (iii). Unzureichend Serum (0%) hatten Zellleitungsspezifische Effekte reichen von Zelltod in HCT-116 (iv) zur Bildung von Satelliten Sphäroide in PANC-1 (v). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Invasion Assay Sphäroiden Verwendung. (A) Overview von Sphäroid Invasionstest. Das Abbildungsgefäß vorbeschichtet mit einer Schicht aus neutralisiertem Kollagen und inkubiert, um das Kollagen (i-ii) zu polymerisieren. Vorgeformte Sphäroide werden in 1,5 ml-Röhrchen pelletiert und in neutralisiert Kollagen (iii-vi) gesammelt. Das Sphäroid-Kollagen-Mischung wird auf das Kollagen Basisschicht überschichtet und inkubiert, um das Kollagen (vii-viii) zu polymerisieren. Wachstumsmedium gewünschten Verbindungen enthält, wird dann auf die polymerisierten Sphäroid-Kollagenschicht überschichtet und inkubiert, um die Zellinvasion (ix-x) ermöglichen. (B) in Gegenwart eines chemoattractant werden die Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten Invasion in das umgebende Kollagenmatrix aus einem eingebetteten PANC-1 Sphäroid gezeigt. Jedes Panel zeigt ein Phasenkontrastbild ein 10X-Objektiv erworben werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Immunfluoreszenzanfärbung von Collagen-embedded Sphäroiden. (A) Übersicht Protokoll für Immunfluoreszenzanfärbung von Sphäroiden. Eingebettete Sphäroide werden gewaschen, fixiert (NBF) und blockiert (BSA) direkt in dem Bilderzeugungsgefäß. Sphäroide können in einem kleineren Volumen, wie beispielsweise ein 1,5-ml-Röhrchen direkt oder ausgeschnitten und gefärbt gefärbt werden. Sphäroiden sollte mit einem Überschuss an Puffer nach jedem Fleck gewaschen werden Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Befleckten Sphäroide können direkt in den Behälter oder montiert unter einem Deckglas für die Bildgebung und Lagerung abgebildet werden. (B) Immunofluoreszenz Bilder eines TPC-1 - Zell - Sphäroiden in Kollagen eingebettet und für 24 h eindringen gelassen. (C) Bilder Phalloidin gefärbten Zellen typisch für Regionen in B angedeutet zeigt Jedes Panel zeigt eine 20 & mgr; m Z-Projektion (0,2 & mgr; m - Schritten) erwarb ein 60X Ziel mit: Zellen innerhalb der Sphäroid body etwa 20 um von der Oberfläche (1), Zellen in Kollagen hervorstehenden (2) und durch Kollagen eindringenden Zellen (3). Maßstabsbalken = 25 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Sphäroidformation Anoikis Assay. (A) Übersicht Protokoll für anoikis Assays. Zellen werden hergestellt, wie in Figur 1 beschrieben, jedoch werden in Sphäroidbildung Medium, das mindestens 30 mg / ml MC, die eine dicke Schicht einzelnen Zellen in Suspension zu halten bildet resuspendiert und Zellaggregation (i-ii) zu verhindern. Die Zellsuspension wird ausgesät in U-Bodenzelle abweisenden Platten und inkubiert (III-iv). Die suspendierten Zellen können für Sphäroidbildung durch Proliferation überwacht werden, anoikis Widerstand anzeigt. (
| Zelllinie | MC (mg / mL) | Serum (%) | Ungefähre Inkubation Zeit |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 Stunden |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 bis 5 Tage |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 bis 7 Tagen |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 bis 4 Tagen |
| TT | 1 | 10 | 7 bis 10 Tage |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 bis 2 Tage |
Tabelle 1: Optimale Sphäroidformation Medium Zusammensetzung und Inkubationszeiten für validierte Zelllinien.
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Discussion
Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und flexible Methode zur 3D - Zell Sphäroiden Herstellung der Architektur von in - vivo - Gewebe unter Verwendung von kostengünstigen und weithin verfügbare Reagenzien zu modellieren. Unser Protokoll nutzt die nicht-zytotoxischen und haftungsverbessernde Eigenschaften von MC 8, 9 Zellaggregation zu vermitteln und Zellschicht Bildung zu minimieren. Anders als Proteinbasis Matrices aus tierischen Quellen isoliert, MC inert, enthält keine Wachstumsfaktoren und durch Waschen leicht entfernt werden kann, so dass die Isolierung von Sphäroiden zur Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen ohne Anwesenheit von Restmatrix. Unser Protokoll nutzt schnelle Aggregation von konsistenten Zellzahlen homogen Größe Sphäroiden zu erzeugen, so dass ein direkter Vergleich der Sphäroiden unter verschiedenen experimentellen Bedingungen gezüchtet. Dieses Verfahren kann für Mischkulturen angepasst werden in vivo Tumorwachstum zu modellieren , indem feste Zahlen von mehreren Tumor-assoziierten Zelltypen kombiniert (zB Fibroblasten, Leukozyten, Stromazellen) , um genauer die Tumorumgebung darstellen.
Modifikationen unserer Protokoll in hohen Konzentrationen von MC ausgesäten Zellen können hergestellt werden verankerungsunabhängiges Wachstum von Zellen in der Lage zu proliferieren in Suspension zu überwachen, und kann als anoikis Assay (Abschnitt 6) zu identifizieren oder zu quantifizieren Zelltransformation verwendet werden. Sphäroiden durch unser Protokoll erzeugt sind ideal für Anwendungen wie zum Beispiel Drogen-Screening, wodurch ein Vergleich des Zellwachstums, Stoffwechsel, Überleben und Invasivität zwischen den Behandlungsbedingungen. Isolierte Sphäroiden kann auch in einer extrazellulären Matrix, wie Kollagen eingebettet werden, zu bewerten und zu Zell Invasivität in einem 3D-Mikroumgebung (Abschnitt 2.2, 4) , die genauer Modelle in vivo Tumorwachstum zu quantifizieren. Weiter kann unser Protokoll große Mengen von Sphäroiden von der MC-Matrix für Protein- oder RNA-Präparation, so dass u zu isolieren, verwendet werden,sers Zellensignal oder Veränderungen der Genexpression in Reaktion auf die Behandlung oder Wachstumsbedingungen zu bewerten.
Unsere Sphäroidbildung Protokoll erfordert die Optimierung von Serum und MC-Konzentrationen, und die Anzahl der für jede Zelllinie ausgesäten Zellen. Zellleitungsspezifischen Eigenschaften, wie die Lebensfähigkeit der Zellen, Zell-Zell- und Zell-Kunststoff Klebrigkeit kann signifikant die Leichtigkeit beeinflussen, mit der Sphäroide gebildet werden. Im Allgemeinen Zelllinien mit einer schlechten Rentabilität in Monolayer-Kultur erforderliche höhere Serumkonzentrationen Sphäroid Bildung zu fördern, während höhere Konzentrationen MC für stark haftend Zelllinien bevorzugt wurden. Wir empfehlen daher, Titrationen von Serum und MC die optimalen Bedingungen für das Überleben der Zelle (Serumkonzentration) zu bestimmen, durchgeführt werden, während einschichtige minimiert und Satelliten Sphäroidformation (MC-Konzentration). Diese Bedingungen sollten ohne Satelliten Erzeugung eines einzelnen diskreten Sphäroiden pro Vertiefung führen. Optimale Sphäroid Größe fürAnalyse ist anwendungsabhängig und wird durch die Anzahl der Zellen beimpft und Serumkonzentration (Schritt 1.4.7) beeinflusst. Weniger Zellen Impfen erzeugt kleinere Aggregate, die leichter homogen gefärbt sind, kann jedoch in vivo Zell-Zell- und Zell-Wechselwirkungen Mikroumgebung nicht reproduzieren. Erhöhen der Anzahl der Zellen beimpft erzeugt größere Sphäroide, die ein physiologisch repräsentativen hypoxischen Kern 10 enthalten kann , die das Zellverhalten und verändern Interpretationen des Wachstums oder Überlebens - Assays beeinträchtigen kann. Wenn jedoch zu groß ist, kann Sphäroiden sein zerbrechlich und sind leicht auseinander gebrochen oder während der Isolierung beschädigt. Größere Sphäroide sind auch viel härter ohne Plattformen für optische Schnitte (zB Lichtbogenfluoreszenzmikroskop) oder durch Einbetten oder Kryoschneiden und Färbung von Querschnitten durch das Sphäroid 11 spezialisierte Bildgebung zu visualisieren. Wir empfehlen ein Ziel Sphäroid Größe von 200 bis 500 & mgr; m für Flexibilität undLeichtigkeit der für die meisten Anwendungen Handhabung. Insgesamt ist es wichtig, die Bedingungen für die Sphäroidbildung in sowohl einer Zellinie spezifische und anwendungsspezifische Art und Weise zu optimieren.
Sphäroid Produktionsprotokolle erfordern besondere Aufmerksamkeit Kontamination von Sphäroiden durch Staub und andere Partikel zu vermeiden. Zellen zu Staub und andere unlösliche Verunreinigungen haften, was zu unregelmäßig geformten, lose anhaftenden Zellaggregate für den Einsatz in Analysen (3A) ungeeignet. Kontaminationsquellen kann durch Hindurchleiten alle Lösungen durch einen 0,45 um-Filter, Spülen der Zellschicht mit gefiltertem Medium vor der Dissoziation (Schritt 1.4.1), und Spülen Mehrkanal- Pipetten Reservoire mit gefiltertem Reinstwasser unmittelbar vor dem Gebrauch minimiert werden (Schritt 1.4.6.1). Ferner Baumwolle gefilterte serologischen Pipetten, die Fasern in Lösungen vergießen können, sollten vermieden werden. Obwohl nicht kritisch, kann Staub weiter durch dissociat vorbei reduziert werdenED-Zellen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb vor der Aussaat (Schritt 1.4.6). Verdampfungsverlust des Mediums ist eine zusätzliche technische Überlegungen, insbesondere für Inkubationszeiten von mehr als 1 Woche , wie sie erforderlich durch bestimmte Zelllinien für die Sphäroid - Bildung (Tabelle 1) oder während anoikis Assays (Abschnitt 6). Verdampfung kann durch Animpfen Zellen in Vertiefungen in dem mittleren Bereich der Multi-Well-Platten, Füllen Umfang Vertiefungen mit Reinstwasser minimiert werden und lose die Ränder der Dichtungsplatte oder der Platte in einer befeuchteten Kammer umschließt.
3D-Zell Sphäroide sind ein wertvolles Modell für die Untersuchung von sowohl normalen als auch Tumorzellverhalten und Physiologie. Unser Protokoll ist ein schnelles und wirtschaftliches Verfahren zur Erzeugung von gleichbleibender Größe 3D-Zell Sphäroide, die in einer Auswahl von Assays und Anwendungen verwendet werden können. Diese Sphäroiden stellen wertvolle Werkzeuge für die Charakterisierung von Tumorwachstum und Mikro Wechselwirkungen sowie Modelle für preClinical Evaluierung neuer Therapien.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
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- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
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