Summary
Her blev høj opløsning 1H og 13C kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi anvendes som en hurtig og pålidelig værktøj til kvantitativ og kvalitativ analyse af indkapslede fiskeolie kosttilskud.
Abstract
Den vestlige kost er fattig på n -3 fedtsyrer, anbefales derfor forbruget af fiskeolie kosttilskud for at øge indtaget af disse vigtige næringsstoffer. Formålet med dette arbejde er at demonstrere den kvalitative og kvantitative analyse af indkapslede fiskeolie kosttilskud ved hjælp af høj-opløsning 1H og 13C NMR-spektroskopi ved anvendelse af to forskellige NMR-instrumenter; en 500 MHz og en 850 MHz-instrument. Både proton (1 H) og carbon (13C) NMR-spektre kan anvendes til kvantitativ bestemmelse af de vigtigste bestanddele af fiskeolie kosttilskud. Kvantificering af lipiderne i fiskeolie kosttilskud opnås ved integration af de passende NMR-signaler i den relevante 1D spektre. Resultater opnået ved 1H og 13C NMR er i god overensstemmelse med hinanden, på trods af forskellen i opløsning og følsomhed mellem de to kerner og de to instrumenter. 1H NMR tilbudsa mere hurtig analyse sammenlignet med 13C NMR, som det frekvensområde kan optages i mindre end 1 min, i modsætning til 13C NMR-analyse, som varer fra 10 min til en time. 13C NMR-spektret, er imidlertid meget mere informativ. Det kan give kvantitative data for et større antal af individuelle fedtsyrer og kan anvendes til bestemmelse af stillingsfordelingen af fedtsyrer på glycerolskelettet. Begge kerner kan give kvantitative oplysninger på bare et eksperiment uden behov for rensning eller adskillelse trin. Styrken af magnetfeltet hovedsagelig påvirker 1H NMR-spektre på grund af dets lavere opløsning i forhold til 13C NMR imidlertid endnu lavere omkostninger NMR instrumenter kan effektivt anvendes som en standard metode fødevareindustrien og kvalitetskontrol laboratorier.
Introduction
Forbruget af n -3 fedtsyrer i kosten har vist sig at være gavnlig mod flere betingelser, såsom hjertesygdomme 1, 2, 3, inflammatoriske sygdomme 4 og diabetes 5. Den vestlige kost anses for ringe i n -3 fedtsyrer og anbefales derfor forbruget af fiskeolie kosttilskud for at forbedre n -6 / n -3 balance i forbrugerens ernæring 1. På trods af den seneste stigning i fiskeolie supplere forbrug, spørgsmål forbliver om sikkerheden, autenticitet, og kvaliteten af nogle af disse produkter. Den hurtige og præcise analyse af sammensætningen af fiskeolie kosttilskud er afgørende at kunne vurdere kvaliteten af disse kommercielle produkter og sikre forbrugernes sikkerhed.
De mest almindelige metoder til vurdering af fiskeolie suppleres er gaschromatografi (GC) og infrarød spektroskopi (IR). Mens disse er meget følsomme metoder, lider de af adskillige ulemper 6. GC-analyse er tidskrævende (4-8 timer), fordi separation og derivatisering af individuelle forbindelser er påkrævet 7 og lipidoxidation kan der ved en analyse 8, 9. Mens IR-spektroskopi kan være kvantitativ, er en forudsigelsesmodel, der skal konstrueres ved anvendelse af partiel mindste kvadraters regression (PLSR), selv om der er undtagelser, i hvilke IR-bånd kan tilskrives en enkelt forbindelse 10. PLSR kræver analyse af et stort antal prøver, hvilket øger tidspunktet for analyse 11. Af denne grund er der en stigende interesse for udvikling af nye analysemetoder, der tillader præcis og hurtig analyse af et stort antal fisk olieprøver. Organisationer som Office af kosttilskud (ODS) på National Institutes of Health (NIH) og Food and Drug Administration (FDA) har samarbejdet med Association of Official Analytical Chemists (AOAC) at udvikle disse nye metoder 12, 13.
Et af de mest lovende analysemetoder til screening og evaluering af flerkomponent-matricer, såsom kosttilskud, er kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi 14, 15. NMR-spektroskopi har adskillige fordele: det er en ikke-destruktiv og kvantitativ teknik, kræver minimal til ingen prøveforberedelse, og den er kendetegnet ved fremragende nøjagtighed og reproducerbarhed. Desuden NMR-spektroskopi er en miljøvenlig metode, fordi den udnytter kun små mængder af opløsningsmidler. Den største ulempe ved NMR-spektroskopi er dens relativt lav følsomhed sammenlignet med andre analytical metoder er imidlertid nylige teknologiske fremskridt inden instrumentering såsom stærkere magnetfelter, kryogeniske prober med forskellige diametre, avanceret databehandling og alsidige pulssekvenser og teknikker har øget følsomhed på op til nM-området. Mens NMR instrumentering er høje omkostninger, lang levetid af NMR-spektrometre og de mange anvendelser af NMR sænke omkostningerne ved analysen i det lange løb. Denne detaljerede video protokol er beregnet til at hjælpe nye praktikere på området undgå faldgruber forbundet med 1H og 13C NMR-spektroskopisk analyse af fiskeolie kosttilskud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NMR Prøvefremstilling
Bemærk: Forsigtig, se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Deutereret chloroform (CDCI3) anvendt i prøvefremstilling er giftig. Brug venligst alle de relevante sikkerhedsregler, når du udfører prøveforberedelse, herunder brug af et stinkskab og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, lukket-tå sko).
- Fremstilling af 1H og 13C-prøver
- Uddrag 120 pi (~ 110 mg) af fiskeolie fra et diætetisk kapsel under anvendelse af en sprøjte og læg den i en 4 ml hætteglas. Noterer vægten af fiskeolie.
- prøveopløsning
- Opløs ca. 120 pi fiskeolie i 500 pi CDCI3 indeholdende 0,01% af tetramethylsilan (TMS), der anvendes som reference for 1H og 13C kemiske skift.
BEMÆRK: TMS er brugd kun for kemiske skift kalibrering (se trinnumre 2.2.1.2.7 og 2.2.2.2.7), ikke til kvantificering (se trinnumre 2.2.1.3 og 2.2.2.3) formål. - Forbered en 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) stamopløsning Hvis kvantificering udtrykt i mg / g er ønsket, ved at opløse ca. 220 mg BHT og 15 mg chrom (III) acetylacetonat (Cr ( acac) 3) i 20 ml CDCI3 indeholdende 0,01% af TMS. Anvende 500 pi af stamopløsningen for at opløse 100 mg (± 10 mg) af fiskeolie.
- Opløs ca. 120 pi fiskeolie i 500 pi CDCI3 indeholdende 0,01% af tetramethylsilan (TMS), der anvendes som reference for 1H og 13C kemiske skift.
- Efter opløsning af olien (det tager nogle få sekunder), overføre hele opløsningen direkte i en høj kvalitet 5 mm NMR-rør og fastgøre en hætte. Prøverne analysere inden for 24 timer efter fremstilling af prøverne.
fremstilling 2. NMR Instrument
Bemærk: Forsigtig, pas, at tilstedeværelsen af stærke magnetfelter produceret ved NMR instrumenter kan påvirke medicinsk udstyr og implmyrer såsom pacemakere og kirurgiske proteser, samt elektroniske elementer såsom kreditkort, ure mv Yderligere forsigtighed er påkrævet, når analysen udføres ved hjælp af ikke-afskærmning magneter. To NMR instrumenter blev anvendt til erhvervelse af 1H og 13C NMR-spektre; et spektrometer, der arbejder ved 850,23 MHz og 213,81 MHz for 1H og 13C kerner, henholdsvis forsynet med tredobbelt resonans helium-afkølet inverse (TCI) 5 mm sonde og et spektrometer, der arbejder ved 500,20 MHz og 125,77 MHz for 1H og 13C kerner, henholdsvis forsynet med et bredt bånd observeret (BBO) nitrogenafkølet 5 mm probe. Alle eksperimenter blev udført ved 25 ± 0,1 ºC og spektrene blev forarbejdet ved en standard-NMR-data analyse og -behandling softwarepakke (se Materialer List).
- Forberedelse til erhvervelse af NMR-spektre
Bemærk: 1H og 13C NMR-spektrekan erhverves følgelig uden at fjerne prøven fra instrumentet.- Sæt NMR-røret i en spinder turbine (se Materialer List).
- Placer spinderen og røret på toppen af en gradueret dybdemåler og forsigtigt skubbe toppen af røret indtil den nederste del berører bunden af profilet.
- Placere NMR prøve i en åben stedet af SampleCase. Bemærk slotnummer prøven anbringes i.
- For at indlæse prøven i NMR, vende tilbage til kontrol computer og typen 'sx #', hvor # er åbningen i SampleCase holde din prøve.
- Vent til deuteriumsignalet af CDCl3 at blive vist på låsen vindue skærmen. Hvis det ikke vises automatisk, skal du skrive "lockdisp". Så snart deuteriumsignalet er synlig, typen "låse" på kommandolinjen og vælg "CDCI3" fra opløsningsmidlet liste for at låse prøven under anvendelse af CDCI3 deuterium resonans.
BEMÆRK: Deuterium signal kan udeblive, hvis tidligere bruger anvendes et andet opløsningsmiddel. Brugeren skal vente på indikatoren, at prøven er nede, så lås. - Skriv "bsmsdisp" i kommandolinjen for at sikre spinning er ikke aktiv. Hvis "SPIN" knappen er grøn, skal du klikke på det for at deaktivere spinding.
- Skriv den "nye" kommando til at oprette et nyt datasæt. Indtast et navn til datasættet i "NAME" fanen og eksperimentet nummer i "EXPNO" fanen. Brug nummer "1" i "PROCNO" fanen. I fanebladet "Experiment", hit "Vælg" og vælg "PROTON" parameter fil. Skriv titlen på eksperimentet i fanen "TITLE". Klik på "OK".
- Skrive "getprosol" i kommandolinjen for at opnå faste parametre for den aktuelle NMR probe og opløsningsmiddel.
- Gentag trin 2.1.7 til 13C, vælge "C13IG" pulssekvens i fanen "Eksperiment" til 1D 13C inverse gated afkoblet eksperiment.
- Skrive "getprosol" i kommandolinjen for at opnå faste parametre for den aktuelle NMR probe og opløsningsmiddel.
- Skriv kommandoen "Atma" for at udføre automatisk indstilling og matchning af sonden for både kulstof og proton kerner.
- Udføre endimensional gradient lagdannelse at opnå en meget homogent magnetfelt, og dermed optimal linje form til NMR-signalerne.
- Brug standard automatisk procedure for 1D afstandsstykker, blot ved sekventielt at udføre kommandoerne "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss," og "qu topshim rapport" på kommandolinjen.
- Parameter optimering
- 90 ° puls kalibrering
- Opret en ny datasæt for 1H (se trin 2.1.7 og 2.1.8).
- Skriv kommandoen "paropt" på kommandolinjen for at starte automatisering program til kalibrering af 90 ° pulse. Vælg puls varighed, p1, som den parameter der skal ændres.
- Begynde med "2" mikrosekunder som den oprindelige værdi af p1, indtaste "2" us intervaller og udfører "16" -forsøg.
- Opret et nyt datasæt til 13C (se trin 2.1.9) og gentag processen til 13 C kerner (se trin 2.2.1.2 og 2.2.1.3).
- T 1 måling målt ved nul metode 16 for 1H
BEMÆRK: null metode bruger inversion recovery pulssekvens, der består af en 180 ° puls følge af en forsinkelse (tau), for at tillade afslapning langs z-aksen og en afsluttende 90 ° impuls, som skaber det observerbare tværgående magnetisering.- Opret en ny datasæt for 1H (se trin 2.1.7 og 2.1.8).
- Skrive "pulprog t1ir1d" for at ændre pulssekvensen til inversion-recovery eksperiment.
- Skrive følgende kommandoer på command line at oprette den spektrale bredde i ppm, midt i RF-transmitteren, antallet af scanninger antallet af dummy scanninger og antallet af datapunkter "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2" og "td 64K".
- Typen "p1 (værdi)" og indtast varighedsværdier for 90 ° puls som bestemt ved pulsen kalibrering (se trin 2.2.1) og skriv "p2 (værdi)" til 180 ° puls (varigheden værdi for de 180 ° puls er den 90 ° impulsvarighed multipliceret med to).
- Indstil genbruge forsinkelse til en meget stor værdi, såsom 10 s ved at skrive "d1 10".
- Set tau til en kort værdi, såsom 10 ms, ved at skrive "d7 10ms" i kommandolinjen.
- Sæt modtageren gevinst (RG) til en passende værdi ved anvendelse af kommandoen "RGA" for automatisk beregning af RG.
- Kør en spektrum ved at skrive kommandoen "zg".
- Udfør Fourier-transformation ved at skrive "EFP"i kommandolinjen.
- Udfør automatisk korrektion fase ved at skrive kommandoen "APK" i kommandolinjen. Hvis justeringer yderligere fase er forpligtet til yderligere at forbedre spektret, skal du klikke på "Process fanen" og derefter klikke på ikonet "Adjust Fase" at komme ind i fase korrektion tilstand.
- Bruge nulte orden (0) og første ordens (1) fasekorrektion ikoner ved at trække musen indtil alle signalerne er i negativ absorption mode. Anvend og gem fase korrektionsværdier ved at klikke på knappen "Return og Gem" for at afslutte fase korrektion tilstand.
- Øge tau indtil alle toppe er enten positive eller elimineret ved at gentage trin 2.2.2.6-2.2.2.9. For at bestemme T 1 værdi, blot opdele tau værdi, hvor toppen er elimineret med LN2.
- T 1 måling målt ved nul metode 16 til 13C
- Opret et nyt datasæt til 13C (se trin 2.1.9)
- Typen "pulprog t1irpg" for at ændre pulssekvensen til inversion-recovery eksperiment for carbon kerner.
- Skrive følgende kommandoer på kommandolinjen at oprette den spektrale bredde i ppm, midt i RF-transmitteren, antallet af scanninger, antallet af dummy scanninger og antallet af datapunkter: "sw 200", "o1p 98" , "ns 8", "ds 2" og "td 64K".
- Typen "p1 (værdi)" og indtast varighedsværdier for 90 ° puls som bestemt ved pulsen kalibrering (se trin 2.2.1) og type "p2 (værdi)" til 180 ° puls (varighed værdi er 90 ° impulsvarighed multipliceret med to).
- Indstil genbruge forsinkelse til en meget stor værdi, såsom 100 s ved at skrive "d1 100".
- Set tau til en kort værdi, såsom 100 ms ved at skrive "d7 100 ms" i kommandolinjen.
- Indstil Modtagare gevinst (RG) til en passende værdi ved anvendelse af kommandoen "RGA" for automatisk beregning af RG.
- Kør en spektrum ved at skrive kommandoen "zg".
- Udfør Fourier-transformation ved at skrive "EFP" i kommandolinjen.
- Udfør Automatisk korrektion fase ved at skrive kommandoen "APK" i kommandolinjen. Hvis justeringer yderligere fase er nødvendige for yderligere at forbedre spektrum, klikke på "Adjust Phase" ikonet og fasekorrektionen ikonerne for nulte orden (0) og fase (1) korrektion af første orden.
- Mens klikke på korrektionsfaktorerne ikoner nulteordens og første ordens fase, trække musen indtil alle signalerne er i negativ absorption mode. Anvend og gem fase korrektionsværdier ved at klikke på knappen "Return og Gem" for at afslutte fase korrektion tilstand.
- Øge tau indtil alle toppe er enten positive eller elimineret ved at gentage trin 2.2.3.6-2.2.3.9. For at bestemmeT 1 værdi, blot opdele tau værdi, hvor toppen er elimineret med LN2.
- 90 ° puls kalibrering
- Endimensionale (1D) NMR-spektre
- 1H-NMR-spektre
- Erhvervelse af NMR-data
- Gå til 1H datasættet oprettet i trin 2.1.7 og bruge standard "pulse-acquire" pulssekvens, "zg", ved at skrive "pulprog zg" i kommandolinjen.
- Skrive følgende kommandoer på kommandolinjen at oprette den spektrale bredde i ppm, midt i RF-transmitteren, antallet af scanninger, antallet af dummy scanninger, antallet af datapunkter og impulsvarigheden for en 90 ° puls vinkel : "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" og "p1 (som bestemt ved puls kalibrering)" (se trin 2.2.1).
BEMÆRK: 32K datapunkter kan bruges til 500 MHz instrument. - Sæt en lempelse forsinkelse på 7 s til 500 MHz instrument eller 9 s for 850 MHz-instrument ved at skrive "D1 7s" eller "D1 9s", henholdsvis i kommandolinjen.
- Sæt modtageren gevinst (RG) til en passende værdi ved anvendelse af kommandoen "RGA" for automatisk beregning af RG.
- Skrive "digmod baseopt" for at erhverve et spektrum med forbedret baseline.
- Start købet ved at skrive pulsen-erhverve kommandoen "zg" i kommandolinjen.
- Behandlingen af NMR-data
- Skriv "si 64K" i kommandolinjen for at anvende nul-påfyldning og indstille størrelsen af den virkelige spektrum til 64K.
- Indstil liniebreddefaktor parameter til 0,3 Hz ved at skrive "lb 0.3" i kommandolinjen at anvende en vægtningsfunktion (eksponentiel henfald) med en liniebreddefaktor på 0,3 Hz før Fouriertransformation.
- Udfør Fourier-transformation ved at skrive "EFP" i kommandolinje.
- Udfør Automatisk korrektion fase ved at skrive kommandoen "APK" i kommandolinjen. Hvis justeringer yderligere fase er nødvendige for yderligere at forbedre spektrum, klikke på "Process fanen" og derefter klikke på "Adjust Phase" ikonet og fasekorrektionen ikonerne for nulte orden (0) og første ordens (1) fasekorrektion .
- Mens klikke på korrektionsfaktorerne ikoner nulteordens og første ordens fase, trække musen indtil alle signalerne er i positiv absorption mode. Anvend og gem fase korrektionsværdier ved at klikke på knappen "Return og Gem" for at afslutte fase korrektion tilstand.
- Påfør et polynomium fjerde ordens funktion for basisliniekontroldyr korrektion på en integration ved at skrive kommandoen "abs n".
BEMÆRK: Dette sikrer en flad spektral basislinje med et minimum intensitet. - Rapport kemiske skift i ppm fra TMS (δ = 0). Klik på kalibrering ( "Calib. Axeer ") ikonet, og placere markøren med den røde linje på toppen af TMS-NMR-signalet (peak nærmest 0). Venstre klik og skriv '0'.
- NMR dataanalyse
- Integrere spektralområdet fra δ 1,1 til A 0.6 samt toppe ved δ 4,98, δ 5,05 og δ 5,81 ved hjælp af "integrere" ikon (under fanen "processen") og højdepunktet ( "Define ny region") ikon. Venstre klik og træk gennem integralerne.
BEMÆRK: Hvis der er behov for at fokusere på en region, skal du klikke på ikonet højdepunkt at deaktivere og venstre klik og træk musen for at zoome ind på området. For at justere tærsklen intensitet, bruge den midterste museknap, hvis nødvendigt. Klik på ikonet højdepunkt igen for at gøre integrationen funktionen aktiv, derefter flytte til den næste top.- Normalisér summen af de ovenstående integraler til 100 ved at højreklikke på den integrerede værdi, der visess under signalet, og vælg "Normaliser summen af integraler". Input værdien "100" i feltet og klik på "Return og Gem" for at afslutte integrationen tilstand.
- Når der anvendes BHT som en intern standard, integrere toppen ved δ 6,98 og indstille integralet lig med millimol BHT pr 0,5 ml af stamopløsningen.
- Integrere toppene af interesse (se trin 2.3.1.3.1), der strækker 10 Hz fra hver side af toppen, når det er muligt.
- Videre med at udføre 13C-NMR-spektre erhvervelse og behandling på en lignende måde.
- Integrere spektralområdet fra δ 1,1 til A 0.6 samt toppe ved δ 4,98, δ 5,05 og δ 5,81 ved hjælp af "integrere" ikon (under fanen "processen") og højdepunktet ( "Define ny region") ikon. Venstre klik og træk gennem integralerne.
- Erhvervelse af NMR-data
- 13C-NMR-spektre
- Erhvervelse af NMR-data
- Gå til 13C datasæt og anvende den inverse gated afkoblet pulssekvens, "zgig" ved at skrive "pulprog zgig" i kommandolinjen.
BEMÆRK: For at køre en carbon eksperiment med standard bredbånd decouPLED pulssekvens, typen "pulprog zgpg" i kommandolinjen. - Skrive følgende kommandoer på kommandolinjen at oprette den spektrale bredde i ppm, midt i RF-transmitteren, antallet af scanninger, antallet af dummy scanninger, antallet af datapunkter og impulsvarigheden for en 90 ° puls vinkel : "sw 200", "o1p 95", "ns 16" "ds 2", "td 64K" og "p1 (som bestemt ved puls kalibrering)" (se trin 2.2.1.4).
- Indstil en lempelse forsinkelse på 35 s for 500 MHz-instrument eller 45 s til 850 MHz-instrument ved at skrive "D1 35s" eller "d1 45s" i henholdsvis kommandolinjen. Når der anvendes BHT, bør relaksationsforsinkelse være 50 s i 500 MHz-instrument og 60 s i 850 MHz-instrument.
- Sæt modtageren gevinst (RG) til en passende værdi ved anvendelse af kommandoen "RGA" for automatisk beregning af RG.
- Skrive "digmod baseopt" i kommandolinjen at erhverve et spektrum wi'te forbedret baseline.
- Start købet ved at skrive pulsen-erhverve kommandoen "zg" i kommandolinjen.
- Gå til 13C datasæt og anvende den inverse gated afkoblet pulssekvens, "zgig" ved at skrive "pulprog zgig" i kommandolinjen.
- Behandlingen af NMR-data
- Skriv "si 64K" i kommandolinjen for at anvende nul-påfyldning og indstille størrelsen af den virkelige spektrum til 64K.
- Indstil liniebreddefaktor parameter til 1,0 Hz ved at skrive "lb 1.0" i kommandolinjen at anvende en vægtningsfunktion (eksponentiel henfald) med en liniebreddefaktor 1,0 Hz før Fouriertransformation.
- Udfør Fourier-transformation ved at skrive "EFP" i kommandolinjen.
- Udfør Automatisk korrektion fase ved at skrive kommandoen "APK" i kommandolinjen. Hvis justeringer yderligere fase er nødvendige for yderligere at forbedre spektrum, klikke på "Process fanen" og derefter klikke på "Adjust Phase" ikonet og fasekorrektionen ikonerne for nulte orden (0) og fase (1) korrektion af første orden .
- Påfør et polynomium fjerde ordens funktion for basisliniekontroldyr korrektion på en integration ved at skrive kommandoen "abs n" i kommandolinjen.
- Rapport kemiske skift i ppm fra TMS (δ = 0). Klik på kalibrering ( "Calib. Akse") ikonet, og placere markøren med den røde linje på toppen af NMR-signal, der skal refereres. Venstre klik og skriv "0".
- Erhvervelse af NMR-data
- NMR dataanalyse
- Integrer spektrale område fra δ 175 til A 171 ved hjælp af ikonet "Integrer" (under fanen "processen") og højdepunktet ( "Definer ny region") ikonet. Venstre klik og træk gennem integralerne.
BEMÆRK: Hvis der er behov for at fokusere på en region, skal du klikke på ikonet højdepunkt at deaktivere og venstre klik og træk musen for at zoome ind på området. Klik på ikonet højdepunkt igen for at gøre integrationen funktionen aktiv, derefter flytte til den næste top.- Indstil integreret til 100 ved at gøre et højreklik på den integrerede værdi, der vises under signalet og vælg "Kalibrer Current Integral". Input værdien "100" i feltet og klik på "Return og gem" for at afslutte integrationen tilstand.
- Når der anvendes BHT som en intern standard, integrere toppen ved δ 151,45 og indstille integralet lig medde millimol BHT pr 0,5 ml af stamopløsningen.
- Integrere toppene af interesse strækker 5 Hz fra hver side af toppen (se trin 2.3.2.3.1).
- Integrer spektrale område fra δ 175 til A 171 ved hjælp af ikonet "Integrer" (under fanen "processen") og højdepunktet ( "Definer ny region") ikonet. Venstre klik og træk gennem integralerne.
- 1H-NMR-spektre
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1H og 13C NMR-spektre blev opsamlet til kommercielt tilgængelige fiskeolie supplerer anvendelse af to NMR instrumenter; en 850 MHz og en 500 MHz spektrometer. Disse spektre kan anvendes til kvantitativ bestemmelse af komponenter af fiskeolie, såsom docosahexaensyre (DHA) og eicosapentaensyre (EPA), samt andre forbindelser, såsom n -1 acylkæder og ernæringsmæssigt vigtige indeks såsom n -6 / n -3-forhold. Kvantificeringen kan udføres selv uden anvendelse af en intern standard, men de kvantitative resultater angives som relative molære procenter. Når dataene skal udtrykkes i absolutte værdier (mg / g), er en intern standard, der kræves. De opnåede ved NMR resultater er meget reproducerbar med relative standardafvigelser (RSD) varierer fra 0,3% til 2% for 13C NMR-analyse og fra 0,5% til 2,5% for 1H NMR-analyse, afhængigt af t han lipid. Den lidt højere RSD for 1H NMR observeres ofte fordi proton-spektre har tendens til at være overfyldte, hvilket påvirker nøjagtigheden af analysen, især for resonanser, der har en lavere signal-støjforhold (S / N). Der blev fundet en meget god overensstemmelse mellem 850 MHz og 500 MHz-instrument med RSD i området fra 1% til 4%. Relativt høje RSD (op til 8%) blev observeret ved sammenligning af resultater opnået ved 1H og 13C, navnlig for forbindelser, der vises i lavere koncentrationer såsom n -1 acylkæder. NMR-spektroskopi er tidligere blevet valideret som et redskab til lipid analyse, herunder bestemmelse af nogle fisk oliekomponenter. Resultaterne viste, at det er i god overensstemmelse med traditionelle metoder, såsom GC 17, 18.
1H NMR-analyse
"xfig"> Figur 1 sammenligner 1H-NMR-spektre opnået på (A) en 850 MHz og (B) et 500 MHz instrument. 850 MHz spektrum er karakteriseret ved højere opløsning, men de vigtigste bestanddele af fiskeolie, herunder DHA, EPA, og n -6 / n -3 forholdet kan også bestemmes ud fra den 500 MHz spektrum. De 1H-NMR-signaler af fiskeolie fedtsyrer, som kan anvendes til kvantificering formål er vist i tabel 1, mens findes den fuldstændige NMR overdragelse af 1H-NMR-spektret af fiskeolie andetsteds 19.
1H NMR gav pålidelige data til kvantificering af den samlede mængde af n -3, n -6, DHA, transfedtsyrer, n -1 acylkæder, og mættede fedtsyrer (SFA). For 1H NMR-analyse er anvendelsen af passende forbindelser påkrævet, fordi det meste af signals hører til grupper af protoner der er fælles for forskellige fedtsyrer og lipider. Derfor, i de fleste tilfælde er koncentrationen af fedtsyrer i fiskeolie kan bestemmes kun ved kombination af forskellige 1 H NMR-signaler, inkorporeret i de relevante forhold. Desuden er disse ligninger indeholder aritmetiske koefficienter, normalisere det forskellige antal protoner knyttet til hver gruppe. Når der anvendes en intern standard bør betragtes følgende ligning: C = l / IS × N IS / N × A × MW / m (1), hvor C er koncentrationen af analytten i mg / g fiskeolie, jeg er integralet af en resonans, der er unikt tilskrives lipidet af interesse, jeg IS er arealet af en proton signal, der hører entydigt til den interne standard, N er antallet af protoner i den funktionelle gruppe, der analyseres,N IS er antallet af protoner i den interne standard, der anvendes til analysen, A er de millimol intern standard, MW er molekylvægten af fedtsyren (udtrykt i methylestere), og m er mængden af fiskeolie udtrykt i g.
Eksempel 1, DHA: Andelen af DHA bestemmes af ligningen C DHA = ¾ I DHA / S, hvor jeg DHA er integralet af signalet ved δ 2,39, som tilhører H a- og H p protoner af DHA og S er summen af integralerne for methylprotoner af SFA, n -6, n -9, n -3, transfedtsyrer plus integralerne af toppene for n -1 acyl kæder ved δ 4,98, A 5,05 og δ 5,81. Den integrerede Jeg DHA er normalized ved multiplikation med 3/4 fordi det svarer til fire protoner, hvorimod den integrerede S svarer til tre protoner. 1H NMR er ikke i stand til at give information om stillingsfordelingen af fedtsyrer på glycerolgrundskelettet og kan derfor kun anvendes til kvantificering af den samlede mængde fedtsyrer. 1H NMR-analyse af en indkapslet fiskeolie supplere viste, at den består af 10,5% af DHA. Koncentrationen af DHA i den samme prøve ved anvendelse af BHT blev fundet at være 105,23 mg / g. Disse værdier er meget tæt på de værdier, der opnås med 13C NMR (se eksempel 2 for 13C-analyse).
Eksempel 2, n -1 acylkæder: Koncentrationen af n -1 acylkæder er givet ved forholdet Cn-1 = 3 I n-1 / S, hvor jeg n-1 er integralet af signalet ved δ 5,818. Det hersignal svarer til en proton og således skal normaliseres ved at multiplicere med tre. Når der anvendes BHT, n -1 acylkæder bestemmes ved ligningen Cn-1 = 2 I n-1 / I BHT. Kan resultaterne ikke udtrykkes i mg / g fordi MV af n -1 acylkæder er ukendt.
Eksempel 3, n -6 / n -3-forhold: Denne vigtige indeks kan beregnes ud fra forholdet mellem de normaliserede intensiteter af resonans ved δ 2,77, hvilket svarer til bis-allyliske protoner af n -6 acylkæder (to protoner) over triplet ved δ 0,97, der hører til n -3 fedtsyrer og svarer til tre protoner. Forholdet er Cn-6 / C n-3 = 3/2 I A / I B, hvor I A og I B er integralerne af signalerneved δ 2,77 og δ 0,97 hhv. n -6 fedtsyrer bestemmes ud fra forholdet Cn-6 = 3 / 2I n-6 / S, hvor jeg n-6 er integralet af bis-allylprotoner ved δ 2,77.
Eksempel 4, trans-fedtsyrer: kan transfedtsyrer beregnes fra ligningen C trans = I trans / S, hvor jeg trans er integralet af signalet ved δ 0,91. Den foreliggende prøve indeholdt 3,07% af trans-fedtsyrer, som bestemt ved 1H NMR under anvendelse af 850 MHz-instrument. Den samme prøve analyseret i et 500 MHz instrument viste sig at indeholde 3,03% af transfedtsyrer.
Eksempel 5, mættede fedtsyrer (SFA): Koncentrationen af SFA kan være calculated fra ligningen C SFA = S - Cn-3 - Cn-6 - Cn-9 - Cn-1 - C-trans. n -9 fedtsyrer (hovedsageligt oliesyre) kan kvantificeres ifølge ligningen Cn-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, hvor Q er integralet af de allylprotoner n -6 og n -9 ved δ 2,01. Mængden af SFA i en kommercielt tilgængelig fiskeolie prøve viste sig at være 36,1%. Den samme prøve analyseret med 13C NMR viste sig at indeholde 33,8% SFA. SFA betegner en gruppe af forskellige FA (f.eks stearin- og palmitinsyre) med forskellig molekylvægt og dermed deres koncentration hvis fiskeolie ikke kan udtrykkes i mg / g.
Eksempel 6, i alt steroler: Mængden af totale steroler (frit og esterificeret) kan bestemmes ved signanal af methylprotonerne ved carbon 18, som vises på δ 0,68, under anvendelse af ligningen C = I STE / S. Det molære forhold mellem totale steroler i en kommercielt tilgængelig fiskeolie prøve viste sig at være 0,32%. BHT kan også anvendes til bestemmelse af den absolutte koncentration af steroler. De vigtigste steroler i fiskeolie er cholesterol og vitamin D (eller dens precursor 7-dehydrocholesterol) og tilsættes ofte i kosttilskud. Disse forbindelser har en meget lignende MW. Derfor kan resultaterne udtrykkes i mg / g og beregnes efter ligningen C = 2/3 I STE / I ER A × MW STE / m, hvor MW STE er molekylmassen (386) af kolesterol, som udgør størstedelen af sterolforbindelse fraktion i fiskeolie 20. Mængden af steroler i den samme prøve ved anvendelse af BHT var 3,8 mg / g fiskeolie. Individuel bestemmelse af cholesterol (δ (δ 0,678) er mulig på et 850 MHz-instrument efter anvendelsen af en vinduesfunktion for opløsningsforbedring.
13C NMR-analyse
Figur 2 illustrerer 13C NMR-spektre optaget den (A) en 850 MHz og (B) et 500 MHz instrument i carbonylcarbonatomet område. De to spektre er meget ens, og kan give den samme mængde information. 13C NMR-spektret med held kan anvendes til analyse af yderligere fedtsyrer såsom stearidonsyre (SDA) og eicosatetraensyre (ETA) syrer, er imidlertid flere scanninger kræves for prøver, hvori disse syrer er i lavere koncentrationer. 13C-spektrene er karakteriseret ved høj opløsning på grund af det store spektral bredde og anvendelsen af bredbånd afkobling, someliminerer virkningen af skalar kobling og frembringer singletter. Af denne grund er der begrænset overlapning selv ved anvendelse af et 500 MHz instrument.
13C NMR-spektret er meget mere informativ end den 1H NMR-spektrum og kan give mere omfattende kvantitative data fordi mindre signal overlappende observeres (figur 1 og 2). Den mest nyttige spektrale område af 13C-spektret er carbonylcarbonatomet regionen, fordi det giver kvantitative oplysninger om et stort antal af fedtsyrer samt for deres stillingsfordelingen på glycerol skelet 19, 21, 22. Methylgruppen område fra δ 14,5 til A 13.5 kan anvendes til den hurtige bestemmelse af den samlede mængde af n -3, n -6, n -9 og mættet fedtsyresyrer (SFA), samt transfedtsyrer. Men i 500 MHz NMR-spektrometer, der er en delvis overlapning af n -6 og n -9 mættede fedtsyrer (SFA). Anvendelsen af et vindue funktion for opløsningsforbedring kan løse dette problem, selv om 850 MHz-instrument stadig betragtes som en mere pålidelig løsning. Den olefiniske region af carbon-spektret kan anvendes til den totale mængde af n -3 og n -1 acylkæder samt til bestemmelse af individuelle fedtsyrer, såsom DHA, EPA, Arachidonsyre (AA), linolensyre (Ln) n -3, og oliesyre (OL) (se tabel 2). 13C NMR kan også anvendes til karakterisering af fiskeolie fra andre kilder, såsom kosttilskud rige på ethylestere (EE) under anvendelse carbon signaler ved δ 14,31 (methyl) og δ 60,20 (methylen).
For carbon analyse kan fedtsyrer være determined ved at dividere integralet af de passende alifatiske, olefinisk og carbonyl signaler med den samlede integral af alle acylkæder, ifølge den generelle forhold C = I / S (2), hvor C er koncentrationen af analytten i mol (% ), jeg er integralet af en resonans, der er unikt tilskrives lipidet af interesse, og S er det totale integralet af signal (er), der repræsenterer det totale indhold af prøven lipid. Den samlede integrerende S for acylkæder kan bestemmes ved at integrere regionen fra δ 175 til A 171 og er sat til 100.
Kvantificering af fedtsyrer i mg / g fiskeolie udføres ved anvendelse af en intern standard på grundlag af følgende sammenhæng: C = l / IS × A × MW / m (3), hvor C er koncentrationen af analytten i mg / gaf fiskeolie, jeg er integralet af en resonans, der er unikt tilskrives lipidet af interesse, i er er arealet af en carbon signal, der hører entydigt til den interne standard, A er de millimol intern standard, MW er den molekylære vægt af forbindelsen af interesse (for fedtsyrer udtrykt i methylestere), og m er mængden af fiskeolie i g. De 13 C-NMR signaler af fiskeolie fedtsyrer, som kan anvendes til kvantificering formål er vist i tabel 2, hvorimod findes den fuldstændige NMR overdragelse af 13C NMR-spektret andetsteds 19.
Eksempel 1, EPA ved sn-2-position: Mængden (%) af EPA på sn-2 position beregnes ved at dividere integral af signalet ved δ 172,56 ved S. Mængden af EPA ved sn-2 positionen i en commercially tilgængelig prøve viste sig at være 3,4% ved anvendelse af 850 MHz-instrument. Under anvendelse af samme spektrometer og BHT som en intern standard, mængden af EPA ved sn-2 position udtrykt i mg / g fiskeolie er 29,73 mg / g. Den samme prøve analyseret i et 500 MHz instrument viste sig at indeholde 3,6% eller 31,39 mg / g EPA i sn-2 positionen. Lignende resultater kan opnås, når beregning af de relative molekylære forhold mellem EPA ved sn-2 under anvendelse af en fuldt afkoblet spektrum. Dette skyldes, at carbonylcarbonatomet af EPA påvirkes af protonafkobling til samme ubetydelig grad som de andre carbonylcarbonatomer, som anvendes som reference. Imidlertid er store afvigelser gældende ved brug BHT, fordi carbon BHT ved δ 151,45, som anvendes til kvantificering, modtage en anden NOE forøgelse sammenlignet med carbonylcarbonatomer af fedtsyrer. Derfor bør det fuldt afkoblet spektrum undgås ved brug af interne standarder eller integrere carbons med forskellige multipliciteter.
Eksempel 2, samlede mængde DHA: Den samlede mængde (%) af DHA beregnes simpelthen ved at tilsætte mængderne af DHA i sn -1,3 og sn-2 position som bestemt ved NMR-signaler ved δ 172,48 og δ 172,08 hhv. Den samme prøve analyseret med 1H-NMR (se eksempel 1 af 1H-analyse) viste sig at indeholde 10,3% DHA ifølge 13C NMR-analyse. Mængden af DHA kan også udtrykkes i mg / g ved anvendelse af en intern standard og ligning 3. Det samlede mængde DHA var 103,25 mg / g.
Eksempel 3, samlede SDA: er den samlede mængde (%) af SDA bestemt ved tilsætning af integralerne af signalerne ved δ 172,99 og δ 172,60 som tilhører carbonylcarbonatomer af SDA på position sn -1,3 ogsn-2 henholdsvis derefter dividere summen med S. Den analyserede prøve viste sig at indeholde 3,93% SDA eller 34,54 mg / g.
Eksempel 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) kan bestemmes ved at dividere integral af signalet ved δ 131,85 med integralet S. Molforholdet mellem n -3 Ln i den analyserede prøve fiskeolie var 0,7%. Den absolutte koncentration under anvendelse af BHT blev beregnet som 5,5 mg / g.
Eksempel 5, transfedtsyrer: Det molære forhold af transfedtsyrer bestemmes ved at dividere integralet af signalet ved δ 13,80 med S. Analysen af den samme prøve, der blev analyseret med 1H-NMR og viste sig at være 3,07% trans FA, blev også analyseret med 13C NMR og dens trans-fedtsyrer blev fundet at være 3,42%. Than 13C NMR-analyse af den samme prøve på en 500 MHz-instrument viste et indhold 3,64% af transfedtsyrer. Mængden af trans FA i mmol / g fiskeolie kan bestemmes under anvendelse BHT som en intern standard og ligningen C = I / I IS × A / m, men resultaterne kan ikke udtrykkes i mg / g fordi toppen ved δ 13,80 svarer til forskellige transfedtsyrer, hovedsagelig trans DHA og trans EPA, med forskellige MW.
Eksempel 6, EE: Koncentrationen af EE i en prøve fiskeolie beregnes ved at dividere integralet af den spektrale område fra δ 60.50 til A 60.00, hvilket svarer til methylengrupperne carbonatomer i EE af forskellige fedtsyrer, med S. Analysen af en stikprøve EE fiskeolie viste, at det bestod af 100% EE. Det skal bemærkes, at i EE-prøver, EPA CAn, beregnes enten ved toppen carbonyl ved δ 173,60 eller af methylen EE carbon ved δ 60,20, mens DHA kan beregnes ved hjælp af signalet ved δ 60,31 og / eller signalet ved δ 173,09.
En komplet liste over de diagnostiske signaler, der kan anvendes til kvantificering formål med 13C og 1H NMR-analyse kan findes i tabel 1 og 2, hvorimod der kan findes en detaljeret beskrivelse af de ligninger, der kan anvendes til denne analyse andetsteds 19.
NMR kan yderligere anvendes til vurdering af oxidation status fiskeolie kosttilskud. Figur 3 sammenligner 1H NMR-spektre af en prøve fiskeolie under to oxidationsbetingelser; udsættelse for opvarmning og udsættelse for ultraviolet (UV)lys. Lipidoxidation er en kompliceret proces, og sammensætningen af oxidationsprodukter afhænger af betingelserne for oxidation. De vigtigste oxidationsprodukter er hydroperoxider (A 8,0-8,8), konjugerede diener hydroperoxider (δ 5.4-6.7), og aldehyder (A 9.0- 10).
Figur 1. 1H NMR-analyse. 850,23 (A) og 500,20 MHz (B) 1H-NMR-spektrum af en fiskeolie supplement i CDCl3 opløsning. NMR-signalerne af EPA og DHA, der kan anvendes til deres bestemmelse er vist. Toppen ved δ 0,97, kan anvendes til bestemmelse af den totale mængde af n -3 fedtsyrer. Indhylle ved δ 1,39-1,20 beskæres, da det hører til methylenprotonerne af alle fed kædes og kan ikke anvendes til nogen identificering eller kvantificering formål. 1H NMR-spektret er kendetegnet ved en smallere spektral bredde (SW) sammenlignet med 13C NMR-spektrum og således af lavere spektral opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. 13C NMR-analyse. 213,81 (A) og 125,77 MHz (B) 13C-NMR-spektret af en fiskeolie supplement i CDCl3 opløsning i carbonylcarbonatomet region. NMR-signalerne af EPA og DHA på sn -1,3 og sn-2 position er vist. Disse signaler kan anvendes til kvantitativ bestemmelse af EPA og DHA. Selvom spectra optaget ved 213,81 MHz er kendetegnet ved en højere opløsning og følsomhed, kan den 125,77 MHz spektre også anvendes til bestemmelse af de vigtigste forbindelser. Anvendelsen af afkobling i 13C NMR eksperiment eliminerer virkningen af skalar kobling mellem kulstof og brint kerner og dermed de signaler vises som singletter gør analyse lettere i forhold til 1H-NMR-spektret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fiskeolie oxidation. 1H NMR-spektret af oxideret fiskeolie afhænger af oxidationsbetingelserne. Resonanserne tilskrives hydroperoxider (A 8,0-8,8), conjugated diener hydroperoxider (δ 5.4-6.7), og aldehyder er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
| δ ppm | Proton | Forbindelse |
| 0,677 | CH3 (18) | Kolesterol |
| 0,678 | CH3 (18) | 7-dehydrocholesterol |
| 0,88 | CH2CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz | n -9, SFA acylkæder |
| 0,883 | CH2CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz | n -6 acylkæder |
| 0,911 | CH2CH 3 (t), J ω; 1, ω2 = 7,65 Hz | Trans acylkæder |
| 0,973 | CH2CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63 Hz | n -3 acylkæder |
| 1,25 | CH2CH 3 (t), J = 7,20 Hz | ethylestere |
| 1,697 | OCOCH2CH 2 (t), JH α, Η β = Hz | EPA acylkæde |
| 2,391 | OCOCH 2 CH2 (t) | DHA acylkæde |
| 2,772 | CH = CHCH2 CH = CH | n -6 acylkæder |
| 2,81 | CH = CHCH2 CH = CH | n -3 acylkæder |
| 3,593 | 3'a-CH2OCO | Glycerol af 1-MAG |
| 3,722 | 3'a, 3217; b-CH2OCO (br) | Glycerol på 1,2-DAG |
| 4,073 | 2'-CHOH (br) | Glycerol på 1,3-DAG |
| 4,121 | CH2CH 3 multiplet | ethylestere |
| 4,173 | 1'b, 3'b-CH2OCO (dd) | Glycerol på 1,3-DAG |
| 4,238 | 1'a-CH2OCO (dd) | Glycerol på 1,2-DAG |
| 4,329 | 1'b-CH2OCO (dd) | Glycerol på 1,2-DAG |
| 4,989 | CH = CH2 cis (dd) | n -1 acylkæder |
| 5,052 | CH = CH2 trans (dd) | n -1 acylkæder |
| 5,082 | 2'-CHOCO | Glycerol på 1,2-DAG |
| 5,268 | 2'; -CHOCO | Glycerol af TAG |
| 5,436 | CH = CHCH2 = CH2 | n -1 acylkæder |
| 5,818 | CH = CH2 | n -1 acylkæder |
Tabel 1: Tildelingen af 1H-NMR-spektrum. Det 1 H-NMR kemiske forskydninger af fiskeolie fedtsyreestere signaler, der kan anvendes til kvantificering formål i CDCl3 opløsning præsenteres. De kemiske skift er målt i ppm og give oplysninger om det kemiske miljø af kernerne.
| δ ppm | Kulstof |
| 173,24 | C1 SFA (sn -1,3) |
| 172,21 | C1 OL LO (sn -1,3) |
| C1 ETA (sn -1,3) | |
| 173,13 | C1 DPA (sn -1,3) |
| 173,03 | C1 SDA (sn -1,3) |
| 172,97 | C1 EPA (sn -1,3) |
| 172,73 | C1 ETA (sn-2) |
| 172,69 | C1 DPA (sn-2) |
| 172,61 | C1 SDA (sn-2) |
| 172,56 | C1 EPA (sn-2) |
| 172,48 | C1 DHA (sn -1,3) |
| 172,08 | C1 DHA (sn-2) |
| 136,8 | Cω1, n -1 |
| 131,85 | Cω3 LN |
| 130,37 | C15 AA |
| 130,11 | C9 LN |
| 130,06 | C13 LO |
| 129,54 | C5 DHA sn-2 |
| 129,47 | C5 DHA sn -1,3 |
| 128,94 | C5 EPA |
| 128,76 | C6 EPA |
| 128,45 | C17 n -3 |
| 127,71 | n -3 |
| 127,53 | C4 DHA sn-2 |
| 127,5 | C4 DHA sn -1,3 |
| 126,86 | Cω4, alle n -3 |
| 114,71 | Cω2, n -1 |
| 60,08 | DHA, Ethylestere |
| 59.96 | EPA, Ethylestere |
| 59,95-59,85 | Andre FA, Ethylestere |
| 33.48 | C2 EPA sn-2 |
| 33.32 | C2 EPA sn -1,3 |
| 31,44 | C3 n -1 |
| 27.05 | Allylisk n -6 |
| 26.49 | C4 EPA sn -1,3 |
| 26.47 | C4 EPA sn-2 |
| 24,6 | C3 EPA |
| 24,48 | C3 SDA sn -1,3 |
| 24,44 | C3 SDA sn-2 |
| 14.27 | Cω1, alle n -3 |
| 14.13 | Cω1, SFA |
| 14.11 | Cω1, OL |
| 14.07 | Cω1, LO |
| 13.8 | Cω1, trans FA |
Tabel 2: Tildelingen af 13C NMR-spektret. De 13 C-NMR-kemiske skift af fiskeolie fedtsyreestere signaler, der kan anvendes til kvantificering purpOSE'er, CDCl3 opløsning præsenteres.
Supplerende Figur S1: Sammenligning mellem 13C NMR-spektrene optaget ved anvendelse af standard bredbånd afkobling (A) og den inverse gated afkobling (B) pulssekvenser. De spektre blev registreret for den samme prøve med det samme antal scanninger, forarbejdes med de samme procesparametre og er vist med samme skaleringsfaktor. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændringer og strategier for fejlfinding
Spektral kvalitet. Liniebredden af NMR-signalet og dermed løsningen af NMR-spektret er meget afhængig af mellemlæg, som er en proces til optimering af homogeniteten af det magnetiske felt. Til rutineanalyse, 1D afstandsstykker er passende og en 3D afstandsstykker er ikke påkrævet, da den udføres ved NMR personale på regelmæssig basis. Hvis dette ikke er tilfældet, skal en 3D afstandsstykker udføres før analyse ved anvendelse af en prøve indeholdende 0,6 ml H2O: D2O (90:10). At opnå en bedre og hurtigere blokeringsringen, skal være centreret i excitation / detekteringsområdet af radiofrekvens (RF) spole, under anvendelse det graduerede dybdemåler, før den placeres i magnet boring den prøven. En anden faktor, der påvirker afstandsstykker er spinning prøven ved en rotationshastighed på 10-20 Hz. Selvom spinding prøven ved denne rotationshastighed forbedrer de radiale afstandsstykker (X, Y, XY, XZ, YZ, X2-Y2, etc.), er det generelt ikke anbefales for at undgå forekomsten af spinning sidebånd af den første eller højere orden. Men når der arbejdes på instrumenter, der opererer i Larmor frekvenser under 400 MHz, anbefales til 1D NMR-eksperimenter, spinning.
Beslutning, samt følsomhed, påvirkes af modtagerforstærkningen (rg) værdi. Lave værdier af modtagerforstærkningen reducere følsomheden, mens værdier højere end passende årsag overløb af analog-til-digital-konverter (ADC). ADC overflow resulterer i asymmetrisk linje-former og de signaler kan ikke anvendes til kvantitative formål, fordi de første punkter i fri induktion forfald (FID) kan gå tabt. I de fleste tilfælde kommandoen "RGA" beregner en passende rg værdi. Men i nogle tilfælde rg beregnes af softwaren er højere end den ideelle værdi, og der er en forvrængning i Lorentzian formen af NMR-signalet. Iet sådant tilfælde skal brugeren manuelt input en mindre rg værdi ved at skrive "rg (værdi)" i kommandolinjen. En typisk RG værdi for de prøver, der analyseres med denne protokol er 8.
Ofte, når der anvendes kryogent afkølet NMR prober med en høj kvalitet-faktor (Q-faktor), en stor forsinkelse (dødtid)> 200us mellem den sidste impuls og påvisning periode er nødvendig for at undgå artefakter, såsom en pukkel omkring transmitterens frekvens og en rullende i spektret baseline. Men sådan en lang forsinkelse forårsager en stor negativ førsteordens fasefejl, som også kan indføre en baseline rullende og store dips omkring bunden af de stærke signaler,. I disse tilfælde kan en z-restaureret spin-ekko pulssekvens anvendes til fremstilling af NMR-spektre med væsentligt forbedrede basislinjer, selv om der kan forekomme en lille reduktion følsomhed 23.
Fosfolipider. Ud over analysen af fiskeolieprøver rige på triglycerider og ethylestere kan NMR anvendes til analyse af fiskeolie prøver rige på phospholipider (PL'er). Imidlertid særlig omhu, der kræves for sådanne prøver, fordi PLS danner aggregater, som kan forårsage en signifikant reduktion i den spektrale opløsning og følsomhed. Til analysen af disse prøver, en opløsningsmiddelblanding af deutereret chloroform: methanol (CDCl3: CD3OD) i et forhold på 70:30 er nødvendige for at opnå spektre af høj kvalitet.
Intern standard. BHT blev valgt som en intern standard i denne undersøgelse, fordi det er en meget symmetrisk molekyle med enkle 1H og 13C NMR spektre og ingen af dens toppe overlapper de fisk oliebestanddele. BHT har et signal i 1H-NMR-spektrum, der vises som et singlet ved δ 6,97 og hører til de to ækvivalente, aromatiske protoner (para - stilling med hensyn til OH-gruppen) og et signal vedδ 151,45 i 13C NMR-spektrum, der hører til den aromatiske kvaternære carbonatom, der bærer -OH-gruppen. Begge disse signaler har ingen overlapning med nogen af bestanddelene i fiskeolie, og kan således anvendes til kvantificering formål. Andre forbindelser, såsom 1,2,4,5-tetrachlor-3-nitrobenzen (TCNB) eller ethylenchlorid kan også anvendes som alternative interne standarder, men de er kendetegnet ved længere T 1-værdier.
Begrænsninger af Teknik
Kvantificeringen af forskellige fedtsyrer og lipider i fiskeolie kosttilskud opnås ved integration af de passende diagnostiske NMR-signaler i 1D-spektre. Sådanne signaler bør tilhøre kun til en bestemt prøve komponent og må ikke have nogen interferens med signaler fra andre forbindelser. Dette kan være et problem for 1H NMR-analyse, eftersom 1H NMR-spektrum er karakteriseret ved lav opløsning på grund af den korte rækkevidde cheMical forskydninger. Hertil kommer, at tilstedeværelsen af skalar kobling (J) fremstiller multipletter og gør analysen mere kompliceret. For eksempel kan ethylestere (EE) kvantificeres under anvendelse af 1H-NMR af den karakteristiske triplet (J = 7,20 Hz) af methylgruppen ved δ 1,25 og multiplet ved δ 4,12, som tilhører methylenprotonerne af estergruppen. Men ved brug NMR instrumenter opererer i Larmor frekvenser under 850 MHz, bør undgås analysen af EE anvendelse af1H NMR grund af den delvise overlapning af toppen ved δ 4,12 med toppen ved δ 4,14 af TG'er og overlapning af signalet ved δ 1,25 med bredt signal af de alifatiske methylenprotoner ved δ 1,23-1,35. Store afvigelser blev også observeret mellem 1 H og 13C analyse af EPA i nogle prøver, 13C NMR var tættere på det mærkede præparat billede af than producenten. Dette er sandsynligvis som følge af overlapningen af signalet ved δ 1,69, som anvendes til EPA analyse, med signaler fra andre forbindelser, der vises i nogle typer af fiskeolie kosttilskud. Yderligere fejl i kvantificeringer kan opstå, når der anvendes en intern standard på grund af den usikre renhed for den interne standard og fra fejl i vejning.
Den sammensætningsanalyse kan udtrykkes i relative molære koncentrationer uden brug af en intern standard. Hvis resultaterne skal udtrykkes i absolutte koncentrationer, fx som milligram fedtsyre pr gram olie (mg / g), kræves anvendelse af en intern standard. Men i tilfælde, hvor NMR-signalet af interesse tilhører flere forbindelser med forskellige molekylvægte, kan resultaterne ikke udtrykkes som mg / g, selv når der anvendes en intern standard. Hertil kommer, at anvendelsen af interne standard sædvanligvis forøger længden af analysen, fordi den mest almindelige indre s tandards, såsom BHT, er små molekyler med høj molekylvægt symmetri, hvilket resulterer i lange relaxationstider. Da gentagelse tid (forsinkelse mellem pulser + erhvervelse tid) indstilles i henhold til den længste relaksationstid T1 i prøven, vil brugen af en intern standard øge varigheden af forsøgene som længere forsinkelser mellem impulserne er nødvendige. Dette er en særlig vigtig faktor for 13C NMR-analyse på grund af den usædvanligt lange T1 relaksationstiden af kulstof kerner. Tilsætningen af en paramagnetisk forbindelse såsom Cr (acac) 3 kan effektivt reducere T 1 relaksationstiden. Den anbefalede koncentration af Cr (acac) 3 er 0,75 mg / ml opløsning. Højere koncentrationer af Cr (acac) 3 kan overvejes til yderligere reduktion af T 1, dog skal der udvises forsigtighed for at undgå fald i S / N på grund af linieudvidelse.
ntent "> Selvom 13C NMR er karakteriseret ved en meget højere spektral opløsning i forhold til 1H, følsomheden af 13C NMR eksperiment er betydeligt lavere på grund af den naturligt lave forekomst (1,1%) og det lave gyromagnetiske forhold (67,26 10 6 rad s -1 T -1) af 13-kerner. Desuden er de lange T 1 relaksationstider af 13C øge længden af analysen. Dette kan være et problem, når den disponible olie til analyse er begrænset, fordi en forøget antal scanninger bør anvendes til at opnå en rimelig signal-støjforhold.Begrænsninger i følsomhed og beslutningen af NMR-spektre forhindre analyse af mange mindre forbindelser i fiskeolie, der kan analyseres med andre teknikker, såsom GC. For eksempel 1 Η NMR er i stand til at adskille individuelle steroler eller fedtsyrer (f.eks palmitinsyre og stearinsyre), mens 13Cer ikke i stand til at bestemme forbindelser, der vises i meget lav koncentration i fiskeolie såsom dodecansyre og myristinsyre, der overlapper med signalerne fra alle mættede fedtsyrer i δ 173,24 og δ 172,82. Skønt forøgelse af mængden af prøve, der analyseres gør analysen af nogle mindre forbindelser gennemførlige, skal der udvises forsigtighed for meget koncentrerede prøver, på grund af deres forøgede viskositet. Meget viskose opløsninger indeholdende mere end 150 mg olie bør undgås, fordi der er et fald i S / N skyldes den linieudvidelse forårsaget af de reducerede spin-spin T 2 relaksationstider. Desuden er længere forsinkelser mellem impulserne nødvendig på grund af den længere T1 og der er flere spørgsmål i mellemlæg og dermed i opløsning.
Alle de analyserede i fiskeolie med NMR forbindelser kan kvantificeres samtidigt i en snapshot uden brug af separationstrin eller rensning. NMR-enANALYSE er hurtig som 1H-spektret kan registreres i mindre end et minut, mens overtagelsen 13C NMR varer 10 min. Det skal dog bemærkes, at der er et par faktorer, der påvirker datafangst tid. Specifikt for 13C NMR, 10 min driftstid kan kun opnås uden anvendelse af interne standarder, og med anvendelse af kryogent afkølede prober, hvori RF-spolen og forforstærkeren der afkøles og dermed den termiske støj minimeres. Der kan forventes 10-15 gange stigning i den eksperimentelle tid for 13C NMR-analyse, når der anvendes stuetemperatur (konventionelle) prober.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
NMR-spektroskopi viste sig at være et effektivt værktøj til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af sammensætningen af fiskeolie kosttilskud, og på grund af sin hurtighed det har potentiale til at blive anvendt til screening med højt gennemløb af et stort nu mber af fiskeolie prøver. NMR-spektroskopi er per definition en kvantitativ metode, da signalet område er direkte proportional med antallet af kerner, der forårsager signalet. Mens akut giftige kemikalier skal udarbejde NMR prøver, denne metode er miljøvenlig, fordi der anvendes sådanne små mængder af denne kemikalier (f.eks CDCI3) i modsætning til andre metoder, der kræver store mængder opløsningsmiddel for at eluere prøver. Desuden NMR har flere fordele i forhold til andre analysemetoder. Ingen kalibrering med standarder er påkrævet forud analysen, og en minimal prøveforberedelse uden trin separations- og oprensningsteknikker er normalt vedtaget, hvilket gør NMR en meget hurtig analytisk redskab. Derudover 13C NMR er den bedst mulige metodologi til bestemmelse af positionelle distribution af forskellige fedtsyrer på glycerol skelet. Mens den enzymatiske hydrolyse er blevet anvendt som et alternativ er ikke altid pålidelige= "xref"> 24. Dette er af særlig betydning, fordi der er en betydelig interesse i at studere regiospecificiteten af forskellige fedtsyrer i fødevarer, som det er blevet konstateret, at dette påvirker deres funktion i den menneskelige kost 25, 26.
fremtidige applikationer
På trods af den aftale mellem NMR-analyse og produkternes etiket, samt det faktum, at der er nogle undersøgelser, der viser aftale mellem GC og NMR, mener vi, at mere stringent og omfattende inden for laboratorieundersøgelser forpligtet til at undersøge aftalen mellem NMR og traditionel metodologier til analyse af fisk oliebestanddele anvender et større antal prøver, fiskeolie af forskellig oprindelse, og certificerede standardopløsninger.
En anden vigtig fremtidige anvendelse af NMR i fiskeolie analyse vil være bestemmelse af oxidationsprodukter. Ud over bestemmelsenaf de store forbindelser i fiskeolie, flere primære og sekundære oxidationsprodukter i fiskeolie, såsom aldehyder og peroxider, er til stede. 1H NMR potentielt kan anvendes til vurdering af oxidation status i fiskeolie kosttilskud, under forskellige oxidationsbetingelser, som vist i figur 3. Den største udfordring i denne analyse vil blive NMR opgave og at identificere individuelle oxidationsprodukter. Fremskridt i følsomhed af NMR-hardware vil også tillade at identificere individuelle steroler ved anvendelse af 13C NMR. NMR-spektroskopi kan også anvendes til analyse af fiskevæv som helhed selv uden ekstraktion ved hjælp af High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR.
Kritiske trin i protokollen
To af de mest kritiske trin, som påvirker nøjagtigheden af kvantitative NMR-spektre involverer udvælgelsen af en 90 ° puls og anvendelse af en forsinkelse mellem puLSES ≥ 5 x T 1. Pulsen vinkel er proportional med impulsbredde, som er en kalibreret NMR parameter, der afhænger af instrumentering og prøven. En 90 ° puls er afgørende for fuldstændig omdannelse af langsgående (z) magnetisering til den observerbare tværgående (xy) magnetisering. Det er vigtigt at bemærke, at før puls kalibrering NMR probet behov, der skal veltilpasset og matches. Dette vil optimere overførslen af RF-effekten til prøven, og dermed maksimere S / N og sikre en effektiv afkobling. Sonden tuning er mest påvirket af den dielektriske konstant for prøven, så hvis der er forskelle i koncentrationen mellem prøver, gentages tuning fremgangsmåde til hver enkelt. 1D 13C NMR eksperiment involverer både 13C og 1H kanaler så automatisk indstilling og matchning er nødvendig for begge kerner.
En forsinkelse mellem impulser længere end 5 x T 1 sikrer fuldstændig recovery af nettet magnetisering til startværdien. Hvis alle resonanser i spektret ikke fuldstændigt har lempet før hver impuls, bliver signalet delvist undertrykt og dette fører til unøjagtigheder i integrationen. T1 værdi er en kritisk faktor, der påvirker længden af eksperimentet og det afhænger af den magnetiske feltstyrke samt viskositeten af prøven. Eftersom viskositeten mellem prøverne er ens, bør bestemmes T1 relaksationstider for hvert instrument kun i begyndelsen af analysen session.
Et andet vigtigt træk ved fiskeolien analyse med 13C NMR er udvælgelsen af den passende pulssekvens. Den mest pålidelige metode til kvantitativ 13C analyse er den inverse gated afkobling eksperiment, hvor bredbånd protonafkobling benyttes kun under erhvervelse periode, og der er således ingen polarisering overførsel fra 1H til 13C via den nukleare Overhauser effekt (NOE). Selv kan anvendes fuldt afkoblet NMR-eksperiment, for kvantitative formål, skal der udvises forsigtighed ved brug af dette eksperiment, fordi der er forskellige NOE-faktorer blandt carbonatomer med forskellige multipliciteter og derfor integreret sammenligning mellem methyl-, methylen, methan og carbonylcarbonatomer skal undgås. På trods af dette, hvor der kun carbonatomer af lignende multiplicitet og kemiske miljø betragtes i analysen, den fuldt afkoblet metode er pålidelig. Et eksempel på dette er carbonylcarbonatomer af fedtsyrer, som har vist sig at have nogen signifikante forskelle i NOE faktorer efter afkobling 27. Endvidere for carbonatomer bærer protoner, den fuldt afkoblet eksperiment tilvejebringer højere følsomhed på grund af de NOE bidrag om NMR-signalintensiteten. En sammenligning mellem spektre optaget med de to pulssekvenser er vist i figur S1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fødevarer til sundhed Discovery tema på Ohio State University og Department of Food Science and Technology på The Ohio State University. Forfatterne vil gerne takke NMR-facilitet på The Ohio State University og NMR-facilitet på Penn State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avance III 850 NMR instrument | Bruker | ||
| Avance III 500 NMR instrument | Bruker | ||
| TCI 5 mm probe | Bruker | Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N) | |
| BBO prodigy 5 mm probe | Bruker | Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P) | |
| Spinner turbin | Bruker | NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place | |
| Topspin 3.5 | Bruker | ||
| deuterated chloroform | Sigma-Aldrich | 865-49-6 | 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS |
| 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol | Sigma-Aldrich | 128-37-0 | purity >99% |
| Fish oil samples | |||
| NMR tubes | New Era | NE-RG5-7 | 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube |
| BSMS | Bruker | Bruker Systems Management System; control system device |
References
- Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
- Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
- Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
- Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
- Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
- Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
- Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
- Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
- Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
- Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
- Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
- Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
- Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
- Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
- Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
- Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
- Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
- Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
- Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
- Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
- Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
- Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
- Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
- Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
- Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
- Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).
