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Chemistry

생선 기름 보충제의 지질 프로필의 신속한 평가를위한 강력한 도구로 NMR 분광학

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55547
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, 2Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

Summary

여기서, 고해상도 1 H, 13 C 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 캡슐화 어유 보충제의 정성 및 정량 분석을위한 신속하고 신뢰할 수있는 도구로서 사용되었다.

Abstract

서쪽 다이어트 때문에 생선 기름 보충제의 섭취가 이러한 필수 영양소의 섭취를 증가하는 것이 좋습니다, n은 -3 지방산에 좋지 않습니다. 이 연구의 목적은 고해상도 1 H NMR 및 두 개의 다른기구를 이용하여 13 C NMR 스펙트럼을 사용하여 캡슐화 어유 보충제의 정성 및 정량 분석을 설명한다; 500 MHz와 850 MHz의 악기. 양자 모두 (1 H)와 탄소 (C 13) NMR 스펙트럼 어유 보충제의 주요 성분의 정량에 이용 될 수있다. 어유 보충제의 지질 정량 관련 1D 스펙트럼에서 해당 NMR 신호의 통합을 통해 달성된다. 1 H, 13 C NMR에 의해 얻어진 결과는 두 핵 두 기기 사이의 해상도와 감도의 차이에도 불구하고, 서로 잘 일치한다. 1 H NMR 쿠폰스펙트럼 1 시간 10 분간 지속에서 13 개 C NMR 분석 달리 1 분 미만에 기록 될 수있는 SA보다 신속한 분석은, 13 C NMR 비교. 13 C NMR 스펙트럼은, 그러나, 더 유익하다. 그것은 개인 지방산의 더 많은 양이 많은 데이터를 제공 할 수 있고, 글리세린 골격에 지방산의 위치 분포를 결정하기 위해 사용될 수있다. 두 핵은 정제 또는 분리 단계의 필요없이 하나의 실험에 정량적 인 정보를 제공 할 수 있습니다. 자기장의 세기가 거의 인해 13 C NMR에 대하여 그 하부 해상도로 1 H의 NMR 스펙트럼에 영향을 미치는, 그러나, 더 낮은 비용 NMR 장비 효율적 식품 산업 및 품질 관리 연구소에 의한 표준 방식으로 적용될 수있다.

Introduction

다이어트 N -3 지방산의 섭취는 심장 질환 1, 2, 3, 4 및 염증 질환, 당뇨병 (5)와 같은 여러 조건에 대해 유익한 것으로 입증되었다. 서양 다이어트를 n -3 지방산 가난한 간주되며, 따라서 생선 기름 보충제의 소비가 N을 개선하는 것이 좋습니다 10-6 / N -3 소비자의 영양 1 균형. 생선 오일 보충 소비 최근의 증가에도 불구하고, 질문이 일부 제품의 안전성, 신뢰성 및 품질에 대해 남아있다. 생선 기름 보충제의 신속하고 정확한 성분 분석이 제대로이 상용 제품의 품질을 평가하고 소비자의 안전을 보장하기 위해 필수적이다.

생선 오일 보충의 평가를위한 가장 일반적인 방법S는 가스 크로마토 그래피 (GC) 및 적외선 분광법 (IR)이다. 이들은 매우 민감한 방법이지만, 그들은 몇 가지 단점 6에서 고통 받고 있습니다. GC 분석은 개개의 화합물의 분리 및 유도체 7 요구되며 지질 산화가 분석 8,9 중에 발생할 수 있기 때문에 시간 소모적 (4-8 시간)이다. IR 분광법은 정량적 일 수 있지만, 예측 모델은 IR 대역은 단일 화합물 (10)에 기인 할 수있는 예외가 있지만, 부분 최소 제곱 회귀 (PLSR)를 이용하여 구성 될 필요가있다. PLSR는 분석 11 시간을 증가 샘플들의 다수의 분석을 요구한다. 이러한 이유로, 생선 기름 샘플의 많은 수의 정확하고 빠른 분석을 수 있도록 새로운 분석 방법의 개발에 대한 관심이 높아지고있다. 같은 작정으로 조직건강 (NIH)과 식품의 약국 (FDA)의 국립 연구소에서 천연 보조제 (ODS)의 CE는 이러한 새로운 방법 (12), (13)을 개발하기 위해 공식 분석 화학자 협회 (AOAC)와 협력했다.

스크리닝 및 영양 보조제와 같은 다 성분 행렬의 평가를위한 가장 유망한 분석 방법 중 하나는, 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼 (14) (15)이다. NMR 스펙트럼은 몇 가지 장점을 갖는다 : 그것은 비파괴 양적 기술은, 그것이없는 샘플 준비에 필요 최소한이며, 우수한 정확도 및 재현성을 특징으로한다. 이 용매의 소량을 사용하기 때문에 또한, NMR 분광법은 환경 친화적 인 방법입니다. NMR 분광법의 주요 단점은 다른 analyti에 비해 상대적으로 낮은 감도CAL 방법은, 그러나, 강력한 자기장, 다양한 직경의 극저온 프로브 향상된 데이터 처리하고 다양한 펄스 시퀀스와 같은 기술 장비의 최근 기술의 발전은 나노 미터 범위까지 감도가 증가하고있다. NMR 계측은 높은 비용이지만, NMR 분광계의 긴 수명 및 NMR의 많은 응용 프로그램이 장기적으로 분석의 비용을 절감. 상세한 영상 프로토콜 필드에 새로운 실무자 1 H 및 어유 보충제 13 개 C NMR 분광 분석과 관련된 함정을 방지하기위한 것이다.

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Protocol

1. NMR 샘플 제조

참고 :주의, 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하시기 바랍니다. 샘플 제조에 사용되는 중수 소화 클로로포름 (CDCl3 중)의 독성이다. 흄 후드 및 개인 보호 장비의 사용을 포함 샘플 준비를 수행 할 때 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오 (보안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관).

  1. 1 H, 13 개 C 샘플의 제조
    1. 주사기를 사용하여 캡슐로부터식이 어유 120 μL (~ 110 mg)을 추출하고, 4 mL 유리 바이알에 배치. 생선 기름의 무게를 기록한다.
    2. 샘플 용해
      1. 1 H, 13 개 C의 화학적 이동에 대한 기준으로서 사용되는 테트라 메틸 실란 (TMS) 0.01 %를 함유하는 CDCl3 중 500 μL 생선 기름 약 120 μL 녹인다.
        참고 : TMS가 사용하는 것입니다화학 시프트 만 교정 (스텝 번호 2.2.1.2.7 및 2.2.2.2.7 참조) D, 목적하지 부량 (단계 번호 2.2.1.3 및 2.2.2.3 참조).
      2. 정량 ㎎을 표현하는 경우, 2,6- 디 - 부틸 -4- 메틸 페놀을 제조 (BHT) 원액 / g는 ((CR을 BHT 약 220 mg의 크롬 (III) 아세틸 아세토 네이트 15 mg을 용해시킴으로써, 요구되는 ACAC) 3) 0.01 % TMS 함유 CDCl3 중의 20 ㎖이다. 생선 기름의 100 mg의 (± 10 mg)을 용해 원액 500 μL를 사용합니다.
    3. 오일 (몇 초 정도)에 용해 후, 직접 고품질 5 mm의 NMR 튜브에 상기 용액을 모두 전송하고 캡을 부착. 샘플 제조 후 24 시간 이내에 샘플을 분석한다.

2. NMR 장비 준비

참고 :주의, NMR 장비에 의해 생성 된 강한 자기장의 존재는 의료 기기 및 IMPL에 영향을 미칠 수 있음을 조심맥박 조정기 수술 보철,뿐만 아니라 신용 카드, 시계 등의 분석이 비 차폐 자석을 사용하여 수행 할 때 추가로주의가 필요합니다 같은 전자 항목으로 개미. 두 NMR 기기 1 H, 13 C NMR 스펙트럼의 취득에 사용 하였다; 삼중 공명 헬륨 냉각 역 (TCI) 5mm 프로브 및 500.20 MHz의 1 H, 13 C에 대한 125.77 MHz로 동작하는 분석기를 구비 850.23 MHz 및 각각 1 H, 13 개 C 핵에 대한 213.81 MHz에서 작동하는 분광계 핵은 각각 관찰 광대역 장착 (BBO) 5mm 프로브 질소 냉각시켰다. 모든 실험은 25 ± 0.1 ºC에서 수행하고, 스펙트럼 표준 NMR 분석 데이터 수집 및 처리 소프트웨어 패키지에 의해 처리 된 (자재 목록 참조).

  1. NMR의 스펙트럼을 획득하기위한 준비
    주 : 1 H, 13 C NMR 스펙트럼악기에서 샘플을 제거하지 않고 결과적으로 얻을 수있다.
    1. 스피너 터빈에 NMR 튜브를 삽입 (재료 목록 참조).
    2. 회 전자 및 그레이드 깊이 게이지의 상부에 관을 삽입하고 그 하부는 게이지의 바닥에 닿을 때까지 조심스럽게 튜브의 상부를 누른다.
    3. SampleCase의 개방하다고 NMR 샘플을 놓는다. 샘플이 배치되는 슬롯 번호를 참고.
    4. NMR의에서 샘플을로드하려면 #이 샘플을 들고 SampleCase의 슬롯 인 제어 컴퓨터 입력 'SX #'로 돌아갑니다.
    5. 잠금 윈도우 화면에 표시을 CDCl3의 중수소 신호를 기다립니다. 자동 입력 "lockdisp"를 표시하지 않습니다. 즉시 중수소 신호가 보이는 바와 같이, 입력 명령 행의 "잠금"및 CDCl3 중 중수소 공진을 이용하여 시료를 고정하기 용매의 목록에서 "CDCl3 중"을 선택한다.
      참고 : 중수소의이전에 사용자가 다른 용매를 사용한 경우 ignal 나타나지 않을 수있다. 사용자는 샘플 다운 지표 대기해야하고 잠급니다.
    6. 회전을 보장하기 위해 명령 줄을 입력 "bsmsdisp"는 활성화되지 않습니다. 은 "SPIN"버튼이 녹색이면 회전을 비활성화를 클릭합니다.
    7. 새로운 데이터 세트를 생성하기 위해 "새로운"명령을 입력합니다. "이름"탭과 "EXPNO"탭에서 실험 수의 데이터 세트의 이름을 입력합니다. 은 "PROCNO"탭에 숫자 "1"을 사용합니다. '실험'탭에서 충돌 "을 선택"과 "PROTON"매개 변수 파일을 선택합니다. 은 "TITLE"탭에서 실험의 제목을 작성합니다. "OK"를 클릭하십시오.
    8. 현재 NMR 프로브와 용매의 표준 파라미터를 획득하기 위해 상기 명령 라인에서 "getprosol"를 입력.
    9. 1 차원 C 13 g 역행렬은 "실험"탭에서 "C13IG"펄스 시퀀스를 선택 C 13 단계를 반복 2.1.7,ated에 실험을 분리.
    10. 현재 NMR 프로브와 용매의 표준 파라미터를 획득하기 위해 상기 명령 라인에서 "getprosol"를 입력.
    11. 모두 탄소와 수소 이온 핵에 대한 자동 튜닝 및 프로브의 매칭을 수행 할 명령 "ATMA"를 입력합니다.
    12. NMR의 신호들에 대해 매우 균일 한 자기장을 달성 shimming 일차원 구배, 따라서 최적의 광고 형상을 수행한다.
      1. 단순히 순차적으로 실행하여, 1 차원 shimming에 대한 표준 자동 절차를 사용하여 명령 "한때 topshim 1dfast SS", "숨어 topshim tuneb의 SS,"명령 줄에서 "한때 topshim 보고서".
  2. 매개 변수 최적화
    1. 90 ° 펄스 보정
      1. 1 H (단계 2.1.7 및 2.1.8 참조)를위한 새로운 데이터 세트를 생성한다.
      2. 90 ° PUL을 교정하기위한 자동화 프로그램을 시작하려면 명령 줄에서 명령 "paropt"를 입력그 자체. 변경 될 수있는 매개 변수로 선택 펄스 지속 시간, P1,.
      3. "2"및 μs의 단위를 "16"실험을 수행 입력 (P1)의 초기 값으로 "2"로 시작 μS.
      4. 13 C를위한 새로운 데이터 세트를 생성한다 (단계 2.1.9 참조), C (13 개)의 핵 (단계 2.2.1.2 및 2.2.1.3 참조)에 대한 프로세스를 반복한다.
    2. 1 시간 동안 널 방법 (16)에 의해 측정 한 측정 T
      주 : 널있어서 z 축과 관측 횡단 자화를 생성하는 최종 90 ° 펄스 따라 완화 할 수 있도록, 지연 (타우)이 180 ° 펄스에 후속 구성된 반전 복구 펄스 시퀀스를 이용한다.
      1. 1 H (단계 2.1.7 및 2.1.8 참조)를위한 새로운 데이터 세트를 생성한다.
      2. 반전 복구 실험 펄스 순서를 변경하려면 "pulprog의 t1ir1d"를 입력합니다.
      3. 령 어에서 다음 명령을 입력D 라인 PPM의 스펙트럼 폭은 RF 송신기의 중심 스캔 더미 스캔의 수와 데이터 요소 "SW 8"의 숫자 "o1p 3.8", "NS 2", "DS의 개수를 설정하는 2 "와"TD의 64K ".
      4. 유형 "P1 (값)"펄스 보정에 의해 결정된 90 ° 펄스 지속 시간 값을 입력한다 (단계 2.2.1 참조), (180 ° 펄스 "P2 (값)의"180에 대한 시간 값을 입력 펄스는 두 곱한 90 ° 펄스 지속 시간)이다.
      5. "D1 10"을 입력하면, 매우 큰 값을 예컨대 10 초를 재순환 지연 시간을 설정한다.
      6. 커맨드 라인에 "10ms의 D7"을 입력하여, 짧은 값 등을 MS (10) 타우를 설정한다.
      7. RG 자동 계산을위한 명령 'RGA "를 사용하여 적절한 값으로 상기 수신기의 이득 (RG)를 설정한다.
      8. 명령 "ZG"를 입력하여 스펙트럼을 실행합니다.
      9. "EFP"를 입력하여 푸리에 변환을 실행하여명령 줄입니다.
      10. 명령 줄에서 명령 "APK"를 입력하여 자동 위상 보정을 수행합니다. 추가 위상 조정이 더 스펙트럼을 개선 클릭해야하는 경우 "프로세스 탭,"다음 위상 보정 모드를 입력하려면 "단계를 조정"아이콘을 클릭합니다.
        1. 모든 신호가 음 흡수 모드에있을 때까지 마우스를 드래그하여 영차 (0)과 제 차 (1)의 위상 보정 아이콘을 사용한다. 적용 및 위상 보정 모드를 종료하려면 "복귀 및 저장"버튼을 클릭하여 위상 보정 값을 저장합니다.
      11. 모든 피크는 단계를 반복하여 긍정적이거나으로 널 중 하나가 될 때까지 타우을 증가 2.2.2.6-2.2.2.9. T 개의 1의 값을 결정하기 위해, 단지 피크로 LN2 널링 된 타우 값을 나눈다.
    3. C (13)에 대해 널 방법 (16)에 의해 측정 한 측정 T
      1. 13 C를위한 새로운 데이터 세트를 생성한다 (단계 2.1.9 참조)
      2. 유형 "pulprog의 t1irpg는"탄소 핵의 반전 복구 실험에 펄스 시퀀스를 변경합니다.
      3. "SW (200)", "o1p 98"(PPM)의 스펙트럼 폭을 상기 RF 송신기의 중심 스캔 횟수 더미 스캔의 수와 데이터 요소의 수를 설정하는 명령 행에서 다음 명령을 입력 "NS 8", "DS 2"및 "TD를 64K".
      4. 유형 "P1 (값)"펄스 보정에 의해 결정된 90 ° 펄스 지속 시간 값을 입력은 상기 180 ° 펄스 형 "P2 (값)"(시간 값은 90이다 (단계 2.2.1 참조) 두 곱 펄스 지속 시간).
      5. "D1 (100)"를 입력하여, 매우 큰 값으로 같은 100 개 (S)를 재순환 지연 시간을 설정한다.
      6. 짧은 값으로 설정 타우, 커맨드 라인에 "100ms의 D7"를 입력하여 같은 MS (100).
      7. 수신부 설정RG 자동 계산을위한 명령 'RGA "를 사용하여 적절한 값으로 어 게인 (RG).
      8. 명령 "ZG"를 입력하여 스펙트럼을 실행합니다.
      9. 명령 라인에서 "EFP"를 입력하여 푸리에 변환을 실행한다.
      10. 명령 줄에서 명령 "APK"를 입력하여 자동 위상 보정을 수행합니다. 추가적인 위상 조정은 상기 스펙트럼을 향상시키기 위해 필요한 경우, "위상을 조정"아이콘 영차 (0)와 일차 동상 (1) 보정을위한 위상 보정 아이콘을 클릭한다.
        1. 영차 및 일차 위상 보정 아이콘을 클릭 한 상태에서 모든 신호가 음 흡수 모드에있을 때까지 마우스를 드래그. 적용 및 위상 보정 모드를 종료하려면 "복귀 및 저장"버튼을 클릭하여 위상 보정 값을 저장합니다.
      11. 모든 피크는 단계를 반복하여 긍정적이거나으로 널 중 하나가 될 때까지 타우을 증가 2.2.3.6-2.2.3.9. 결정T 개의 1의 값은 단순히 피크 LN2에 널링 된 타우 값을 나눈다.
  3. 일차원 (1D) NMR 스펙트럼
    1. 1 H-NMR 스펙트럼
      1. NMR의 데이터 취득
        1. 단계 2.1.7에서 생성 한 H 데이터 세트로 이동하고, 명령 라인에서 "pulprog ZG"을 입력하여 표준 "펄스 획득"펄스 시퀀스 "ZG"를 사용한다.
        2. 90 ° 펄스 각도 PPM의 스펙트럼 폭은 RF 송신기의 중심 스캔 횟수 더미 스캔의 수가 데이터 요소의 수 및 펄스 지속 시간을 설정하는 명령 행에서 다음 명령을 입력 "SW 8", "o1p 3.8", "NS 2", "DS 2", "TD를 64K"및 "(펄스 보정에 의해 결정) P1 '(단계 2.2.1 참조).
          참고 : 32K 데이터 포인트가 500 MHz의 기기에 사용할 수 있습니다.
        3. 커맨드 라인에서 각각 "D1의 7S '또는'D1 9S"를 입력하면 850 ㎒ 악기 500 MHz의 악기들 7 또는 9 초의 이완 지연 시간을 설정한다.
        4. RG 자동 계산을위한 명령 'RGA "를 사용하여 적절한 값으로 상기 수신기의 이득 (RG)를 설정한다.
        5. 향상된베이스 라인과 스펙트럼을 얻기 위해 "digmod baseopt"를 입력합니다.
        6. 명령 행에서 펄스 획득 명령 "ZG"를 입력하여 인수를 시작합니다.
      2. NMR의 데이터 처리
        1. 제로 충전을 적용하고 64K로 실제 ​​스펙트럼의 크기를 설정하는 명령 줄에서 "시의 64 K"를 입력합니다.
        2. 라인 푸리에 변환 전에 0.3 Hz에서의 계수를 확대하여 가중 함수 (지수 형 감쇠)을 적용하는 명령 라인에서 "LB 0.3"를 입력하여 0.3 Hz로 파라미터를 확대 라인을 설정한다.
        3. 명령에 "EFP"를 입력하여 푸리에 변환을 실행하여선.
        4. 명령 줄에서 명령 "APK"를 입력하여 자동 위상 보정을 수행합니다. 추가 위상 조정이 더 스펙트럼을 개선 클릭해야하는 경우 "프로세스 탭,"다음 "단계를 조정"아이콘을 제로 순서 (0)와 일차 (1) 위상 보정을위한 위상 보정 아이콘을 클릭 .
          1. 영차 및 일차 위상 보정 아이콘을 클릭 한 상태에서 모든 신호가 긍정적 흡수 모드에있을 때까지 마우스를 드래그. 적용 및 위상 보정 모드를 종료하려면 "복귀 및 저장"버튼을 클릭하여 위상 보정 값을 저장합니다.
        5. 명령 "복근 n"을 입력하여 통합시베이스 라인 보정에 대한 4 차 다항식 함수를 적용한다.
          참고 :이 최소 강도 평평한 스펙트럼 기준을 보장합니다.
        6. TMS에서 PPM의 보고서 화학적 이동 (δ = 0). 교정을 클릭합니다 ( "CALIB. 도끼"") 아이콘이 0에 가장 가까운 피크 TMS NMR 신호 ()의 상단에 빨간색 선으로 커서를 놓습니다. 왼쪽 버튼으로 클릭하고 입력 "0을.
      3. NMR 데이터 분석
        1. 은 "통합"아이콘 ( "프로세스"탭)과 하이라이트를 사용하여 5.05 및 δ 5.81 δ, δ 4.98에서의 피크뿐만 아니라 0.6 δ 1.1 δ에서 아이콘 ( "새로운 영역을 정의") 스펙트럼 영역을 통합. 적분을 통해 클릭과 드래그를 떠났다.
          참고 : 비활성화하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 지역을 확대하기 위해 마우스를 드래그 하이라이트 아이콘을 클릭 영역에 초점을 맞출 필요가있는 경우. 필요한 경우 임계 강도를 조정하려면 마우스 가운데 버튼을 사용합니다. 다음, 통합 기능이 활성화 다음 피크로 이동 다시 강조 표시 아이콘을 클릭합니다.
          1. 나타나는 적분 값에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 (100), 상기 적분 값의 합계를 정규화아래의 신호와는 "적분 값의 합계를 정규화"를 선택한다. 입력 상자에 값 "100"과는 통합 모드를 종료하려면 "복귀 및 저장"을 클릭합니다.
        2. 내부 표준 물질로서 BHT를 사용하는 경우, δ 6.98에서의 피크를 통합하고 원액 0.5 mL의 BHT의 밀리몰 적분 동일한 세트.
        3. 관심 피크 통합 가능하면 피크의 각 측면에서 10 Hz로 연장한다 (단계 2.3.1.3.1 참조).
        4. 유사한 방식으로 13 C-NMR 스펙트럼을 수집 및 처리를 수행하도록 진행.
    2. 13 C-NMR 스펙트럼
      1. NMR의 데이터 취득
        1. 13 C 데이터 세트로 이동하고, 명령 라인에서 "pulprog zgig"를 입력하여 역 분리 게이트 펄스 시퀀스 "zgig"를 사용한다.
          참고 : 표준 광대역 decou와 탄소 실험을 실행하려면PLED 펄스 시퀀스, 명령 라인에 입력 "pulprog zgpg".
        2. 90 ° 펄스 각도 PPM의 스펙트럼 폭은 RF 송신기의 중심 스캔 횟수 더미 스캔의 수가 데이터 요소의 수 및 펄스 지속 시간을 설정하는 명령 행에서 다음 명령을 입력 "SW (200)", "o1p의 95", "16 NS", "DS 2", "TD를 64K"및 "(펄스 보정에 의해 결정) P1 '(단계 2.2.1.4 참조).
        3. 커맨드 라인에서 각각 "D1의 35S"또는 "D1 45S"를 입력하면 850 ㎒ 악기 500 MHz의 악기들 35 또는 45 초의 이완 지연 시간을 설정한다. BHT를 사용하는 경우, 이완 지연은 500 MHz의 악기들 50 및 850 ㎒ 악기에서 60 초이어야한다.
        4. RG 자동 계산을위한 명령 'RGA "를 사용하여 적절한 값으로 상기 수신기의 이득 (RG)를 설정한다.
        5. 승 스펙트럼을 얻기 위해 명령 줄에서 "digmod baseopt"를 입력i 번째 개선 기준선.
        6. 명령 행에서 펄스 획득 명령 "ZG"를 입력하여 인수를 시작합니다.
      2. NMR의 데이터 처리
        1. 제로 충전을 적용하고 64K로 실제 ​​스펙트럼의 크기를 설정하는 명령 줄에서 "시의 64 K"를 입력합니다.
        2. 라인 푸리에 변환 전에 1.0 Hz에서의 계수를 확대하여 가중 함수 (지수 형 감쇠)을 적용하는 명령 라인에서 "LB 1.0"를 입력하여 1.0 Hz로 파라미터를 확대 라인을 설정한다.
        3. 명령 라인에서 "EFP"를 입력하여 푸리에 변환을 실행한다.
        4. 명령 줄에서 명령 "APK"를 입력하여 자동 위상 보정을 수행합니다. 추가 위상 조정이 더 스펙트럼을 개선 클릭해야하는 경우 "프로세스 탭,"다음 "단계를 조정"아이콘을 제로 순서 (0)와 일차 단계 (1) 교정을위한 위상 보정 아이콘을 클릭 .
            주 : 탄소 스펙트럼은 214 메가 헤르츠 (850 MHz의 구) (제 1 차) 주파수 의존성 오류 정정 라모 주파수에 기록 된 내용은 어려울 수 시간 인해의 대형 오프 - 공진 효과 덜 숙련 된 사용자에 대한 소모적 90 ° 펄스.
        5. 커맨드 라인에서 명령 "복근 n"을 입력하여 통합시베이스 라인 보정에 대한 4 차 다항식 함수를 적용한다.
        6. TMS에서 PPM의 보고서 화학적 이동 (δ = 0). 교정 ( "CALIB. 축") 아이콘을 클릭하고 참조 할 수있는 NMR 신호의 상단에 빨간색 선으로 커서를 놓습니다. "0"에서 왼쪽 클릭 입력합니다.
      3. NMR 데이터 분석
        1. ( "프로세스"탭 아래) "통합"아이콘을 강조 표시를 사용하여 171 δ하는 175 δ에서 아이콘 ( "새로운 영역을 정의") 스펙트럼 영역을 통합 할 수 있습니다. 적분을 통해 클릭과 드래그를 떠났다.
          참고 : 비활성화하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 지역을 확대하기 위해 마우스를 드래그 하이라이트 아이콘을 클릭 영역에 초점을 맞출 필요가있는 경우. 다음, 통합 기능이 활성화 다음 피크로 이동 다시 강조 표시 아이콘을 클릭합니다.
          1. 신호 아래에 나타납니다 적분 값에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭을 수행하여 100 적분을 설정하고 "일체형 현재 보정"을 선택합니다. 입력 상자에 값 "100"하고는 "반환을 저장"을 클릭 통합 모드를 종료합니다.
        2. 내부 표준 물질로서 BHT를 사용하는 경우, δ 151.45에서 피크를 통합하고, 통합에 동일한 설정원액 0.5 mL의 BHT의 밀리몰.
        3. 피크의 각 측면에서 연장되는 5 Hz에서 관심 피크를 통합한다 (단계 2.3.2.3.1 참조).

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Representative Results

1 H, 13 C NMR 스펙트럼은 두 NMR 장비를 이용하여 시판 어유 보충제 회수하고; 850 MHz와 500 MHz의 분석 장치. 이러한 스펙트럼은 이러한 도코 사 헥사 엔 산 (DHA) 및 에이코 사 펜타 엔 산 (EPA), 예컨대 N과 같은 N -1 아실 체인 및 영양 중요한 지표뿐만 아니라 다른 화합물 생선 기름 성분의 정량에 이용 될 수 -6 / N 비 -3. 정량 심지어 내부 표준을 사용하지 않고 수행 될 수 있지만, 정량적 인 결과를 상대 몰 백분율로 표현되어야한다. 데이터의 절대 값 (밀리그램 / g)로 표현 될 필요가있을 때, 내부 표준이 필요하다. NMR에 의해 얻어진 결과는 t에 따라, 0.3 % 내지 13 C NMR 분석을 위해 2 %, 0.5 % 내지 1 H NMR 분석을 2.5 % 범위의 상대 표준 편차 (RSD)를 높은 재현성 그는 지질. 양성자 스펙트럼 분석의 정확성에 영향을 미치는, 과밀 경향이 있기 때문에 1 H NMR의 약간 높은 RSD는 종종 특히 잡음비 (S / N)에 낮은 신호를 공진에 대해 관측되었다. 매우 잘 일치는 850 MHz 및 1 % 내지 4 % 범위의 RSDS와 500 MHz의 기기 사이에서 발견되었다. 특히 N -1 아실 쇄 저급 농도로 나타나는 화합물에 대해, 1 H, 13 C에 의해 얻어진 결과를 비교하면 (8 %까지) 비교적 높은 RSDS 관찰 하였다. NMR 분광법은 이미 약간의 생선 기름 성분 결정을 포함한 지질 분석 도구로 입증되었다. 결과는 같은 GC 17, 18 등의 전통적인 방법과 잘 일치 것으로 나타났다.

1 H NMR 분석

"xfig는">도 1 (A) 850 MHz 및 (B)는 500 MHz의 악기에 얻은 1 H NMR 스펙트럼을 비교한다. 850 MHz의 주파수를 높은 해상도로 특징, DHA, EPA 및 N 10-6 / N을 포함한 어유 그러나 주성분 -3 비는 500 MHz의 주파수로부터 결정될 수있다. 어류 오일의 1H NMR 스펙트럼의 완전한 NMR 할당이 다른 19 발견 될 수있는 반면 정량 용으로 사용될 수있다 어유 지방산의 1 H-NMR 신호는 표 1에 나타내었다.

1 H NMR은 N -3 총량 정량 신뢰성있는 데이터를주고, N -6,7- DHA 트랜스 지방산, N- 아실 -1 쇄, 및 포화 지방산 (SFA). 1 H NMR 분석을 위해, 해당 관계의 사용은 대부분의 때문에 필요ignals 다른 지방산 및 지질에 공통되는 양성자의 그룹에 속한다. 그 때문에, 대부분의 경우 어유의 지방산의 농도는 적절한 관계에 인용 만 1 개 H NMR 다양한 신호의 조합에 의해 결정될 수있다. 또한, 이러한 방정식은 각각의 그룹과 관련된 양자의 상이한 수를 정규화 연산 계수를 포함한다. 내부 표준을 사용하면 다음의 수학 식을 고려한다 : C = I는 / I가 × N는 C가 어유 밀리그램 / g에서의 분석 물의 농도 / N × × MW / m (1)이며, I는 I 내부 표준에 고유 속 양자 신호의 영역이다 고유 관심 지질에 기인하는 공진의 정수이고, N은 분석 관능기 양자의 수는,N IS가 분석에 사용되는 내부 표준 물질의 양성자의 수이고, A는 내부 표준 밀리몰이며, MW는 (메틸 에스테르 표현됨) 지방산의 분자량이고, m은 생선 기름의 양 g으로 표시.

실시 예 1, DHA : DHA의 비율은 I DHA는 DHA의 H의 α 및 H β 양성자 속하는 2.39 δ에서의 신호의 일체 식 C DHA = ¾ I DHA / S, 및 S에 의해 결정된다 SFA에의 메틸 프로톤의 적분 값의 합계 N -6, -9 N, N- -3,4- 트랜스 지방산 플러스 δ 5.05 및 5.81 δ δ 4.98에서 N -1 아실 사슬의 피크의 적분 값이다. 적분 I DHA는 노마이다네 개의 양성자에 해당하기 때문에, 적분 S 세 양성자에 상응하는 반면, 3/4을 곱하여되게 표시. 1 H NMR은 글리세롤 골격에 지방산의 분포에 대한 위치 정보를 제공하는 능력없고 따라서 만 지방산의 총량의 정량에 이용 될 수있다. 캡슐화 어유 보충 1 개 H NMR 분석은 10.5 %의 DHA 이루어지는 것을 보여 주었다. BHT를 사용하여 동일한 샘플 DHA 농도는 105.23 밀리그램 / g 인 것으로 밝혀졌다. 이러한 값은 13 C NMR (13 개 C 분석 실시 예 2 참조) 얻은 값에 매우 근접하다.

실시 예 2 N -1 아실 사슬 : N -1 아실 사슬의 농도 관계 C의 N-1로 주어진다 = I N-1 (3) I는 N-1 5.818 δ에서의 신호의 적분이다 / S. 이신호는 세 곱하여 정규화 될 필요하므로 하나 개의 양성자에 대응. BHT를 사용하면 N -1 아실 사슬, 식 C의 N-1 = 2, N-1 I / I BHT에 의해 결정된다. 결과는 N -1 아실 사슬의 MW는 알 수 없으므로 밀리그램 / g로 표현 될 수 없다.

실시 예 3 N 10-6 / N -3 비율이 중요한 인덱스 N -6 아실 체인 (두 양성자)의 비스 - 알릴 양성자에 상응하는 2.77 δ의 공진의 정규화 된 세기의 비로부터 구할 수있다 δ 0.97에서 삼중 위에 즉 N -3 지방산 속하는 세 양성자에 상응한다. 관계는 C-6의 N / C = N-3 I A 및 B의 I는 신호의 적분 값이다 3/2 I A / I B,각각 2.77 및 δ 0.97, δ에서. N -6 지방산 관계의 C-6, N = 3 / 2I N-6 / S, I는 N-6 δ 2.77에서의 비스 - 알릴 양성자 일체로 결정된다.

실시 예 4는, 트랜스 지방산 : 트랜스 지방산은 트랜스 I는 δ 0.91에서의 신호의 일체 식 C = 트랜스 트랜스 I / S로부터 산출 할 수있다. 850 MHz의 수단을 사용하여 1 H NMR에 의해 결정된 바와 같이 본 시료는, 트랜스 지방산의 3.07 %를 함유 하였다. 500 MHz의 장비에서 분석 동일한 샘플은 트랜스 지방산의 3.03 % 인 것으로 확인되었다.

실시 예 5 포화 지방산 (SFA) SFA의 농도가 될 수 calculated에 식 C = SFA에서의 S로부터 - C N-3 - C N-6 - C의 N-9 - C N-1 - C 트랜스. N -3 지방산 (주로 올레인산), 식 C에 따라 정량화 될 수있는 N-9 = (Q 3/4 - 3/2 I N-6) Q가 N의 알릴 양성자 일체 / S, N -6 -13 δ 2.01에서. 시중에서 판매하는 생선 기름 샘플 SFA의 양은 36.1 %였다. 13 C NMR 분석 동일한 샘플은 33.8 % SFA를 함유하는 것으로 하였다. 어유는 밀리그램 / g으로 표현 될 수없는 경우 SFA 다른 MW 다양한 FA (예, 스테아르 산 및 팔 미트 산)의 기 때문에 그 농도를 나타낸다.

실시 예 6, 총 스테롤 : 총 스테롤의 양 (유리 및 에스테르)는 SIG에 의해 결정될 수있다방정식 C를 사용 δ 0.68에서 나타나는 탄소 18의 메틸 프로톤의 NAL은 = I는 / S를 인트. 시판 어유 시료 중의 총 스테롤의 몰 비율은 0.32 %였다. BHT는 스테롤의 절대 농도의 측정을 위해 사용될 수있다. 어유의 주요 스테롤은 콜레스테롤, 비타민 D (또는 그의 전구체 7- 데히드)을하고 종종 첨가제에 첨가된다. 이들 화합물은 매우 유사한 MW 있습니다. 따라서, 그 결과는 수학 식에 따라 밀리그램 / g로 표현 될 수 있고, 계산 된 C = 2/3 I의 STE / I는 MW의 STE가를 구성 콜레스테롤의 분자량 (386) 인 × MW의 STE / m이고, 생선 기름 (20)의 sterolic 부분의 대부분. BHT를 사용하여 동일한 샘플 스테롤의 함량은 3.8 밀리그램 / 어유 g이었다. 콜레스테롤의 개별 결정 (δ (δ 0.678)의 분해능 향상을위한 창 함수의 적용 후의 850 ㎒ 악기 가능하다.

13 C NMR 분석

도 2 (A)는 850 MHz와 (B) 카르 보닐 탄소 영역에서 500 MHz의 악기에 취득 된 13 C NMR 스펙트럼을 나타낸다. 두 스펙트럼은 매우 유사 정보의 동일한 금액을 제공 할 수 있습니다. 13 C NMR 스펙트럼은 성공적 stearidonic (SDA) 및 eicosatetraenoic (ETA) 산과 같은 추가적인 지방산의 분석에 이용 될 수 있지만 더욱 검사는 이들 산 낮은 농도로되는 샘플을 요구한다. 13 C 스펙트럼 크기 때문에 스펙트럼 폭 광역 디커플링의인가, 고해상도 특징으로하는스칼라 커플 링의 효과를 제거하고 단일 선을 생산하고 있습니다. 이 때문에, 500 MHz의 악기를 사용하는 경우에도 중첩 제한이있다.

13 C NMR 스펙트럼은 1 H NMR 스펙트럼에 비해 훨씬 덜 유익 신호 중첩이 관찰되기 때문에 더 광범위한 정량적 데이터를 제공 할 수있다 (도 1 및도 2). 이 지방산 다수뿐만 아니라 글리세롤 골격 (19), (21, 22)에 자신의 위치 분포에 대한 정량적 정보를 제공하기 때문에 13 C 스펙트럼의 가장 유용한 스펙트럼 영역은 카르 보닐 탄소 영역이다. 13.5 δ δ 14.5에서 메틸기 영역 N -3 총량 빠른 결정을 위해 사용되는 N -6,7- N -9 지방산, 포화 될 수있다산 (SFA),뿐만 아니라 트랜스 지방산. 그러나, 500 MHz의 NMR 분광계에서, N의 일부 중첩 -6 n은 -13 포화 지방산 (SFA)가있다. 850 MHz의 장비가 여전히 신뢰성이 더욱 고려되지만 분해능 향상을위한 윈도우 함수의 적용은이 문제를 해결할 수있다. 탄소 스펙트럼 올레핀 영역 N의 총량이 사용 -3 수 N -1 아실 체인뿐만 아니라 이러한 DHA, EPA, 아라키돈 산 (AA), 리놀렌산 (LN) 개별 지방산의 결정에 관해서는 N -3, 및 올레산 (OL) (표 2 참조). 13 C NMR은 또한 이러한 14.31 (메틸) δ에서 탄소 신호를 이용하여 에틸 에스테르 (EE)이 풍부한 보조제와 같은 다른 소스로부터 어유의 특성화 및 δ 60.20 (메틸렌)에 대해 적용될 수있다.

탄소 분석을 위해, 지방산 determ 될 수 있습니다일반적인 관계 C에있어서, 모든 아실 사슬의 총 적분으로 적합한 지방족, 올레핀과 카보 신호의 적분을 분할함으로써 이네 = I는 / S (2), C는 몰에서의 분석 물의 농도 (%는이고 ), I 고유 관심 지질에 기인하는 공진의 정수이며, S는 시료의 총 지질 함량을 나타내는 신호 (S)의 합계 적분이다. 아실 쇄의 합계 적분은 S (171) δ δ 175에서 영역을 통합하여 결정될 수 있으며 (100)에 설정된다.

어유 밀리그램 / g의 지방산의 정량은 다음의 관계에 기초하여 내부 표준 물질을 사용하여 수행된다 : C = I / I가 × × MW / m (3), C는 분석 물질의 농도이다 밀리그램 / g어유, I 고유 관심 지질에 기인하는 공명의 적분은 MW가 분자이고, I는 내부 표준에 고유 속 탄소 시그널의 면적 A는, 내부 표준 밀리몰이다된다 관심 화합물의 중량 및 m (지방산 메틸 에스테르 표현 산 대해) g 생선 기름의 양이다. 13 C NMR 스펙트럼의 완전한 NMR 할당이 다른 19 발견 될 수있는 반면 정량 용으로 사용될 수있다 어유의 지방산의 13 C-NMR 신호는 표 2에 나타내었다.

실시 예 1, EPA는 SN -2 위치에서 다음의 Sn -2 위치에서 EPA의 함량 (%)을 S로 δ 172.56에서의 신호의 적분을 나눔으로써 계산된다. 공동의 SN -2 위치에서 EPA의 양mmercially 가능한 샘플은 850 MHz의 악기를 사용 3.4 % 인 것으로 밝혀졌다. 내부 표준과 같은 분광계 및 BHT를 사용 SN -2 위치에서 EPA의 양을 밀리그램 표현 / 어유는 29.73 g 밀리그램 / g이다. 500 MHz의 기기 분석 동일한 샘플은 SN -2 위치에서 3.6 % 또는 31.39 밀리그램 / g의 EPA를 포함하는 것으로 밝혀졌다. SN에서 EPA의 상대 분자량 비율을 계산할 때 -2 완전히 분리 된 스펙트럼을 이용하여 유사한 결과를 얻을 수있다. EPA의 카르 보닐 탄소가 기준으로 사용되는 다른 카본 탄소와 동일한 무시할 정도 프로톤 디커플링에 의해 영향을 받기 때문이다. 정량 사용 δ 151.45에서 BHT의 탄소, 지방산의 카르 보닐 탄소에 비해 다른 NOE 향상을 수신하기 때문에, BHT를 사용하는 경우에는 큰 편차가 관찰된다. 이 때문에, 완전히 분리 된 스펙트럼은 내부 표준을 사용 또는 c를 통합 할 때 피해야한다다른 다중도에 arbons.

실시 예 2, DHA의 총량 : DHA의 총량 (%)는 단순히 각각 172.48 및 172.08 δ, δ의 NMR 신호들에 의해 결정된 -1,3- SN 및 SN -2 위치 DHA의 양을 첨가함으로써 계산된다. 1 H NMR 분석은 동일한 샘플 (1 개 H 분석 실시 예 1 참조) 13 개 C NMR 분석에있어서 DHA 10.3 %였다. DHA의 함량은 또한 내부 표준 수학 식 3 DHA의 총량 103.25 밀리그램 / g을 사용했다 밀리그램 / g로 표현 될 수있다.

실시 예 3은, SDA의 총량 : SDA의 총량 (%)을 1,3 및 SN 위치에 SDA의 카르 보닐 탄소에 속하는 δ 172.99의 신호의 적분을 첨가하고, δ 172.60 의해 결정SN -2 각각 다음 S하여 합을 나눔. 분석 된 샘플은 3.93 %의 SDA 또는 34.54 밀리그램 / g을 함유하는 것으로 하였다.

실시 예 4, LN은 N -3 : N -3 LN (%)을 일체로 S δ 131.85에서의 신호의 적분을 분할함으로써 결정될 수있다. 분석 어유 샘플 N -3 (LN)의 몰비는 0.7 %였다. BHT를 사용하여 절대 농도는 5.5 밀리그램 / g으로 계산되었다.

실시 예 5 트랜스 지방산 : 트랜스 지방산의 몰 비율은 S와 δ 13.80에서의 신호의 적분을 나눔으로써 결정된다. 1 H NMR로 분석 한 결과 및 트랜스 FA의 3.07 %였다 동일한 샘플의 분석은,도 13 C NMR로 분석하고, 그 트랜스 지방산의 함량은 3.42 %였다. 티500 MHz의 악기에 동일한 시료의 13 C NMR 분석 고 트랜스 지방산의 함량이 3.64 %를 나타내었다. 어유 밀리몰 / g의 트랜스 FA의 양은 내부 표준 방정식 C로서 BHT를 사용하여 결정될 수있다 = I는 / I 그러나 결과 때문에 피크 13.80 δ에서 밀리그램 / g로 표현 될 수 없다 × A / m IS 다른 MW 다양한 트랜스 지방산, 주로 트랜스 DHA와 트랜스 EPA에 해당한다.

실시 예 6, EE : 생선 오일 샘플 EE의 농도는 S로, 다양한 지방산의 EE의 메틸렌 탄소에 해당하는 60.00 60.50 δ δ하는 스펙트럼 영역에서의 적분 값을 나누어 계산한다. ee를 생선 기름 샘플의 분석은 100 % EE 구성 것으로 나타났다. 그것은 주목해야한다 EE 샘플에서, EPA의 캘리포니아DHA는 60.31 및 / 또는 173.09 δ δ에서의 신호의 신호를 이용하여 계산 될 수있는 반면, N, δ 173.60 또는 δ 60.20에서 EE 메틸렌 탄소가 카르 보닐에 의해 하나의 피크 계산.

이 분석을 위해 사용될 수있는 방정식들의 상세한 설명을 찾을 수있는 반면, 13 C 1 H의 NMR 분석으로 정량 분석을 위해 사용될 수있는 진단 신호의 전체 목록은 각각 표 1 및 표 2에서 발견 될 수있다 다른 19.

NMR 추가적으로 어유 첨가제의 산화 상태의 평가를 위해 적용될 수있다. 도 3은 2 개 개의 산화 조건 하에서 어유 샘플의 1H NMR 스펙트럼을 비교한다; 자외선 노광, 가열에 노출 (UV)빛. 지질 산화 복잡한 과정이며, 산화 생성물의 조성은 산화 조건에 의존한다. 주요 산화 제품 (8.0-8.8 δ) 과산화물, 공액 디엔 과산화수소 (δ 5.4-6.7) 및 (9.0- 10 δ) 알데히드이다.

그림 1
그림 1. 1 H NMR 분석. 850.23 (A) 및 500.20 MHz의 (B)을 CDCl3 용액으로 어유 보충 1 H-NMR 스펙트럼. 그 판단에 사용될 수있다 EPA와 DHA의 NMR 신호를 나타낸다. δ 0.97에서의 피크는 N -3 지방산의 총량의 결정에 사용될 수있다. 그것은 모든 지방산 사슬의 메틸렌 양성자에 속한다 δ 1.39-1.20에서 봉투가 잘려s와는 확인 또는 정량 목적으로 사용할 수 없습니다. 1H NMR 스펙트럼은 13 C NMR 스펙트럼에있어 낮은 스펙트럼 해상도를 비교하여 좁은 스펙트럼 폭 (SW)을 특징으로한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 13 개 C NMR 분석. 213.81 (A) 및 125.77 MHz의 (B) 카르 보닐 탄소 영역을 CDCl3 용액으로 어유 보충제의 13 C-NMR 스펙트럼. SN 및 SN -1,3- -2 위치의 EPA와 DHA의 NMR 신호를 나타낸다. 이 신호들은 EPA와 DHA의 정량에 이용 될 수있다. 특수 목적이지만213.81 MHz에서 기록 CTRA보다 높은 해상도와 감도 특징은 125.77 MHz의 스펙트럼과 같은 주요 화합물의 결정에 사용될 수있다. 13 C NMR 실험에 디커플링 애플리케이션은 탄소 및 수소 핵과 단봉은 1 H NMR 스펙트럼에 비해 분석 쉬워 이와 같이 신호가 나타나는 간의 스칼라 커플 링의 효과를 제거한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 생선 오일 산화. 산화 어유의 1H NMR 스펙트럼은 산화 조건에 의존한다. 과산화물 (δ 8.0-8.8), C에 의한 공진onjugated 디엔 과산화수소 (δ 5.4-6.7), 및 알데히드가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

δ ppm으로 양성자 화합물
0.677 CH 3 (18) 콜레스테롤
0.678 CH 3 (18) 7- 데히드
0.88 CH 2 CH 3 (t), J의 ω1, ω2 = 7.27 Hz의 N -9, SFA 아실 체인
0.883 CH 2 CH 3 (t), J의 ω1, ω2 = 7.08 Hz의 N -6 아실 체인
0.911 CH 2 CH 3 (t), J의 ω1, ω2 = 7.65 Hz의 트랜스 아실 체인
0.973 CH 2 CH 3 (t), J의 ω1, ω2 = 7.63 Hz의 N -3 아실 체인
1.25 CH 2 CH 3 (t)는 J = 7.20 Hz에서 에틸 에스테르
1.697 OCOCH2CH 2 (t), J H의 α, β = Hz에서 Η EPA 아실 체인
2.391 OCOCH 2 CH 2 (t) DHA 아실 쇄
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH N -6 아실 체인
2.81 CH = CHCH 2 CH = CH N -3 아실 체인
3.593 (3'a)을-CH 2 OCO 1-MAG의 글리세롤
3.722 (3'a)을, (3)217; B-CH 2 OCO (BR) 1,2- 글리세롤 DAG
4.073 2'-CHOH (BR) 1,3-DAG의 글리세롤
4.121 CH 2 CH 3 다중 에틸 에스테르
4.173 1'B, 3'b-CH 2 OCO (DD) 1,3-DAG의 글리세롤
4.238 1'a OCO-CH 2 (일) 1,2- 글리세롤 DAG
4.329 1'B OCO-CH 2 (일) 1,2- 글리세롤 DAG
4.989 -CH = CH 2 시스 (DD) N -1 아실 체인
5.052 -CH = CH 2 트랜스 (DD) N -1 아실 체인
5.082 2'- CHOCO 1,2- 글리세롤 DAG
5.268 2 '; -CHOCO TAG의 글리세롤
5.436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 N -1 아실 체인
5.818 -CH = CH 2 N -1 아실 체인

표 1 : 1 H NMR 스펙트럼의 할당. 그만큼 CDCl3 중 용액의 정량 용으로 사용될 수있다 어유 지방산 신호의 1 H-NMR의 화학 시프트가 제공된다. 화학적 변화는 ppm으로 측정하고, 핵의 화학적 환경에 대한 정보를 제공한다.

δ ppm으로 탄소
173.24 C1 SFA (1,3 SN)
172.21 C1 OL, LO (-1,3- SN)
C1의 ETA (-1,3- SN)
173.13 C1 DPA (1,3 SN)
173.03 C1 SDA (1,3 SN)
172.97 C1 EPA (1,3 SN)
172.73 C1의 ETA (SN -2)
172.69 C1 DPA (SN -2)
172.61 C1 SDA (SN -2)
172.56 C1 EPA (SN -2)
172.48 C1 DHA (1,3 SN)
172.08 C1 DHA (SN -2)
136.8 Cω1, N -1
131.85 Cω3 LN
130.37 C15 AA
130.11 C9 LN
130.06 C13 LO
129.54 C5 DHA SN -2
129.47 C5 DHA SN -1,3-
128.94 C5 EPA
128.76 C6 EPA
128.45 C17 않음 -3
127.71 N -3
127.53 C4 DHA SN -2
127.5 C4 DHA SN -1,3-
126.86 Cω4, 모든 N -3
114.71 Cω2, N -1
60.08 DHA 에틸 에스테르
59.96 EPA, 에틸 에스테르
59.95-59.85 다른 FA 에틸 에스테르
33.48 C2 EPA SN -2
33.32 C2 EPA SN -1,3-
31.44 C3 않음 -1
27.05 알릴 N -6
26.49 C4 EPA SN -1,3-
26.47 C4 EPA SN -2
24.6 C3 EPA
24.48 C3 SDA에서의 Sn-1,3
24.44 C3 SDA SN -2
14.27 Cω1, 모든 N -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, OL
14.07 Cω1, LO
13.8 Cω1, 트랜스 FA

표 2 : 13 C NMR 스펙트럼의 할당. 정량 PURP 사용될 수 어유 지방산 신호의 13 C-NMR의 화학적 이동CDCl3 중 용액 OSE를 제시한다.

기업도 S1 : 13 C NMR 스펙트럼의 비교 표준 광대역 디커플링 (A) 및 (B) 펄스 시퀀스를 분리하는 게이트 역을 이용하여 획득. 스펙트럼은 동일한 처리 파라미터로 처리 스캔 동일한 번호로 동일한 샘플에 대하여 같은 스케일 팩터로 나타낸다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

문제 해결에 대한 수정 및 전략

스펙트럼 품질. NMR의 신호에 따라서 NMR 스펙트럼 해상도의 선폭은 자기장의 균일 성을 최적화하는 처리 인 shimming에 크게 의존한다. 일상적인 분석을 위해, 1 차원 shimming 적절한 차원이고 shimming는 그것을 정기적 NMR 요원에 의해 수행되는 것을 고려할 필요는 없다. O (90:10) 2 D : 그렇지 않은 경우, 3 차원 shimming는 H 2 O 0.6 mL를 함유하는 샘플을 사용하여 분석 전에 수행되어야한다. A는보다 빠르고 shimming 달성하기 위해, 샘플은이 자석 구멍에 배치되기 전에 경사 깊이 게이지를 사용하여 무선 주파수 (RF) 코일의 여기 / 검출 영역의 중심으로 할 필요가있다. shimming에 영향을 미치는 또 다른 요인은 10 ~ 20 Hz의 회전 속도로 샘플을 회전합니다. 이 스핀 속도로 샘플을 회전하는 반경 방향 쐐기 향상되었지만 (X, Y, XY, XZ, YZ, X-Y (2) 2 등), 일반적으로 첫번째 또는 고차의 스피닝 사이드 밴드의 출현을 피하기 위해 권장되지 않는다. 라모 동작 기기에서 작동하는 400 MHz의보다 낮은 주파수에서는 그러나, 회전은 1 차원 NMR 실험을 위해 권장된다.

해상도뿐만 아니라 감도는, 수신기 이득 (RG)의 값에 의해 영향을 받는다. 상기 수신기 이득의 낮은 값은 아날로그 - 디지털 컨버터 (ADC)의 적절한 원인 플로우 값보다 높은 반면, 감도를 감소시킨다. 자유 유도 붕괴 (FID)의 첫 번째 포인트가 손실 될 수 있기 때문에 ADC 오버플 비대칭 라인 형상의 결과 신호는 정량적 목적을 위해 사용될 수 없다. 대부분의 경우, 명령 "RGA는"적절한 RG 값을 계산합니다. 그러나, 일부의 경우, 소프트웨어에 의해 산출 된 RG 값이 이상적인 값보다도 높고 NMR 신호의 로렌츠 형상의 왜곡이 존재한다. 에서이러한 경우, 사용자가해야 할 명령 라인에서 "RG (가치)"를 입력하여 수동으로 입력 RG 작은 값. 이 프로토콜 분석 샘플의 일반적인 RG 값은 8이다.

저온 사용시 종종, 고품질 팩터 (Q 팩터), 라스트 펄스 및 검출 기간 사이에 큰 지연 (데드 타임)> 200US으로 NMR 프로브 냉각은 예를 들면 송신기의 주파수 주위 고비 아티팩트를 방지하는 데 필요 그리고 스펙트럼의베이스 라인에서 압연. 그러나, 이러한 긴 지연은 또한 강한 신호의베이스 주변 기준 압연 큰 강하를 도입 할 수있는 큰 음 일차 위상 오차를 야기한다. 작은 감도 저하가 23를 발생할 수 있지만, 이러한 경우에있어서, Z-복원 스핀 에코 펄스 시퀀스가 상당히 개선 기준선과 NMR 스펙트럼을 생성하는데 사용될 수있다.

인지질. 생선 기름의 분석에 추가트리글리세리드 에틸 에스테르 풍부한 샘플은 NMR 인지질 (PL의) 풍부한 어유 샘플의 분석을 위해 사용될 수있다. 치하 양식 집계는, 스펙트럼 해상도와 감도에 상당한 감소를 일으킬 수 있기 때문에 특별한주의는 샘플이 필요합니다. 메탄올 : 이들 샘플의 분석, 클로로포름의 혼합 용매를 들어 : 70:30의 비율 (CDCl3 중 CD 3 OD) 고품질의 스펙트럼을 얻기 위해 요구된다.

내부 표준입니다. 간단 1 H, 13 C NMR 스펙트럼으로 매우 대칭 분자이며, 그 피크 중에 생선 기름 성분들과 겹치지 않기 때문에 BHT이 연구에서 내부 표준으로 채택되었다. 및 신호 -에서 BHT는 6.97, δ 중항로 나타나고 두 상응하는 방향족 양성자합니다 (OH기에 대하여 파라 위치에있는)에 속하는 1 H NMR 스펙트럼 신호를 가지고-OH기를 함유 방향족 급 탄소에 속하는 13 C NMR 스펙트럼에서 δ 151.45. 이러한 신호는 모두 생선 기름의 성분 중 하나와 오버랩이 없다, 따라서 정량 목적으로 사용할 수 있습니다. 예컨대 1,2,4,5- 테트라 클로로 -3- 니트로 벤젠 (TCNB) 또는 에틸렌 클로라이드와 같은 다른 화합물은 그러나, 길게 한 T 값을 특징으로 대체 내부 표준 물질로서 사용할 수있다.

기술의 한계

어유 보충제 다양한 지방산 및 지질의 정량은 1D 스펙트럼의 적절한 진단 NMR 신호의 통합을 통해 달성된다. 그러한 신호는 단지 특정 샘플 성분에 속해야 다른 화합물들로부터의 신호와 간섭이 없어야한다. 1 H NMR 스펙트럼은 저해상도 특징 때문에 이는 체의 단거리 1 개 H NMR 분석에 문제가 될 수있다mical 이동한다. 또한, 스칼라 커플 링의 존재 (J)는 다중 상태를 생성 및 분석이 더 복잡하게 만든다. 예를 들어, 에틸 에스테르 (EE)는 1.25 δ로 메틸기의 특성 트리플렛 (J = 7.20 Hz에서)에서 1 H NMR을 사용하여 정량화 될 수 있고, 에스테르 기의 메틸렌 양성자에 속하는 다중 4.12 δ에서. 라모에서 동작 NMR 장비를 사용하여보다 낮은 850 ㎒의 주파수에서는 그러나, 1H NMR을 이용하여 EE의 분석 TG는 4.14 δ의 피크 4.12, δ 때문에 피크의 부분 중첩을 회피하고, 오버랩해야 δ 1.23-1.35 지방족의 메틸렌 양성자의 넓은 신호 δ 1.25에서의 신호. 큰 편차는 일부 샘플의 EPA의 1 H, 13 C 분석 사이의 관찰, 13 C NMR t는에 의해 제공되는 조성물 표지 가까웠다그는 제조 업체. 이는 어유 보조제의 일부 유형에서 나타나는 다른 화합물의 신호와, EPA 분석에 사용 δ 1.69에서 신호의 중첩에 아마도. 내부 표준을 사용하는 경우 정량화에 추가 오류로 인해 내부 표준의 불확실한 순도와 무게의 오류에서 발생할 수 있습니다.

조성 분석은 내부 표준을 사용하지 않고 상대의 몰 농도로 표현 될 수있다. 결과 오일 (밀리그램 / g)의 그램 당 지방산 밀리그램 예를 들어, 절대 농도로 표현 될 필요가 있다면, 내부 표준의 사용이 요구된다. 내부 표준을 사용하는 경우에도 그러나, 관심의 NMR 신호는 분자량이 다른 여러 화합물에 속하는 경우에, 그 결과는 밀리그램 / g로 표현 될 수 없다. 또한, 내부 표준 물질의 사용은 일반적으로 분석의 길이를 증가시키는 가장 일반적인 내부의 때문에 예로서 BHT tandards은, 긴 완화 시간을 초래 고분자 대칭 작은 분자이다. 펄스들 사이의 긴 지연을 필요로 반복 횟수 때문에 (펄스 + 획득 시간 사이의 지연) 샘플의 긴 완화 시간 T (1)에 따라 설정하고, 내부 표준 물질의 사용은 실험의 기간을 증가시킬 것이다. 이는 탄소 핵의 매우 긴 T 1 완화 시간의 13 개 C NMR 분석에 특히 중요한 요소이다. 이러한 CR (ACAC)로서 상자성 화합물의 첨가 3 효율적 T 1 완화 시간을 줄일 수있다. CR (ACAC) 3의 농도는 추천 / ㎖의 용액을 0.75 mg이었다. CR (ACAC) (3)의 높은 농도가 T (1)의 추가적인 감소를 위해 고려 될 수 있지만,주의 의한 광고 넓어로 S / N의 감소를 피하기 위해 필요하다.

13 C NMR 1 H에 비해 훨씬 더 높은 스펙트럼 해상도 특징되지만 ntent "는> 13 C NMR 실험의 감도 (인해 낮은 자연 존재비 (1.1 %)과 저 회전 자기 비 67.26 10 현저히 낮다 분석에 사용할 수있는 오일이 제한 될 때 증가하기 때문에 6 RAD S -1 T-1) 13 개 C 핵. 또한, 13 C의 긴 T 1 완화 시간이.이 문제가 될 수있는 분석의 길이를 증가 스캔의 수는 잡음비 적절한 신호를 얻기 위해 사용한다.

감도 및 NMR 스펙트럼의 분해능 한계는 GC와 같은 다른 기술로 분석 될 수 어유 많은 작은 화합물의 분석을 방지한다. 예를 들어, 1 Η NMR 개별 스테롤 또는 13 C 반면 지방산 (예 : 팔 미트 산 및 스테아르 산)를 분리 할 수없는173.24 및 172.82 δ δ 모든 포화 지방산의 신호와 중첩 예컨대 도데 및 미리스트 산 등의 생선 기름은 매우 낮은 농도로 나타나는 화합물을 결정할 수 없다. 분석 시료의 양을 증가시키는 것이 가능한 약간의 화합물의 분석을하게되지만,주의 높아졌기 때문에 점도 매우 농축 된 시료에 대해 요구된다. S / N의 감소로 인해 감소 된 T 스핀 - 스핀 완화 시간 (2)에 의한 라인 폭이 넓어에 있기 때문에 기름 이상 150 ㎎을 함유하는 점성 용액을 피해야한다. 또한, 펄스 사이의 긴 지연 때문에 더 이상 T 1의 요구와 shimming에 따라서 해상도 몇 가지 문제가있다한다.

NMR과 어유 분석의 모든 화합물은 분리 또는 정제 단계를 사용하지 않고 하나 개의 스냅 샷을 동시에 정량 할 수있다. 핵 자기 공명기로13 C NMR 취득 10 분 지속하는 반면, 1 H 스펙트럼은 1 분 미만에 기록 될 수 alysis가 빠르다. 데이터 수집 시간에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 있다는 것을 유의해야한다. 구체적으로는, 13 C NMR 들어, 10 분의 실행 시간은 내부 표준을 사용하지 않고도 달성하고, RF 코일과 프리 앰프 냉각함으로써 열 잡음을 최소화하는 극저온 냉각 된 프로브를 사용하여 할 수있다. 실온 (종래의) 프로브를 사용할 때의 실험 시간의 10 ~ 15 배 증가가 13 개 C NMR 분석 예상한다.

기존의 방법에 대한 의의

NMR 분광법 어유 보조제 조성물의 정성 및 정량 분석을위한 강력한 도구로 입증 및 rapidness으로는 가능성이 있기 때문에 방대한 뉴 높은 처리량 스크리닝 적용 생선 기름 샘플 mber. 신호 영역은 신호를 발생할 핵 수에 직접 비례하기 때문에 NMR 분광법 정의 정량적 방법론이다. 급성 독성 화학은 NMR 시료를 제조하기 위해 필요한 동안 샘플을 용리 용매의 대용량을 필요로하는 다른 방법과 반대로,이 화학 물질 (예, CDCl3 중)의 그러한 작은 양이 사용되므로,이 방법은 환경 친화적이다. 또한, NMR 분석은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 표준 어떠한 교정 전에 분석을 필요하지 않고, 임의의 분리 및 정제 공정없이 최소한의 샘플 준비는 보통 매우 빠른 NMR 분석 도구 렌더링되는 채용된다. 또한, 13 C NMR은 글리세롤 골격에 각종 지방산의 위치 분포를 결정하기위한 최선의 가능한 방법이다. 효소 가수 분해의 대안으로 사용되었지만 항상 신뢰할 수 없습니다= "외부 참조"> 24. 이 인간의 다이어트 (25), (26)에서의 기능에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다으로 음식의 다양한 지방산의 regiospecificity 공부에 상당한 관심이 있기 때문에이 특정 중요하다.

미래의 응용 프로그램

NMR 분석 및 제품의 라벨 사이의 합의에도 불구하고,뿐만 아니라 GC 및 NMR 간의 합의를 보여주는 몇 가지 연구가 있다는 사실, 우리는 더 엄격하고 포괄적 인 내 실험실 연구는 NMR과 전통 사이의 계약 등을 검토 할 필요가 있다고 생각 샘플, 다른 기원의 생선 기름 제품의 큰 번호를 사용하여 생선 기름 성분의 분석을위한 방법론, 인증 표준 솔루션을 제공합니다.

생선 오일 분석 NMR의 또 다른 중요한 미래의 응용 프로그램은 산화 생성물의 결정 될 것입니다. 판정 이외에어유에서 주요 화합물, 알데히드 및 ​​과산화물 어유의 여러 주 및 보조 산화 생성물이 존재한다. 도 3에 도시 된 바와 같이 1 H NMR 잠재적 다른 산화 조건 하에서, 어유 보충제의 산화 상태의 평가를 위해 적용될 수있다. 이 분석에서 가장 큰 과제는 NMR 할당 및 개별 산화 제품의 식별 될 것입니다. NMR의 하드웨어의 감도의 발전은 13 C NMR을 사용하여 개별 스테롤의 식별을 허용한다. NMR 분광법은 (HR-MAS) NMR을 회전 고해상도 매직 각도를 사용하여도 어떤 추출하지 않고 전체 물고기 조직의 분석에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

양적 NMR 스펙트럼의 정확도에 영향을 미치는 가장 중요한 단계 중 두 90 ° 펄스의 선택과 우레탄 사이에 지연의 사용을 포함LSES ≥ 5 × T 1. 펄스 각도 계측 샘플에 의존하는 보정 NMR 파라미터 인 펄스 폭에 비례한다. 90 ° 펄스는 관측 폭 (XY) 자화 길이 (Z)의 자화의 완전한 전환을 위해 필수적이다. 펄스 교정 전에 NMR 잘 조정하고 일치시킬 필요를 탐색 할 점에 유의하는 것이 중요하다. 이 샘플에 RF 전력의 전달을 최적화함으로써 S / N을 최대한 효과적인 디커플링을 보장한다. 프로브 튜닝 주로 샘플의 유전율의 영향 때문에, 시료의 농도에 차이가있는 경우, 각각에 대해 튜닝 과정을 반복한다. 1 차원 13 C NMR 실험은 모두 13 C 1 개 H 채널 그래서 자동 튜닝 관련 매칭 모두 핵 필요하다.

5 ×의 T 1보다 긴 펄스 사이의 지연은 완전한 녹화를 보장합니다초기 값으로 순 자화 overy. 스펙트럼의 모든 공진 완전히 각 펄스 전에 이완되지 않으면, 신호는 부분적으로 억제 이는 통합 부정확성에 이르게된다. T의 값은 실험의 길이에 영향을 미치는 중요한 인자이며, 자계 강도뿐만 아니라, 시료의 점도에 의존한다. 샘플의 점도와 유사한 것을 감안할 때, T (1) 완화 시간은 분석 세션의 시작에서 각 기기에 대해 결정되어야한다.

13 C NMR과 어유 분석의 또 다른 중요한 특징은 적절한 펄스 시퀀스의 선택이다. 13 C 정량 분석하는 가장 안정적인 방법은 광대역 프로톤 디커플링 취득 기간 중에 만 적용되고, 따라서 13 행, 1 시간에서 어떠한 편광 이동은 없다 디커플링 실험, 게이트 역인핵 오버 하우저 (Overhauser) 효과 (NOE)를 통해 C. 완전히 분리 NMR 실험 정량적 목적을 위해 사용될 수있는 반면 피해야 다른 다중도 메틸 메틸렌 메탄 카보 닐 탄소 사이 따라서 일체 비교와 탄소 중에서 다른 NOE 요인이 있기 때문에,이 실험을 사용하는 경우에는,주의가 필요하다. 비슷한 다양성 및 화학 환경의 탄소가 분석에 고려 때이에도 불구하고, 완전히 분리 방법은 신뢰할 수있다. 이것의 한 예는 27 디커플링 후 NOE 요인에서 유의 한 차이가없는 것으로 밝혀졌다 지방산의 카르 보닐 탄소입니다. 또한, 탄소 담지 양성자 위해 완전히 분리 실험 인해 NMR 신호 강도의 NOE 기여 높은 감도를 제공한다. 두 펄스열 취득한 스펙트럼의 비교가도 S1에 나타낸다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 오하이오 주립 대학의 건강 검색 테마에 대한 식품 및 오하이오 주립 대학의 식품 과학 기술의 부에 의해 지원되었다. 저자는 오하이오 주립 대학의 NMR 시설 및 펜실베니아 주립 대학의 NMR 시설을 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

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Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

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