Summary
ここで、高分解能1 H及び13 C核磁気共鳴（NMR）分光法は、カプセル化された魚油サプリメントの定量的および定性的分析のための迅速かつ信頼性の高いツールとして使用しました。
Abstract
西洋の食事は、したがって、魚油サプリメントの消費はこれらの必須栄養素の摂取量を増やすことが推奨され、nは -3脂肪酸に乏しいです。この研究の目的は、二つの異なるNMR器具を利用した高分解能1 H及び13 C NMR分光法を用いてカプセル化された魚油サプリメントの定性・定量分析を実証することです。 500 MHzおよび850 MHz装置。両方のプロトン（1 H）および炭素（13 C）NMRスペクトルは、魚油サプリメントの主要な構成成分の定量的決意のために使用することができます。魚油サプリメント中の脂質の定量は、当該1Dスペクトルに適切なNMRシグナルの積分によって達成されます。 1 H及び13 C NMRにより得られた結果は、2つの核と2つの機器間の分解能と感度の差にもかかわらず、互いによく一致しています。 1 H NMRプランスペクトルは1時間に10分から続く13の C NMR分析とは対照的に、1分未満に記録することができるようにSAより迅速な分析は、13 C NMRに比べ。 13 C NMRスペクトルは、しかし、はるかに有益です。個々の脂肪酸のより大きな数の定量的データを提供することができ、グリセロール骨格上の脂肪酸の位置分布を決定するために使用することができます。両方の核を精製または分離工程を必要とせずにただ1つの実験において定量的情報を提供することができます。磁界の強度はほとんどが13 C NMRに対するその低い解像度に1 H NMRスペクトルに影響を与える、しかし、低コストのNMR機器を効率的に食品業界および品質管理研究所による標準的な方法として適用することができます。
Introduction
食餌中のn-3脂肪酸の摂取は、心疾患1、2、3、4、炎症性疾患および糖尿病5のように、いくつかの状態に対して有益であることが証明されています。西洋食は、n -3脂肪酸の貧しい考えられているので、魚油サプリメントの消費量は、nを改善することが推奨され-6 / N -3消費者の栄養1のバランス。魚油サプリメントの消費量の最近の増加にもかかわらず、質問は、これらの製品のいくつかの安全性、信頼性、および品質について残ります。魚油サプリメントの迅速かつ正確な組成分析は、適切にこれらの商用製品の品質を評価し、消費者の安全を確保するために不可欠です。
魚油サプリメントを評価するための最も一般的な方法論Sは、ガスクロマトグラフィー（GC）及び赤外分光法（IR）です。これらは非常に敏感な方法ですが、彼らはいくつかの欠点がある6。 GC分析は、個々の化合物の分離および誘導体が7必要であり、脂質酸化を分析8,9の間に発生する可能性があるため、時間がかかり（4~8時間）です。 IR分光法を定量することができるがIRバンドは、単一化合物10に起因することが可能な例外はあるが、予測モデルは、部分最小二乗回帰（PLSR）を使用して構築する必要があります。 PLSR解析11の時間を増大させる多数のサンプルの分析を必要とします。このため、魚油多数のサンプルの正確かつ迅速な分析を可能にする新しい分析手法の開発に関心が高まっています。このようオフィとしての組織国立衛生研究所（NIH）と食品医薬品局（FDA）でのサプリメントのCE（ODS）は、これらの新しいメソッド12、13を開発するための公式分析化学者協会（AOAC）と協力してきました。
スクリーニングおよびそのような栄養補助食品などの多成分マトリックスを評価するための最も有望な分析方法の一つは、核磁気共鳴（NMR）分光法14、15です。 NMR分光法は、いくつかの利点を有する：それは非破壊的かつ定量的な技術は、それはサンプル調製に最小限必要であり、優れた精度と再現性を特徴とします。それは、溶媒を少量しか使用しているためまた、NMR分光法は、環境に配慮した方法論です。 NMR分光法の主な欠点は、他のanalytiと比較して相対的に低い感度でありますCALの方法は、しかし、そのような強い磁場、種々の直径の極低温プローブ、高度なデータ処理、及び多目的パルスシーケンス及び技術として計測における最近の技術進歩は、nM範囲まで感度が増加しています。 NMR計測は、高コストではあるが、NMR分光計の長寿命およびNMRの多くのアプリケーションは、長期的には、分析のコストを下げます。この詳細なビデオプロトコルは、フィールドに新しい実践者が1 Hおよび魚油サプリメントの13の C NMR分光分析に関連した問題を回避するためのものです。
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Protocol
1 NMRサンプル調製
注意：注意は、使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。試料調製に使用される重水素化クロロホルム（CDCl 3）は有毒です。ヒュームフードや個人用保護具の使用を含む試料の調製を行うときに、すべての適切な安全対策を使用してください（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、靴、つま先を閉じた状態）。
- 1 H及び13個の C試料の調製
- シリンジを用いて食物カプセルからの魚油の120μL（〜110 mg）を抽出し、4mLのガラスバイアル中に置き。魚の油の重量を記録します。
- サンプルの溶解
- 1 Hおよび13の Cの化学シフトの基準として使用されるテトラメチルシラン（TMS）を0.01％含有するCDCl 3中の500μLに魚油の約120μLに溶解します。
注：TMSが使用されます唯一の化学シフト較正のため（ステップ番号2.2.1.2.7と2.2.2.2.7を参照）は、D、しない定量のための目的（ステップ番号2.2.1.3および2.2.2.3を参照）。 - 定量化は、Mg / gで表さ場合2,6-ジ-tert-ブチル -4-メチルフェノール（BHT）のストック溶液を調製し、BHTの約220ミリグラムを溶解することによって、所望のクロム15mgの（III）アセチルアセトナート（CR（れますTMSの0.01％を含有するのCDCl 3 20mL中ACAC）3）。魚油100mgの（±10 mg）を溶解するために原液500μLを使用してください。
- 1 Hおよび13の Cの化学シフトの基準として使用されるテトラメチルシラン（TMS）を0.01％含有するCDCl 3中の500μLに魚油の約120μLに溶解します。
- （これは、数秒かかります）油を溶解した後、直接、高品質5 mmのNMRチューブに溶液の全てを転送し、キャップを取り付けます。サンプルを調製後24時間以内のサンプルを分析します。
2. NMR計測器の準備
注意：注意は、NMR機器によって生成強力な磁場の存在は、医療機器とのimplに影響を与えることができること用心しますそのようなペースメーカーおよび外科プロテーゼ、ならびにクレジットカード、時計、 などの分析が、非シールド磁石を使用して実行された場合は、追加の注意が必要とされるなどの電子項目としてアリ。二つNMR機器は1 H及び13 C NMRスペクトルの取得のために使用しました。三重共鳴ヘリウム冷却逆（TCI）の5mmプローブおよび500.20 MHzおよび1 Hおよび13 Cのための125.77 MHzで動作する分光計を備え、それぞれ、850.23 MHzおよび1 H及び13の C核用213.81 MHzで動作する分光計、核は、それぞれ、観察広帯域装備（BBO）の5mmプローブを窒素で冷却しました。全ての実験は、25±0.1ºCで実施し、スペクトルは標準のNMRデータ解析取得および処理ソフトウェアパッケージで処理した（材料リストを参照）。
- NMRスペクトルを取得するための準備
注：1 H及び13 C NMRスペクトル楽器からサンプルを取り外すことなく、結果的に取得することができます。- （材料リストを参照してください）スピナータービンにNMRチューブを挿入します。
- スピナーと段階的深さゲージの上にチューブを配置し、その底部がゲージの底部に接触するまで穏やかにチューブの上部を押してください。
- SampleCaseのオープンスポットにNMRサンプルを置きます。試料が中に配置されたスロット番号をメモ。
- NMRでサンプルをロードするには、＃はあなたのサンプルを保持SampleCaseのスロットである制御コンピュータとタイプ「SX＃」に戻ります。
- ロックウィンドウ画面に表示されるようにCDCl 3中の重水素信号を待ちます。それが自動的に表示されない場合は、タイプ「lockdisp」。できるだけ早く重水素信号が表示されているように、型は、コマンドライン上に「ロック」とのCDCl 3重水素共鳴を使用してサンプルをロックするために、溶媒のリストから「CDCl 3中」 を選択します。
注：重水素秒以前のユーザーが別の溶媒を使用した場合ignalが表示されない場合があります。ユーザーは、ロック、サンプルがダウンしていることを示すインジケータを待つ必要があります。 - スピニングがアクティブでないことを確認するには、コマンドラインで「bsmsdisp」と入力します。 「SPIN」ボタンが緑色の場合は、回転を無効にし、それをクリックします。
- 新しいデータセットを作成するには、「新しい」コマンドを入力します。 「NAME」タブと「EXPNO」タブの実験番号に設定されているデータの名前を入力します。 「PROCNO」タブで番号「1」を使用してください。 「実験」タブで、「選択」と「プロトン」パラメータファイルを選択ヒット。 「TITLE」タブでは、実験のタイトルを書きます。 "OK" をクリックします。
- 現在のNMRプローブと溶媒のための標準的なパラメータを得るために、コマンドラインで「getprosol」と入力。
- 13 Cを繰り返しステップ2.1.7、1D 13 C逆Gについては、「実験」タブの「C13IG」パルスシーケンスを選択しますatedは実験をデカップリング。
- 現在のNMRプローブと溶媒のための標準的なパラメータを得るために、コマンドラインで「getprosol」と入力。
- 炭素およびプロトン核の両方のためのプローブの自動チューニングとマッチングを実行するコマンド「アートマ」と入力します。
- NMR信号に対して高度に均一な磁場を達成するために、シミング一次元勾配、ひいては最適線形状を行います。
- 単に順次実行することにより、1Dシミングのための標準的な自動処理を使用するコマンド「QU topshim 1dfast SS」、「QU topshim tunebのSS、」コマンドラインの「QU topshimレポート」。
- パラメータの最適化
- 90°パルスのキャリブレーション
- 1 H（ステップ2.1.7と2.1.8を参照）用の新しいデータセットを作成します。
- 90°PULを較正するための自動化プログラムを開始するには、コマンドラインでコマンド「paropt」と入力SE。パラメータを変更するよう、パルス期間、P1を選択します。
- P1の初期値として「2」マイクロ秒で起動し、入力して「2」増分をμsの「16」実験を行います。
- 13 Cのための新しいデータセットを作成する（ステップ2.1.9を参照）、13個の C核（ステップ2.2.1.2および2.2.1.3を参照）の処理を繰り返します。
- 1 Hためにヌル方法16により測定さT 1測定
注：ヌル方法は、180°パルスは、z軸と観察横磁化を作成し、最終的な90°パルスに沿って緩和を可能にするために、遅延（ タウ ）に従うからなる、反転回復パルスシーケンスを使用します。- 1 H（ステップ2.1.7と2.1.8を参照）用の新しいデータセットを作成します。
- 反転回復実験にパルスシーケンスを変更するには、「pulprogのt1ir1d」と入力します。
- commanで次のコマンドを入力します、ppmでRF送信機の中心をスペクトル幅を設定するd線、スキャン数ダミースキャンの数とデータポイントの数が「SW 8」、「o1p 3.8」、「NS 2」、「DS 2" と "TDの64K"。
- 180°パルスの型「P1（値）」とパルス較正によって決定されるように、90°パルスの継続時間値を入力する（ステップ2.2.1を参照）、タイプ「P2（値）」（180°の継続時間値パルスは2倍の90°パルス継続時間）です。
- 「D1 10」と入力して、非常に大きな値に例えば10秒リサイクル遅延を設定します。
- コマンドラインで「D7 10msの」を入力して、例えば10ミリ秒と短い値に設定されたタウ 、、。
- RGの自動計算のためのコマンド「RGA」を使用して適切な値に受信ゲイン（RG）を設定します。
- コマンド「ZG」と入力して、スペクトルを実行します。
- 「EFP」と入力してフーリエ変換を実行しますコマンドラインインチ
- コマンドラインでコマンド「APK」を入力して、自動位相補正を行います。追加の位相調整がさらにスペクトルを改善するために必要とされる場合には、位相補正モードに入るための「位相を調整」アイコンをクリックし、「プロセス]タブ、」をクリックしてください。
- すべての信号は、負の吸収モードになるまで、マウスをドラッグすることによってゼロ次（0）と一次（1）位相補正アイコンを使用します。位相補正モードを終了するには、「戻ると保存」ボタンをクリックすることにより、位相補正値を適用し、保存します。
- 全てのピークは、手順を繰り返して、正またはゼロにどちらかになるまでタウを増やし2.2.2.6-2.2.2.9。 T 1値を決定するために、単にピークがLN2とヌルさタウ値を割ます。
- 13 Cのためのヌル方法16により測定さT 1測定
- 13 Cのための新しいデータセットを作成する（ステップ2.1.9を参照）
- タイプ「pulprogのt1irpg」とは、炭素原子核のための反転回復実験にパルスシーケンスを変更します。
- 「SW 200」、「o1p 98」：ppmでのスペクトル幅、RF送信機の中心、スキャン数、ダミースキャンの数とデータポイントの数を設定するコマンドラインで次のコマンドを入力、 "NS 8"、 "DS 2" と "TDの64K"。
- 180°パルスの型「P1（値）」とパルス較正によって決定されるように、90°パルスの継続時間値を入力する（ステップ2.2.1を参照）、タイプ「P2（値）」（継続時間値が90°であります2を乗じたパルス継続時間）。
- 「D1 100」と入力して、非常に大きな値に例えば100秒リサイクル遅延を設定します。
- コマンドラインで「D7 100ミリ秒」を入力して、例えば100ミリ秒などの短い値に設定タウ 。
- receivでの設定RGの自動計算のためのコマンド「RGA」を使用して適切な値にERゲイン（RG）。
- コマンド「ZG」と入力して、スペクトルを実行します。
- コマンドラインで「EFP」と入力してフーリエ変換を実行します。
- コマンドラインでコマンド「APK」を入力して、自動位相補正を行います。追加の位相調整がさらにスペクトルを改善するために必要とされる場合、「位相を調整」アイコンとゼロ次（0）と1次相（1）補正用の位相補正アイコンをクリックします。
- ゼロ次および一次位相補正アイコンをクリックしながら、すべての信号は、負の吸収モードになるまで、マウスをドラッグ。位相補正モードを終了するには、「戻ると保存」ボタンをクリックすることにより、位相補正値を適用し、保存します。
- 全てのピークは、手順を繰り返して、正またはゼロにどちらかになるまでタウを増やし2.2.3.6-2.2.3.9。決定するT 1値は、単にピークがLN2とヌルさタウ値を割ます。
- 90°パルスのキャリブレーション
- 一次元（1D）NMRスペクトル
- 1 H-NMRスペクトル
- NMRデータの取得
- コマンドラインで「pulprog ZG」と入力して、ステップ2.1.7で作成した1つの Hデータセットに移動し、標準的な「パルス取得」パルスシーケンスを使用し、「ZG」。
- 90°のパルス角をppmでのスペクトル幅、RF送信機の中心、スキャン数、ダミースキャンの数、データポイントの数及びパルス持続時間を設定するコマンドラインに次のコマンドを入力： "SW 8"、 "o1p 3.8"、 "NS 2"、 "DS 2"、 "TDの64K"と"P1（パルス較正によって決定される）"（ステップ2.2.1を参照）。
注：32Kデータポイントは、500 MHz装置に使用することができます。 - コマンドラインで、それぞれ、「D1の7S」または「D1 9S」を入力して850 MHz装置500 MHz装置7つのSまたは9秒の緩和遅延を設定します。
- RGの自動計算のためのコマンド「RGA」を使用して適切な値に受信ゲイン（RG）を設定します。
- 改良されたベースラインスペクトルを取得する「digmod baseopt」と入力。
- コマンドラインでパルス取得コマンド「ZG」と入力して取得を開始します。
- NMRデータの処理
- ゼロフィリングを適用し、64Kに実際のスペクトルの大きさを設定するためにコマンドラインで「SIの64K」を入力。
- 変換前フーリエ0.3ヘルツの線広がり係数で重み付け関数（指数関数的減衰）を適用するために、コマンドラインに「LB 0.3」を入力して0.3 Hzにパラメータを広げるラインを設定します。
- コマンドで「EFP」と入力してフーリエ変換を実行しますライン。
- コマンドラインでコマンド「APK」を入力して、自動位相補正を行います。追加の位相調整はさらに、スペクトルを改善する上でクリックする必要がある場合、「プロセスタブ、」次に「位相を調整」アイコンとゼロ次（0）と一次（1）位相補正用の位相補正アイコンをクリック。
- ゼロ次および一次位相補正アイコンをクリックしながら信号の全てが正の吸収モードになるまで、マウスをドラッグ。位相補正モードを終了するには、「戻ると保存」ボタンをクリックすることにより、位相補正値を適用し、保存します。
- 「ABS nの」コマンドを入力して、統合時にベースライン補正のための多項式四次関数を適用します。
注：これは最小強度を持つ平坦なスペクトルのベースラインを確保します。 - TMS（δ= 0）からのppmで化学シフトを報告します。キャリブレーションをクリックします（「キャ。アックス『"）のアイコンが、0に最も近いピークTMS NMR信号（）の上に赤い線にカーソルを置き、左クリックと入力し、』0を。
- NMRデータ解析
- 「統合」アイコン（「プロセス」タブの下）とハイライトを使用して5.05とδ5.81δ、δ4.98でピークと同様、0.6〜δ1.1δからアイコン（「新しい地域の定義」）スペクトル領域を統合します。積分を通じてクリックしてドラッグを残しました。
注：地域に焦点を当てる必要がある場合は、無効にし、左クリックや地域にズームインするには、マウスをドラッグしてハイライトアイコンをクリックしてください。必要であれば、閾値強度を調整するには、マウスの中央ボタンを使用します。次のピークに移動し、その後、統合機能をアクティブにするために、再びハイライトアイコンをクリックしてください。- 表示された積分値を右クリックして100に上記の積分の合計を正規化sの信号の下と「積分の総和を正規化する」を選択します。入力ボックスに値「100」とは、統合モードを終了するには「戻ると保存」をクリックしてください。
- 内部標準としてBHTを使用する場合、δ6.98にピークを統合し、ストック溶液0.5ml当たりBHTのミリモルに等しい積分を設定します。
- 可能な場合、ピークの各側から10ヘルツを延びる（ステップ2.3.1.3.1を参照）、目的のピークを統合します。
- 同様に13 C-NMRスペクトルの取得および処理を実行するように進みます。
- 「統合」アイコン（「プロセス」タブの下）とハイライトを使用して5.05とδ5.81δ、δ4.98でピークと同様、0.6〜δ1.1δからアイコン（「新しい地域の定義」）スペクトル領域を統合します。積分を通じてクリックしてドラッグを残しました。
- NMRデータの取得
- 13 C-NMRスペクトル
- NMRデータの取得
- 13 Cデータセットに移動し、コマンドラインで「pulprog zgig」を入力して、逆ゲーテッドデカップリングパルス系列、「zgig」を使用します。
注：標準ブロードバンドdecouとカーボン実験を実行するにはPLEDパルスシーケンスは、コマンドラインでタイプ「pulprog zgpg」。 - 90°のパルス角をppmでのスペクトル幅、RF送信機の中心、スキャン数、ダミースキャンの数、データポイントの数及びパルス持続時間を設定するコマンドラインに次のコマンドを入力： "SW 200"、 "o1p 95"、 "NS 16" "DS 2"、 "TDの64K" と "P1（パルス較正によって決定される）"（ステップ2.2.1.4を参照）。
- コマンドラインで、それぞれ、「D1の35S」または「D1 45S」を入力して850 MHz装置500 MHz装置35秒または45秒の緩和遅延を設定します。 BHTを使用する場合、緩和遅延は850 MHz装置500 MHz装置で50秒および60秒であるべきです。
- RGの自動計算のためのコマンド「RGA」を使用して適切な値に受信ゲイン（RG）を設定します。
- wのスペクトルを取得するためにコマンドラインで「digmod baseopt」と入力i番目の改善ベースライン。
- コマンドラインでパルス取得コマンド「ZG」と入力して取得を開始します。
- 13 Cデータセットに移動し、コマンドラインで「pulprog zgig」を入力して、逆ゲーテッドデカップリングパルス系列、「zgig」を使用します。
- NMRデータの処理
- ゼロフィリングを適用し、64Kに実際のスペクトルの大きさを設定するためにコマンドラインで「SIの64K」を入力。
- 変換前フーリエ変換1.0ヘルツの線広がり係数で重み付け関数（指数関数的減衰）を適用するために、コマンドラインに「LB 1.0」を入力して1.0 Hzにパラメータを広げるラインを設定します。
- コマンドラインで「EFP」と入力してフーリエ変換を実行します。
- コマンドラインでコマンド「APK」を入力して、自動位相補正を行います。追加の位相調整はさらに、スペクトルを改善する上でクリックする必要がある場合、「プロセスタブ、」次に「位相を調整」アイコンとゼロ次（0）と1次相（1）補正用の位相補正アイコンをクリック。
- コマンドラインでコマンド「ABS n」を入力して積分時ベースライン補正のための多項式四次関数を適用します。
- TMS（δ= 0）からのppmで化学シフトを報告します。キャリブレーション（「キャ。軸」）アイコンをクリックし、そして参照されるNMR信号の上に赤い線にカーソルを置きます。 「0」で左クリックとタイプ。
- NMRデータの取得
- NMRデータ解析
- （「プロセス」タブの下）「統合」アイコンやハイライトを使用して171〜δ175δからアイコン（「新しい地域の定義」）スペクトル領域を統合します。積分を通じてクリックしてドラッグを残しました。
注：地域に焦点を当てる必要がある場合は、無効にし、左クリックや地域にズームインするには、マウスをドラッグしてハイライトアイコンをクリックしてください。次のピークに移動し、その後、統合機能をアクティブにするために、再びハイライトアイコンをクリックしてください。- 信号の下に表示された整数値上で右クリックをすることによって100に積分を設定し、「インテグラ現在のキャリブレーション」を選択します。入力ボックスに値「100」とは、「戻ると保存」をクリックし、統合モードを終了します。
- 内部標準としてBHTを使用する場合は、δ151.45のピークを積分し、積分に等しい設定ストック溶液0.5ml当たりBHTのミリモル。
- ピークの各側から5ヘルツを拡張関心のピークを統合する（ステップ2.3.2.3.1参照）。
- （「プロセス」タブの下）「統合」アイコンやハイライトを使用して171〜δ175δからアイコン（「新しい地域の定義」）スペクトル領域を統合します。積分を通じてクリックしてドラッグを残しました。
- 1 H-NMRスペクトル
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Representative Results
1 H及び13の C NMRスペクトルは、二つのNMR機器を用いて、市販の魚油サプリメントのために収集しました。 850 MHzおよび500 MHzの分光計。これらのスペクトルは、ドコサヘキサエン酸（DHA）とエイコサペンタエン酸（EPA）、例えばNなどのn -1アシル鎖及び栄養的に重要な指標として、他の化合物などの魚油の成分の定量的決意のために使用することができる-6 / N比-3。定量も内部標準を使用せずに行うことができるが、定量的な結果は、相対モルパーセントとして表現されなければなりません。データは、絶対値（MG / g）に発現する必要がある場合、内部標準が必要とされています。 NMRにより得られた結果は、Tに依存して、1つの H NMR分析のために0.3％から13 C NMR分析のために、2％及び0.5％〜2.5％の範囲の相対標準偏差（RSD）を有する高度に再現可能です彼は、脂質。プロトンスペクトルは、分析の精度に影響を与える、過密になる傾向があるので、1 H NMRのためにわずかに高いRSDは、多くの場合、特に雑音比（S / N）の低い信号を有する共鳴するため、観察されました。非常に良好な一致が850 MHzおよび1％から4％の範囲の相対標準偏差（RSD）と500 MHzの機器との間で見出されました。特に、n -1 個のアシル鎖として低濃度で現れる化合物について、1 Hおよび13 Cによって得られた結果を比較した場合（8％まで）比較的高い相対標準偏差（RSD）が観察されました。 NMR分光法は、以前に、いくつかの魚の油成分の決意を含む脂質分析のためのツールとして確認されています。結果は、そのようなGC 17、18のような伝統的な方法、とよく一致することを示しました。
1つの H NMR分析
"xfigのは">図1（A）850 MHzおよび（B）500 MHz装置で取得した1 H NMRスペクトルを比較します。 850 MHzのスペクトルは、より高い分解能によって特徴付けられる、DHA、EPA、およびn -6 / Nを含む魚油のが主要な成分-3比も500 MHzのスペクトルから決定することができます。魚油の1つの H NMRスペクトルの完全NMR割り当ては他の場所で19見つけることができるのに対し、定量目的のために使用され得る魚油脂肪酸の1 H-NMRシグナルは、 表1に示します。
1 H NMRは、n -3の総量の定量のために信頼性の高いデータが得られ、N -6、DHA、 トランス脂肪酸、N -1アシル鎖、および飽和脂肪酸（SFA）。 1 H NMR分析のために、適切な関係を使用することは、Sの最もために必要とされますignalsは異なる脂肪酸および脂質に共通するプロトンのグループに属しています。そのため、ほとんどの場合、魚油中の脂肪酸の濃度が適切な関係に組み込まれた、唯一の様々な1つの H NMR信号の組み合わせによって決定することができます。加えて、これらの方程式は、各グループに関連付けられたプロトンの異なる数を正規化演算の係数を含みます。内部標準を使用した場合、次式が考慮されるべきである：C = I / Iは ×N IS / N は 、Cは、魚油のMG / gの中の分析対象物の濃度である×A×MW / M（1）、IS 私は内部標準に固有に属するプロトンシグナルの面積であり 、一意に関心の脂質に起因する共鳴の積分であり、Nは分析される官能基のプロトンの数であり、n は、分析のために使用される内部標準のプロトンの数であり、Aは、内部標準のミリモルであり、MWは、（メチルエステルで表される）脂肪酸の分子量であり、そしてmは、魚油の量でありますgで表さ。
実施例1、DHA：DHAの比率は、I DHAは、DHAのHαとβHプロトンに属する2.39δの信号の積分である式C DHA =¾I DHA / S、およびSによって決定されますSFAのメチルプロトンの積分の和、N -6、-9 N、N -3、 トランス脂肪酸プラス5.05およびδ5.81δδ4.98のN -1アシル鎖のピークの積分です。一体型I DHAはノーマですそれは4つのプロトンに対応しているため、積分Sが 3つのプロトンに相当し、一方3/4を乗じlized。 1 H NMRは、グリセロール主鎖上の脂肪酸の位置分布に関する情報を与えることが可能ではないので、唯一の脂肪酸の合計量の定量のために使用することができます。カプセル化された魚油サプリメントの1つの H NMR分析は、DHAの10.5％から成ることを示しました。 BHTを使用して、同じ試料中のDHAの濃度は、105.23ミリグラム/ gでした。これらの値は、13 C NMR（13の C分析のため実施例2を参照）を用いて得られた値に非常に近いです。
実施例2 n -1 個のアシル鎖：n -1 個のアシル鎖の濃度は、関係Cによって与えられるN-1 = 3 I N-1 / S、I N-1は 5.818δの信号の積分です。この信号は、1つのプロトンに対応し、従って3を掛けることによって正規化される必要があります。 BHTを使用して、N -1アシルとき鎖が式C N-1 = 2 I N-1 / I BHTによって決定されます。 n -1 個のアシル鎖のMWが不明であるため、結果は、Mg / gで表されることができません。
（実施例3）、N -6 / N比-3：この重要な指標は、nのビス-アリルプロトン-6アシル鎖（2個のプロトン）に対応するδ2.77における共鳴の正規化された強度の比から計算することができます。 -3 nに脂肪酸を属し、3つのプロトンに対応δ0.97におけるトリプレットを超えます。関係は、C N-6 / C N-3 I A及びI Bは、信号の積分され= 3/2 I A / I B、ありますそれぞれ2.77およびδ0.97、δで。 N -6脂肪酸は、関係Cの N-6 = 3 / 2I N-6 / S、Iは、n-6 2.77δのビス-アリルプロトンの積分であるから決定されます。
（実施例4）、 トランス脂肪酸： トランス脂肪酸は、I トランスは 0.91δの信号の積分である式C = I トランス トランス / S、から計算することができます。 850 MHz装置を用いて、1 H NMRによって決定されるように、本サンプルは、 トランス脂肪酸3.07％を含有していました。 500 MHz装置で分析した同じサンプルは、 トランス脂肪酸の3.03パーセントを含有することが分かりました。
（実施例5）、飽和脂肪酸（SFA）：SFAの濃度はCalculがあってもよいですC N-3 - - C N-6 - C N-9 - C N-1 - C トランス式C SFA = Sからated。 Qが Nのアリルプロトンの積分である/ S、 - N -9脂肪酸（主としてオレイン酸）は、式C のn-9 =（3/2 I N-6 3/4 Q）に応じて定量することができます-6およびn -9δ2.01に。市販の魚油試料中のSFAの量は36.1％であることが分かりました。 13 C NMRで分析し、同じ試料を33.8パーセントSFAを含有することが判明しました。魚油は、Mg / gで表されることができない場合SFAは、異なるMWので、それらの濃度を有する種々のFA（ 例えば、ステアリン酸およびパルミチン酸）の基を表します。
（実施例6）、総ステロール： 総ステロール（遊離およびエステル化）の量は、SIGによって決定することができます式C = Iの STE / Sを使用して、0.68δに現れる炭素18でのメチルプロトンのNAL。市販の魚油試料中の総ステロールのモル比は0.32パーセントであることが分かりました。 BHTはまた、ステロールの絶対濃度の決意のために使用することができます。魚油中の主要ステロールは、コレステロール及びビタミンD（またはその前駆体7-デヒドロコレステロール）であり、しばしばサプリメントに添加されます。これらの化合物は、非常によく似たMWを持っています。したがって、結果は、次式に従ってMG / Gで表すことができると計算されるC = 2/3 Iの STE / Iは、MWのSTEを構成するコレステロールの分子量（386）であり、×MWのSTE / mは 、IS魚油20におけるステロール画分の大多数。 BHTを使用して、同じサンプル中のステロールの量は、魚油の3.8ミリグラム/ gでした。コレステロールの個々の決意（δ （δ0.678）は、解像度向上のための窓関数の適用後850 MHz装置で実現可能です。
13の C NMR分析
図2（A）850 MHzおよび（B）カルボニル炭素領域500 MHz装置で取得された13 C NMRスペクトルを示します。 2つのスペクトルは非常に類似しており、同量の情報を提供することができます。 13 C NMRスペクトルは、正常例えばステアリドン（SDA）およびエイコサテトラエン（ETA）酸などの追加の脂肪酸の分析のために使用することができ、しかしより多くのスキャンは、これらの酸は、低濃度にされたサンプルのために必要とされます。 13 Cスペクトルは大きいため、スペクトル幅及びブロードバンドデカップリングのアプリケーション、高解像度によって特徴付けられますスカラーカップリングの影響を排除し、シングレットを生成します。 500 MHz装置を用いた場合であってもこのような理由から、限られた重複があります。
13 C NMRスペクトルは、1つの H NMRスペクトルと比較して、はるかに有益であり、より少ない信号の重複が観察されているため、より包括的な定量的データを提供することができる（ 図1及び2）。それは脂肪酸の多数のために、ならびにグリセロール骨格19、21、22上のそれらの位置分布についての定量的情報を提供するため、13 Cスペクトルの最も有用なスペクトル領域は、カルボニル炭素領域です。 14.5δからメチル基領域13.5は、n -3の総量の迅速決意するために使用される、N -6、N -9および脂肪を飽和させることができるδします酸（SFA）、だけでなく、 トランス脂肪酸。しかし、500MHzのNMR分光計では、Nの部分的重複-6およびn -9飽和脂肪酸（SFA）があります。 850 MHzの機器が一層信頼オプションと見なされるが、解像度向上のための窓関数の適用は、この問題を解決することができます。オレフィンNの総量のために使用することができるカーボンスペクトルの領域-3およびn -1例えばDHA、EPA、アラキドン酸（AA）、リノレン（LN）nは個々の脂肪酸の決意のためのアシル鎖ならびに-3、およびオレイン酸（OL）（ 表2参照 ）。 13 C NMRはまた、14.31（メチル）δの炭素信号を用いてエチルエステル（EE）に富むサプリメントのような他の供給源から魚油の特徴付けおよびδ60.20（メチレン）に適用することができます。
炭素分析のために、脂肪酸はdetermすることができ一般的な関係C = I / S（2）によれば、すべてのアシル鎖の全積分で適切な脂肪族、オレフィン、カルボニルシグナルの積分を分割することによりINED、Cはモル中の分析物の濃度である（％ ）、I一意関心の脂質に起因する共鳴の積分であり、Sは試料の総脂質含有量を表す信号（S）の全積分です。アシル鎖の全積分Sは、171をδ175δの領域を積分することによって決定することができ、100に設定されています。
魚油のMG / gの中の脂肪酸の定量は、以下の関係に基づいて、内部標準を用いて行われる：C = I / I C は中の分析物の濃度である×A×MW / M（3）、IS MG / G魚油、I一意関心の脂質に起因する共鳴の積分であり、Iは、内部標準に固有に属する炭素信号の面積であり 、Aは 、内部標準のミリモルであり、MWは分子量であります関心対象の化合物の重量（脂肪酸メチルエステル中で発現するために）、およびmは Gで魚油の量です。 13 C NMRスペクトルの完全NMR割当てが他の場所19見つけることができるのに対し、定量目的のために使用され得る魚油脂肪酸の13 C-NMRシグナルは、 表2に示します。
実施例1は、SNにおけるEPA -2位置：SNに対するEPAの量（％）-2位置はSによってδ172.56における信号の積分を割ることによって計算されます。 CO中のSn -2位置でのEPAの量mmercially利用可能な試料は850 MHz装置を用いて3.4％であることが見出されました。内部標準と同じ分光計およびBHTを使用して、SN -2位置でのEPAの量はMgで表さ/魚油のGは29.73ミリグラム/ gです。 500 MHz装置で分析し、同じ試料を3.6％又はSNにおけるEPAの31.39ミリグラム/ gの-2位置を含むことが見出されました。 SNにおけるEPAの相対分子比を計算するとき-2完全デカップリングスペクトルを用いて同様の結果を得ることができます。 EPAのカルボニル炭素を基準として使用される他のカルボニル炭素、同じ無視できる程度にプロトンデカップリングの影響を受けているためです。定量のために使用される151.45δでBHTの炭素は、脂肪酸のカルボニル炭素と比較して異なるNOE強調を受けるので、BHTを使用した場合しかし、大きな偏差が観察されます。そのため、完全に切り離さスペクトルは、内部標準を使用するか、Cを統合する際に避けるべきです異なる多重度とarbons。
（実施例2）、DHAの合計量： DHAの合計量（％）は、単に、それぞれ172.48およびδ172.08、δでNMR信号によって決定されるSN -1,3-およびSn -2位置にDHAの量を加算することによって計算されます。 1 H NMRで分析し、同じ試料（1つの H解析の実施例1を参照）13 C NMR分析によると10.3％DHAを含有することが判明しました。 DHAの量は、内部標準および式3 DHAの合計量は、103.25ミリグラム/ gであったを使用して、MG / Gで表すことができます。
（実施例3）、SDAの合計量：総量（％）SDAのは、δ172.99での信号の積分値を加算することによって決定され、δ172.60 -1,3- SN位置にSDAのカルボニル炭素に属しSN -2、それぞれ、次にSによって和を割ます。分析試料は、3.93パーセントのSDAまたは34.54ミリグラム/グラムを含有することが見出されました。
実施例4、N -3 Lnは：N -3のLn（％）は、積分Sとδ131.85における信号の積分を割ることによって決定することができます。分析魚油試料中のn -3のLnのモル比は0.7％でした。 BHTを用いた絶対濃度が5.5ミリグラム/ gと計算されました。
（実施例5）、 トランス脂肪酸： トランス脂肪酸のモル比をSとδ13.80での信号の積分値を除算することによって決定されます。 1 H NMRで分析し、 トランス FA 3.07％であった同じサンプルの分析は、また、13 C NMRで分析し、そのトランス脂肪酸含量は3.42パーセントであることが分かりました。 T500 MHz装置で同じ試料の13 C NMR分析彼はトランス脂肪酸の3.64パーセント含有量を示しました。魚油のモル/ gでトランス FAの量は、内部標準としてBHTを用いて決定することができ、式C = I / Iは、結果は13.80δのピークためMG / gで表されることができないが、×A / m で異なるMwを有する、種々のトランス脂肪酸、主にトランス DHAおよびトランス EPAに対応します。
実施例6、EE： 魚油試料中のEEの濃度はSで、種々の脂肪酸のEEのメチレン炭素に相当する、60.00δする60.50δからのスペクトル領域の積分を割ることによって計算されます。 EE魚油試料の分析は、それが100％EEから成ることを示しました。なお、EEサンプルでは、EPAのCADHAは、60.31及び/又は173.09δの信号δの信号を用いて算出することができるのに対し、N、173.60δで又は60.20δのメチレンEE炭素によってカルボニルピークのいずれかによって算出すること。
この分析のために使用することができる方程式の詳細な説明を見つけることができるのに対し、13 C及び1回の H NMR分析で定量目的のために使用することができる診断信号の完全なリストは、それぞれ、 表1および表 2に見出すことができます他の場所で19。
NMRは、さらに魚油サプリメントの酸化状態の評価のために適用することができます。 図3は、2つの酸化条件下魚油試料の1つの H NMRスペクトルを比較します。紫外線への加熱と露光の露光（UV）光。脂質酸化は複雑なプロセスであり、そして酸化生成物の組成は、酸化の条件によって異なります。主な酸化生成物は、ヒドロペルオキシド（δ8.0から8.8）、共役ジエンヒドロペルオキシド（δ5.4から6.7）、および（9.0- 10δ）アルデヒドです。
図1。 1 H NMR分析。 850.23（A）および500.20 MHzの（B）のCDCl 3溶液中の魚油サプリメントの1 H-NMRスペクトル。彼らの決意のために使用することができるEPAとDHAのNMR信号が示されています。 δ0.97におけるピークは、n -3脂肪酸の総量の決意のために使用することができます。それはすべての脂肪鎖のメチレンプロトンに属するようδ1.39から1.20でエンベロープは、トリミングされSとは、任意の同定または定量の目的のために使用することができません。 1 H NMRスペクトルは、13 C NMRスペクトル、したがって、より低いスペクトル分解能によって比べ狭いスペクトル幅（SW）によって特徴付けられます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。 13の C NMR分析。 213.81（A）および125.77 MHzの（B）カルボニル炭素領域内のCDCl 3溶液中の魚油サプリメントの13 C-NMRスペクトルです。 SN -1,3-およびsn -2位のEPAとDHAのNMR信号が示されています。これらの信号は、EPAとDHAの定量決意のために使用することができます。 SPEが、213.81 MHzで記録CTRAは、より高い解像度と感度によって特徴付けられる、125.77 MHzのスペクトルはまた、主要な化合物の決意のために使用することができます。 13 C NMR実験におけるデカップリングの適用は、炭素と水素原子核との間のスカラーカップリングの影響を排除し、従って信号は1 H NMRスペクトルに比べて簡単な分析を行うシングレットとして現れます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。 魚の油酸化。酸化魚油の1つの H NMRスペクトルは、酸化条件に依存します。ヒドロペルオキシド（δ8.0から8.8）、Cに起因する共鳴onjugatedジエンヒドロペルオキシド（δ5.4から6.7）、およびアルデヒドが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| δppmの | プロトン | 化合物 |
| 0.677 | CH 3（18） | コレステロール |
| 0.678 | CH 3（18） | 7-デヒドロコレステロール |
| 0.88 | CH 2 CH 3（t）は、Jのω1、ω2= 7.27ヘルツ | nは -9、SFAアシル鎖 |
| 0.883 | CH 2 CH 3（t）は、Jのω1、ω2= 7.08ヘルツ | N -6アシル鎖 |
| 0.911 | CH 2 CH 3（t）は、Jω; 1、ω2= 7.65ヘルツ | トランスアシル鎖 |
| 0.973 | CH 2 CH 3（t）は、Jのω1、ω2= 7.63ヘルツ | N -3アシル鎖 |
| 1.25 | CH 2 CH 3（t）は、J = 7.20 Hzの | エチルエステル |
| 1.697 | OCOCH2CH 2（t）は、J Hの α、Ηβ=ヘルツ | EPAのアシル鎖 |
| 2.391 | OCOCH 2 CH 2（T） | DHAアシル鎖 |
| 2.772 | CH = CHCH 2 CH = CH | N -6アシル鎖 |
| 2.81 | CH = CHCH 2 CH = CH | N -3アシル鎖 |
| 3.593 | 3'A-CH 2 OCO | 1-MAGのグリセロール |
| 3.722 | 3'A、3217; B-CH 2 OCO（BR） | 1,2-DAGのグリセロール |
| 4.073 | 2'-CHOH（BR） | 1,3-DAGのグリセロール |
| 4.121 | CH 2 CH 3マルチプ | エチルエステル |
| 4.173 | 1'B、3'B-CH 2 OCO（DD） | 1,3-DAGのグリセロール |
| 4.238 | 1'A-CH 2 OCO（DD） | 1,2-DAGのグリセロール |
| 4.329 | 1'B-CH 2 OCO（DD） | 1,2-DAGのグリセロール |
| 4.989 | -CH = CH 2、シス （DD） | n-1はアシル鎖 |
| 5.052 | -CH = CH 2 トランス （DD） | n-1はアシル鎖 |
| 5.082 | 2'-CHOCO | 1,2-DAGのグリセロール |
| 5.268 | 2'; -CHOCO | タグのグリセロール |
| 5.436 | CH = CHCH 2 CH = CH 2 | n-1はアシル鎖 |
| 5.818 | -CH = CH 2 | n-1はアシル鎖 |
表1：1 H NMRスペクトルの割り当て。ザ・ 魚油脂肪酸の1 H-NMR化学シフトをCDCl 3溶液中で定量化目的に使用することができる信号が提示されています。化学シフトはppmで測定され、核の化学的環境についての情報を提供しています。
| δppmの | 炭素 |
| 173.24 | C1 SFA（SN -1,3） |
| 172.21 | C1 OL、LO（SN -1,3） |
| （-1,3 SN）C1のETA | |
| 173.13 | C1 DPA（SN -1,3） |
| 173.03 | C1 SDA（SN -1,3） |
| 172.97 | C1 EPA（-1,3 SN） |
| 172.73 | C1のETA（SN -2） |
| 172.69 | C1 DPA（SN -2） |
| 172.61 | C1 SDA（SN -2） |
| 172.56 | C1 EPA（SN -2） |
| 172.48 | C1 DHA（SN -1,3） |
| 172.08 | C1 DHA（SN -2） |
| 136.8 | Cω1、nは -1 |
| 131.85 | Cω3LN |
| 130.37 | C15 AA |
| 130.11 | C9 LN |
| 130.06 | C13 LO |
| 129.54 | C5 DHA SN -2 |
| 129.47 | C5 DHA SN -1,3- |
| 128.94 | C5 EPA |
| 128.76 | C6 EPA |
| 128.45 | C17 のn -3 |
| 127.71 | N -3 |
| 127.53 | C4 DHA SN -2 |
| 127.5 | C4 DHA SN -1,3- |
| 126.86 | Cω4、全てのn -3 |
| 114.71 | Cω2、nは -1 |
| 60.08 | DHA、 エチルエステル |
| 59.96 | EPA、 エチルエステル |
| 59.95から59.85 | 他のFA、 エチルエステル |
| 33.48 | C2 EPA SN -2 |
| 33.32 | C2 EPA SN -1,3- |
| 31.44 | C3 のn -1 |
| 27.05 | アリルN -6 |
| 26.49 | C4 EPA SN -1,3- |
| 26.47 | C4 EPA SN -2 |
| 24.6 | C3 EPA |
| 24.48 | C3 SDAのSN -1,3 |
| 24.44 | C3 SDA SN -2 |
| 14.27 | Cω1、全てのn -3 |
| 14.13 | Cω1、SFA |
| 14.11 | Cω1、OL |
| 14.07 | Cω1、LO |
| 13.8 | Cω1、 トランス FA |
表2：13 C NMRスペクトルの割り当て。定量パープのために使用され得る魚油脂肪酸信号の13 C-NMR化学シフトCDCl 3溶液中のOSが提示されています。
補足図S1：13 C NMRスペクトルの比較は、標準的なブロードバンドデカップリング（A）及び（B）パルスシーケンスをデカップリングゲーテッド逆を使用して取得しました。スペクトルは、スキャンの同じ数で同じ試料について記録同じ処理パラメータで処理され、同一のスケールファクタを用いて示されました。 この図をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
トラブルシューティングのための変更と戦略
スペクトル品質 。 NMR信号の線幅及びNMRスペクトルの分解能は、従って、磁場の均一性を最適化するためのプロセスである、シミングに大きく依存します。ルーチン分析のために、1Dシミングが適切であると3Dシミングは、それが定期的にNMR員によって行われることを考えると、必要とされません。そうでない場合、3Dシミングは、H 2 Oの0.6 mLを含む試料を用いて分析前に実行されなければならない：D 2 O（90:10）。より良く、より速いシミングを達成するために、サンプルは、それが磁石のボア内に配置される前に、段階的な深さゲージを使用して、無線周波数（RF）コイルの励磁/検出領域の中心にする必要があります。シミングに影響を与える別の要因は、10~20ヘルツのスピン速度でサンプルを回転しています。このスピン速度でサンプルを回転すると、ラジアルシムを改善するが（X、Y、XY、XZ、YZ、X 2 -Y 2、 等 ）、それは、一般に、第1又は高次のスピニングサイドバンドの出現を避けるために推奨されません。 400 MHzのより低いラーモア周波数で動作楽器に取り組んしかし、スピニングは、1D NMR実験のために推奨されます。
解像度、ならびに感度は、受信機の利得（RG）値の影響を受けています。アナログ - デジタル変換器（ADC）の適切な原因オーバーフローより値が高いのに対し、受信機利得の低い値は、感度を低下させます。自由誘導減衰（FID）の最初の点が失われる可能性があるため、非対称のライン形状及び信号におけるADCオーバーフローの結果は、定量的な目的のために使用することができません。ほとんどの場合、コマンド「RGA」は、適切なRG値を算出します。しかし、いくつかのケースでは、ソフトウェアによって計算さRG値が理想値よりも高く、NMR信号のローレンツ形状の歪みがあります。にこのような場合、ユーザは、コマンドラインで「RG（値）」を入力して手動で入力小さいRG値すべきです。このプロトコルを用いて分析した試料のための典型的なRGの値は8です。
極低温で使用する場合、多くの場合、高い品質因子（Q因子）、最後のパルスと検出期間の間に大きな遅れ（むだ時間）> 200usとNMRプローブを冷却は、送信機の周波数を中心とこぶのようなアーチファクトを回避するために必要とされますそして、スペクトルのベースラインでの圧延。しかしながら、このような長い遅延も強い信号のベースの周りにベースライン圧延と大きなディップを導入することができる大きな負の一次位相誤差を引き起こします。小さな感度低下が23を発生する可能性があるが、これらの場合には、Z-回復スピンエコーパルスシーケンスは、大幅に改善ベースラインとNMRスペクトルを生成するために使用することができます。
リン脂質 。魚の油の分析に加え、トリグリセリドおよびエチルエステルの豊富なサンプルは、NMRは、リン（PLS）が豊富な魚油サンプルの分析のために使用することができます。 PLは、スペクトル分解能と感度の大幅な削減を引き起こす可能性が凝集体を形成するためしかし、特別なケアは、そのようなサンプルのために必要とされます。これらの試料の分析、重水素化クロロホルムの溶媒混合物について：メタノール（CDCl 3中：CD 3 OD）70:30の比では、高品質のスペクトルを得るために必要とされます。
内部標準 。それは、単純な1 H及び13 C NMRスペクトルを有する対称性の高い分子であり、そのピークのいずれも魚油成分のものと重複しないため、BHTは、この研究における内部標準として選択しました。信号で- BHTは6.97δにシングレットとして現れ、2つの等価な芳香族プロトン（OH基に対してパラ位置）に属する1つの H NMRスペクトルの信号を有します-OH基を有する芳香族第四級炭素に属する13 C NMRスペクトルにおいてδ151.45。これらの信号の両方は、魚油中の成分のいずれかとの重なりを持たないので、定量のために使用することができます。例えば1,2,4,5-テトラクロロ-3-ニトロベンゼン（TCNB）または塩化エチレンなどの他の化合物はまた、しかし、それらはより長いT 1値によって特徴付けられる、別の内部標準として使用することができます。
テクニックの制限事項
魚油サプリメント中の種々の脂肪酸および脂質の定量は、1Dスペクトルに適切な診断NMRシグナルの積分によって達成されます。このような信号は、特定の試料成分に属しているべきであり、他の化合物からの信号との干渉を有していてはなりません。 1 H NMRスペクトルは、低分解能によって特徴付けられるので、これは、CHEの短距離に1つの H NMR分析のための問題であってもよいですmical移行します。また、スカラーカップリングの存在（J）は多重を生成し、分析がより複雑になります。例えば、エチルエステル（EE）はδ1.25におけるメチル基の特徴的なトリプレット（J = 7.20 Hz）でエステル基のメチレンプロトンに属するδ4.12に多重で1 H NMRを用いて定量することができます。 850メガヘルツより低い周波数で動作ラーモアNMR機器を使用する場合しかし、1 H NMRを使用してEEの分析は、のTGの4.14との重複δピークと4.12δであるため、ピークの部分的な重複の回避すべきです1.23から1.35δで脂肪族のメチレンプロトンの幅広いシグナルとδ1.25のシグナル。大きな偏差はまた、いくつかのサンプルにおけるEPAの1 H及び13 C分析の間に観察され、13 C NMRは、Tによって提供される標識された組成物に近かったです彼はメーカー。これは、魚油サプリメントのいくつかの種類に表示される他の化合物の信号と、EPAの分析に使用されるδ1.69での信号の重複におそらくあります。内部標準を使用した場合の定量化における追加のエラーは、内部標準の不確か純度にし、計量中のエラーに起因することができます。
組成分析は、内部標準を使用せずに相対モル濃度で表すことができます。結果は、油量（mg / g）のグラムあたりの脂肪酸のミリグラムとして、例えば、絶対濃度で発現されることが必要な場合は、内部標準の使用が必要です。内部標準を用いた場合でもしかし、関心のあるNMR信号が異なる分子量を持つ複数の化合物に属している場合には、結果は、MG / gと表現することができません。また、内部標準の使用は、通常、最も一般的な内部のための分析の長さを増加させます例えばBHTのようtandardsは、長い緩和時間をもたらす高分子対称性を有する小分子です。反復時間（パルス間の遅延+捕捉時間）は、試料中の最長緩和時間T 1に応じて設定されているので、パルス間の長い遅延が必要とされるように、内部標準の使用は、実験の持続時間を増加させるであろう。これは、炭素核の非常に長いT 1緩和時間の13 C NMR分析のために特に重要な要素です。例えばCr（ACAC）3のような常磁性化合物の添加は、効率的にT 1緩和時間を短縮することができます。 CR（ACAC）3の推奨濃度は、溶液の0.75 mg / mlとなります。 CR（ACAC）3のより高い濃度は、T 1のさらなる低減のために考慮することができる、しかし、注意が原因線の広がりにS / Nの低下を回避するために必要とされます。
ntent "> 13 C NMRは、1つの Hと比較してはるかに高いスペクトル分解能によって特徴付けられるが、13 C NMR実験の感度が低いため、天然存在度（1.1％）および低い磁気回転比で有意に低い（67.26 10分析のために使用可能な油が限られている場合に増加するので6ラジアンS -1 T -1）13の C核の。また、13 Cの長いT 1緩和時間は、これは問題であり得る分析の長さを増加させますスキャン数は対雑音比合理的な信号を達成するために使用されるべきです。感度およびNMRスペクトルの分解能の限界は、GCのような他の技術を用いて分析することができる魚油に多くのマイナーな化合物の分析を妨げます。例えば、1ΗNMR 13 Cに対し、個々のステロール又は脂肪酸（ 例えばパルミチン酸およびステアリン酸）を分離することができませんδ173.24及びδ172.82で全飽和脂肪酸の信号と重なるようドデカン及びミリスチン酸のような魚油中に非常に低濃度で表示される化合物を、決定することができません。分析されるサンプルの量を増加させることが可能ないくつかのマイナーな化合物の分析を行いますが、注意は、その増加した粘度の、非常に集中したサンプルのために必要です。 S / Nの低下が原因低減スピン-スピンT 2緩和時間に起因する線の広がりにあるので、油の150以上のミリグラムを含有する非常に粘性の溶液は避けるべきです。加えて、パルス間の長い遅延があるため、より長いT 1の要求及びシミングで、したがって解像度でいくつかの問題が存在しています。
NMRと魚油に分析した全ての化合物は、任意の分離又は精製工程を使用せずに、1つのスナップショットで同時に定量することができます。 NMR AN13 C NMR収集を10分間継続一方、1つの Hスペクトルは、1分未満で記録することができるようalysisは急速です。データ取得時間に影響を与えるいくつかの要因があることに留意すべきです。具体的には、13 C NMRのために、10分間の実行時間は、内部標準を使用せずに達成され、RFコイルとプリアンプが冷却されるので、熱雑音が最小化された極低温冷却プローブの使用とすることができます。室温（従来の）プローブが使用される場合、実験時間の10~15倍の増加は、13の C NMR分析のために期待されるべきです。
既存の方法に対する意義
NMR分光法は、魚油サプリメントの組成の定性的および定量的決意のための強力なツールであることが証明され、そして、その迅速性のそれは広大なNUのハイスループットスクリーニングに適用される可能性を有しています魚の油試料のmber。信号領域が信号を引き起こす核の数に正比例するので、NMR分光法は、定義により、定量的方法です。急性毒性化学物質は、NMR試料を調製するために必要とされている間、サンプルを溶出するために溶媒を大量に必要とする他の方法とは対照的に、この化学物質（ 例えば、CDCl 3中）のような少量が使用されるので、この方法は、環境に優しいです。また、NMRは、他の分析方法に比べていくつかの利点を有します。標準とはキャリブレーションは、分析の前に必要とされない、任意の分離精製工程なしに最小限のサンプル調製は、通常、非常に高速な分析ツールNMRレンダリングされ、採用されています。また、13 C NMRは、グリセロール骨格上の種々の脂肪酸の位置分布を決定するために利用可能な最良の方法です。酵素加水分解は、代替として使用されてきたが、常に信頼できるものではありません= "外部参照"> 24。食品中の種々の脂肪酸の位置特異性を研究に大きな関心があるので、これは人間の食事25、26にその機能に影響を与えることが分かっているので、これは、特定重要です。
将来のアプリケーション
NMR分析及び製品のラベルだけでなく、GCとNMRの間の合意を示すいくつかの研究があるという事実との間の合意にもかかわらず、我々はより厳格かつ包括的な内実験室での研究は、NMRと伝統の間の契約を検討する必要があると信じていますサンプル、異なる起源の魚の石油製品のより大きな数を使用して、魚の油成分の分析のための方法論、および認定標準液。
魚油分析におけるNMRのもう一つの重要な将来のアプリケーションは、酸化生成物の決意となります。決意に加え魚油中の主要な化合物、例えばアルデヒドおよび過酸化物のような魚油中のいくつかの一次および二次酸化生成物は、存在しています。 図3に示すように、1 H NMRは、潜在的に、異なる酸化条件下、魚油サプリメントにおける酸化状態の評価に適用することができます。この分析における最大の課題は、NMRの割り当てと個々の酸化生成物の同定になります。 NMRハードウェアの感度の進歩はまた、13 C NMRを使用して、個々のステロールの同定を可能にします。 NMR分光法は、（HR-MAS）NMRスピニング高分解能マジック角を使用しても任意抽出することなく、全体として魚組織の分析のために適用することができます。
プロトコル内の重要なステップ
定量NMRスペクトルの精度に影響を与える最も重要なステップの二つは、90°パルスの選択とPUの間の遅延の使用を含みます小売り供給者≥5×T 1。パルス角は、計測試料に依存する較正NMRパラメータであるパルス幅に比例します。 90°のパルスが観察横方向（XY）磁化と縦（z）は磁化の完全な変換のために不可欠です。パルスキャリブレーションの前に、NMRを適切にチューニングして一致させる必要性を精査することを注意することが重要です。これは、サンプルへのRF電力の伝達を最適化するので、S / Nを最大化し、効果的なデカップリングを確保します。プローブのチューニングは、ほとんどの試料の誘電率によって影響を受けるので、サンプル間の濃度差がある場合、それぞれのチューニングプロセスを繰り返しています。 1D 13 C NMR実験はそれほど自動チューニング及びマッチングは、両方の核に必要な13 C及び1つの Hチャネルの両方を含みます。
5×T1より長いパルス間の遅延は、完全RECを保証しますその初期値への正味の磁化のオーヴェリー。スペクトル内のすべての共振が各パルスの前に完全にリラックスしていない場合、信号が部分的に抑制され、これは統合の不正確さにつながります。 T 1つの値は、実験の長さに影響を与える重要な要因であり、それは磁場強度、ならびにサンプルの粘度に依存します。サンプル間の粘度が類似していることを考えると、T 1緩和時間は、分析セッションの初めに各楽器のために決定されるべきです。
13 C NMRと魚油分析のもう一つの重要な特徴は、適切なパルスシーケンスの選択です。定量13 C分析のための最も信頼できる方法は、広帯域プロトンデカップリングは、取得期間中にのみ適用され、したがって、1〜13 Hからの分極移動がないデカップリング実験を、ゲーテッド逆であります核オーバーハウザー効果（NOE）を経由してC。完全に切り離さNMR実験は定量目的のために使用することができるが避けなければならない異なる多重メチル、メチレン、メタンとカルボニル炭素間従って積分比較と炭素間で異なるNOEの要因があるため、この実験を使用する場合しかし、注意が必要です。それにもかかわらず、同様の多重度および化学的環境の炭素のみを分析する際に考慮されている場合、完全に切り離さ方法が信頼性があります。この一例は、27をデカップリングした後、NOEの要因に有意差がないことが判明している脂肪酸のカルボニル炭素です。また、炭素担持プロトンため、完全に切り離さ実験起因NMR信号強度にNOE寄与に対してより高い感度を提供します。 2つのパルスシーケンスを用いて取得されたスペクトルとの比較を図S1に示されています。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、オハイオ州立大学の健康ディスカバリーテーマのための食品とオハイオ州立大学食品科学省によってサポートされていました。著者は、ペンシルベニア州立大学でオハイオ州立大学のNMR施設とNMR施設に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avance III 850 NMR instrument | Bruker | ||
| Avance III 500 NMR instrument | Bruker | ||
| TCI 5 mm probe | Bruker | Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N) | |
| BBO prodigy 5 mm probe | Bruker | Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P) | |
| Spinner turbin | Bruker | NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place | |
| Topspin 3.5 | Bruker | ||
| deuterated chloroform | Sigma-Aldrich | 865-49-6 | 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS |
| 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol | Sigma-Aldrich | 128-37-0 | purity >99% |
| Fish oil samples | |||
| NMR tubes | New Era | NE-RG5-7 | 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube |
| BSMS | Bruker | Bruker Systems Management System; control system device |
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