Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Здесь мы представляем метод для выражения и очистки S100A12 (calgranulin C). Мы описываем протокол для измерения его антимикробной активности против патогена человека H. pylori .

Abstract

Calgranulin белки являются важными медиаторами врожденного иммунитета и являются членами класса S100 семейства EF-hand кальцийсвязывающих белков. Некоторые белки S100 обладают способностью связывать переходные металлы с высокой аффинностью и эффективно изолировать их от вторжения микробных патогенов в процесс, который называется «иммунитет к питанию». S100A12 (EN-RAGE) связывает как цинк, так и медь и очень распространен в врожденных иммунных клетках, таких как макрофаги и нейтрофилы. Мы сообщаем об усовершенствованном методе для экспрессии, обогащения и очистки S100A12 в его активной конфигурации связывания металла. Использование этого белка в анализе роста бактерий и жизнеспособности показывает, что S100A12 обладает антимикробной активностью в отношении бактериального патогена Helicobacter pylori . Антимикробная активность основана на цинксвязывающей активности S100A12, которая хелатирует питательный цинк, тем самым истощая H. pylori, которая требует роста цинка и proliferation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Белки S100 представляют собой класс семейств кальцийсвязывающих белков семейства EF с разнообразным набором функций 1 . Они экспрессируются тканевым и клеточно определенным образом и регулируют широкий спектр клеточных функций 2 , 3 . Уникальные для кальцийсвязывающих белков белки S100 обладают как внутриклеточными, так и внеклеточными функциями 4 , 5 . Внутри клетки связывание Ca 2+ вызывает конформационное изменение, которое обнажает гидрофобную поверхность, которая специфически нацелена на белок-связывающие партнеры 6 . Этот внутриклеточный механизм регулирует важные процессы, такие как клеточная пролиферация, дифференцировка и энергетический обмен. Во внеклеточной среде белки S100 проявляют две функции 7 . В одном они действуют как связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP) белки и инициируют провоспалительныеИммунный ответ через взаимодействие с рецепторами распознавания образов 8 , 9 . Кроме того, некоторые члены S100 белкового класса секвестрируют переходные металлы, функцию, которая служит для голодания микробных патогенов в процессе, называемом питательным иммунитетом 10,11 .

S100A12 (также известный как кальгрунулин C и EN-RAGE) высоко экспрессируется в макрофагах и нейтрофилах и идентифицирован как потенциальный биомаркер воспалительных заболеваний 12 , 13 . В дополнение к связыванию кальция в его участках EF-Hand, S100A12 имеет два сайта связывания с высоким сродством переходного металла, расположенные на противоположных концах интерфейса 14 , 15 димера. Каждый сайт связывания состоит из трех остатков гистидина и одного остатка аспарагиновой кислоты и может содержать хелат цинка или меди <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Недавно мы сообщили, что S100A12-зависимое голодание от цинка играет важную роль в регуляции роста Helicobacter pylori и активности провоспалительных факторов вирулентности 18 .

H. pylori поражает желудок примерно у половины человечества; Что делает его одним из самых успешных бактериальных патогенов 19 . Инфекция H. pylori может привести к значительным исходам желудочно-кишечного тракта, включая гастрит, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфому, связанную с слизистой оболочкой (MALT), и инвазивную аденокарциному желудка (рак желудка). Рак желудка является ведущей причиной смертности от рака, связанного с некардиамой в мире, и единственным крупнейшим связанным фактором риска развития рака желудка является инфекция H. pylori .

H. pylori сохраняется в желудочной нише, несмотря на robuЙ иммунной реакции на патоген, что подчеркивает необходимость лучшего понимания иммунных механизмов борьбы с этой бактериальной инфекцией 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- ассоциированное воспаление характеризуется глубокой инфильтрацией полиморфноядерных клеток или нейтрофилов, которые отлагают репертуар антимикробных белков, включая S100A12, в месте заражения 18 , 24 , 25 . Стремясь понять сложный диалог между хозяином и возбудителем, мы стремились усовершенствовать методику очистки S100A12 и использовать ее для изучения антимикробного воздействия, которое она оказывает на этого с медицинской точки зрения патогена. В приведенном ниже протоколе описан усовершенствованный метод очистки S100A12 в его биологически активном состоянии; Способный связывать питательные металлы с высоким аффиниТи и хелатируя их от вторгающихся микроорганизмов. Кроме того, приведенные ниже методы подчеркивают полезность этого белка как критического реагента для изучения механизма, посредством которого врожденные антимикробные молекулы ограничивают рост бактериальных патогенов.

Белок семейства S100A получил признание как важная группа врожденных молекул иммунной системы, которые участвуют в иммунной передаче сигналов, а также в защите хозяина 27 . Наиболее хорошо изученными из них являются кальпротектин (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Кальпротектин представляет собой связанный с нейтрофилом белок, который образует гетеродимер субъединиц S100A8 и S100A9, который связывает переходные металлы на границе димера 31 . Было показано, что кальпротектин обладает двумя местами связывания металлов: участок 1 может связывать Zn 2+ , Mn 2+ или Fe 2+ , а сайт 2 может Связывают Zn 2+ 31 , 32 . Многочисленные сообщения показали, что кальпротектин обладает противомикробной активностью в отношении различных патогенных микроорганизмов, включая Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli и H.pylori , и что ингибирующее действие обусловлено хелатной активностью металлов 25 , 28 , 29 .

Предыдущая работа продемонстрировала, что капротектин проявляет многочисленные активности в отношении H. pylori, включая изменение структуры липида А во внешней мембране, подавление системы секреции cag-типа IV (которая является основным провоспалительным фактором вирулентности в H. pylori ), индуцируя образование биопленки и подавление Рост и жизнеспособность H. pylori в зависимости от дозыClass = "xref"> 25 , 33 . Кроме того, генетические и биохимические анализы показали, что антибактериальная активность кальпротектина против H. pylori в значительной степени обусловлена ​​его способностью связывать питательный цинк 25 . H. pylori нуждается в цинке, как это было определено предыдущими исследованиями, в которых использовалась химически определенная среда, чтобы определить потребности в микроэлементах, чтобы этот патоген мог расти и размножаться 34 . Кроме того, кальпротектин был очень распространен в тканях, зараженных H.pylori , и связан с нейтрофильными инфильтратами, что указывает на то, что хозяин может использовать кальпротектин в качестве антимикробной стратегии при инфицировании и последующем воспалении 25 , 35 .

Недавние данные, полученные в результате несвязанных методов скрининга протеомики, свидетельствуют о том, что в условиях, когда активные формы кислорода многочисленны, calprotecОлово подвергается посттрансляционным модификациям, которые изменяют сайт связывания гексагистидина, тем самым ингибируя металлосвязывающую активность белка 36 . Таким образом, мы предположили, что другие белки семейства S100A в широком репертуаре этих молекул могут потенциально выступать в качестве вспомогательных металл-хелаторов. Мы выбрали S100A12 для дальнейшего исследования, потому что он не был идентифицирован на вышеупомянутом экране для посттрансляционной модификации, он обладает способностью связывать цинк, и он очень распространен в тканях человека, полученных от инфицированных H. pylori индивидуумов.

Наша работа показывает, что S100A12 может ингибировать рост и жизнеспособность H.pylori дозозависимым образом в G27 штамме H.pylori и что антимикробная активность этого белка может быть обращена путем добавления избытка питательного цинка. Эта работа дополняет нашу предыдущую работу, показывающую, что S100A12 проявляет противомикробную активность против PMSS1 и 7.13 штаммов H.pylori , демонстрируя его широкую антибактериальную активность против многочисленных клинических изолятов и лабораторно адаптированных штаммов H.pylori 18 . Вместе эти результаты подтверждают важность S100A12 в качестве механизма для контроля роста и пролиферации бактерий с помощью питательного иммунитета. Будущие исследования этого важного взаимодействия между хозяином и бактерией могут включать в себя использование активности S100A12 для снижения бактериальной нагрузки в тканях организма-хозяина или определения вклада этого белка в иммунную передачу сигналов в контексте инфекции H.pylori .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Выражение S100A12

  1. Трансформируйте компетентные клетки BL21 DE3 плазмидой pGEMEX-S100a12, используя стандартный протокол теплового шока 18 . Добавьте от 1 до 5 мкл плазмиды к 50 мкл бактерий в микроцентрифужную пробирку на льду. Инкубируйте в течение 20 мин.
  2. Тепловой удар клетки при 42 ° С в течение 30 с.
  3. Инкубируйте клетки на льду в течение 2 мин.
  4. Добавьте 500 мкл среды SOC к клеткам. Инкубируйте при 37 ° C со встряхиванием при 250 об / мин на орбитальном шейкере в течение 1 часа.
  5. Планшет 150 мкл реакции превращения на среде LB-агара (с добавлением 100 мкг / мл ампициллина). Инкубируйте в течение 12-16 ч при 37 ° C.
  6. Выберите одну колонию. Прививают 2 мл LB (с добавлением 100 мкг / мл ампициллина).
  7. Инкубируйте в течение 4-6 ч при 37 ° C на орбитальном шейкере (300 об / мин). OD 600 должен считывать между 1-3 единицами оптической плотности.
  8. Добавить 500 мкл стартовой культуры в 50 мл ZYM-5052 autoinduCtion media 26 с добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Для наилучшей аэрации и максимальной экспрессии используйте колбу Эрленмейера вместимостью 250 мл. Встряхивают (300 об / мин) в течение 24 ч при 37 ° С.
  9. Перенесите бактериальную суспензию в центрифужную пробирку. Гранулировали клетки центрифугированием (4000 xg, 10 мин) при 4 ° C.
  10. Декантируйте среду, запишите образец и сохраните клеточную пасту при -80 ° C. Образец стабилен в течение многих лет.

2. Очистка S100A12 с использованием хроматографии низкого давления

  1. Ресуспендируют клетки в 30 мл 20 мМ Трис, рН 8,0.
  2. Утоните суспензию на льду для лизиса клеток. Используйте ~ 20 Вт выход, 5 с вкл и 5 с цикл выключения в течение 5 мин.
  3. Перенесите раствор в высокоскоростные центрифужные пробирки. Просветьте клеточный лизат центрифугированием, 20 000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
  4. Декантируют супернатант и переносят в чистый стакан из полипропилена объемом 100 мл. Охладите раствор, поставив стакан на лед. Добавить перемешиваниеГ и медленно добавляют 11,20 г сульфата аммония. Дать раствору перемешать на льду еще 1 час. Это создаст 60% -ный раствор сульфата аммония и осадит большинство эндогенных белков E.coli . S100A12 останется растворимым.
  5. Центрифугируйте раствор при 4 ° С, 20 000 мкг в течение 20 мин для осаждения осажденного белка.
  6. Декантируют надосадочную жидкость и переносят в диализную трубку (MWCO 3500 кДа). Диализу против 1 л 20 мМ Трис, рН 8,0 при 4 ° С. Дважды меняйте буфер диализа. Разрешить между изменениями 4 часа.
  7. Анионообменная хроматография
    1. Выполните хроматографию на системе низкого давления. Типичный расход составляет 1 мл / мин.
    2. Растворяют в 5 мл колонке с сефарозой 10 мл 20 мМ Трис, pH 8,0.
    3. Загрузите ~ 40 мл раствора S100A12, используя пробоотборный насос (соберите поток).
    4. Промывают колонку 10 мл 20 мМ Трис, pH 8.
    5. Разработайте столбец с градиентом 0-30% (BuFfer B - 20 мМ Трис, pH 8,0, 1 М NaCl) в 19 объемах колонки (CV, 95 мл). Соберите фракции по 5 мл.
    6. Возьмите 10 мкл аликвоты каждой фракции и проанализируйте, используя MES SDS PAGE с окрашиванием Кумасси. Выполнить гель с использованием постоянного напряжения (20 В / см) в течение 30 мин.
    7. Фракции пула, содержащие S100A12. S100A12 работает на протеине ~ 10 кДа на денатурирующем геле.
    8. Концентрируют фракции до 5 мл, используя ультрафильтрационное устройство (MWCO 10 кДа). Центрифуга при 3000 мкг в течение ~ 8 мин. Возьмите верхнюю фракцию.
  8. Хроматография с исключением по размеру
    1. Равновесили колонку S75 с 1 CV (120 мл) 20 мМ Tris pH 8, 100 мМ NaCl.
    2. Вводят <5 мл концентрированных фракций S100A12 (из ионообменной хроматографии).
    3. Развести колонку при расходе 1 мл / м на 120 мл. Соберите фракции по 5 мл.
    4. Возьмите 10 мкл аликвоты каждой фракции и проанализируйте, используя SDS PAGE с окрашиванием Кумасси. Подтвердить идентичность белка с помощьюВестерн-блот или масс-спектрометрию (рассчитанная молекулярная масса мономерной субъединицы 10 575,0 Да, измеренная 10575,4 Да).
  9. Фракции пулов
    1. Измерить поглощение белка A 280 с помощью спектрофотометра. Используйте SEC-буфер как пустой. Рассчитанный коэффициент экстинкции для гомодимера S100A12 составляет 5960 М -1 см -1 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Типичный выход составляет 35-45 мг S100A12 на 50 мл культуры.
    2. Aliquot S100A12 в 1,5 мл пробирки для микроцентрифугирования (1 мг / пробирка), замораживают в жидком азоте и хранят при -80 ° C.

3. Анализы антимикробной активности

  1. Streak H. pylori штамм G27 на трипсиновые чашки соевого агара с добавлением 5% овечьей крови (пластины агара для крови). Выращивайте 2-3 дня при 37 ° C в комнатном воздухе с добавлением 5% двуокиси углерода.
  2. Прививают H. pylori в бульон Brucella, дополненный 1x холестерином. Культура за(250 об. / Мин) при 37 ° C в воздухе в помещении с добавлением 5% двуокиси углерода.
  3. Разбавляют H.pylori 1:10 в 50% бульон Бруцеллы, 50% буфера кальпротектина плюс 1х холестерин и культуру в среде отдельно или дополняют 100 мкМ хлоридом цинка плюс 0, 100 или 1000 мкг / мл очищенного S100A12. Культуральное ночное встряхивание (250 об / мин) при 37 ° С в воздухе в помещении с добавлением 5% диоксида углерода.
  4. На следующий день проводят серийные разведения и планшеты на планшеты с кровяным агаром. Позвольте бактериальным колониям расти в течение 2-3 дней при температуре 37 ° C в комнатном воздухе, дополненном 5% двуокисью углерода. Перечислите единицы формирования колоний для расчета роста бактерий в присутствии или в отсутствие S100A12 и / или экзогенного цинка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12 экспрессия и очистка

Трехступенчатая очистка дает ~ 40 мг рекомбинантного S100A12 из 50 мл бактериальной культуры. Первой стадией было осаждение сульфатом аммония эндогенных белков E.coli . За этой стадией следовала анионообменная хроматография ( фиг.1А ). Белок отслеживается SDS-PAGE, окрашенным кумасси Brilliant Blue ( рис. 1B ). Последняя стадия процедуры очистки включала объединение фракций, содержащих S100A12, для хроматографии с исключением по размеру, которая разделяет белки по молекулярной массе и форме ( фиг. 2A ). S100A12 представляет собой гомодимер (92 аминокислоты на субъединицу) и имеет общую молекулярную массу около 21 кДа. Фракции, собранные с помощью эксклюзионной хроматографии, анализировали с помощью SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси ( фиг. 2В

S100A12 подавляет рост бактерий с помощью хелатной активности цинка

Чтобы исследовать антимикробную активность S100A12, анализ жизнеспособности бактерий проводили с использованием методов количественной микробиологической культуры ( рисунок 3 ). Перечисление бактериальных клеток показывает, что воздействие 100 мкг / мл S100A12 в присутствии или отсутствии экзогенного источника питательного цинка не оказывает значительного ингибирования жизнеспособности бактерий по сравнению с контрольными группами без добавления S100A12 (P> 0,05, односторонний дисперсионный анализ). Тем не менее, воздействие 1000 мкг / мл S100A12 только в среде приводит к 69-кратному снижению жизнеспособности бактерий по сравнению со средой (P = 0,0193, t-критерий Стьюдента, P> 0,05 однофакторный ANOVA); Результат был отменен добавлением экзогенного источника питательного цинка (P = 0,023, t- критерий Стьюдента). Эти результаты deПовышают антимикробную активность S100A12, зависит от его активности связывания цинка.

Рисунок 1
Рисунок 1: Лизис клеток и очистка S100A12 анионообменной хроматографией . ( А ) Хроматограмма ионообменной очистки. След поглощения УФ при 280 нм показан синим цветом, градиент соли изображен в розовом, собранные фракции отмечены красным. ( Б ) SDS-PAGE-гель стадий очистки. Линии: 1) молекулярно-массовый стандарт 2) растворимая фракция лизата 3) осадок сульфата аммония 4) супернатант аммония 5-14) Q хроматографические фракции 6-15. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2 Рисунок 2: Результаты гель-фильтрационной очистки S100A12. ( А ) Хроматограмма результатов исключения по размеру. След поглощения УФ при 280 нм показан синим, собранные фракции отмечены красным. ( Б ) SDS PAGE гель хроматографии с исключением по размеру. Линии: 1) маркер веса молекулы 2) нагрузка образца 3-15) фракции 10-21. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Количественный анализ культуры жизнеспособности бактерий в ответ на воздействие S100A12-зависимого хелатообразования цинка. Бактерии подвергали воздействию 0, 100 или 100 мкг / мл S100A12 только в среде (серые полосы) или в среде, дополненной 100 мкМ хлоридом цинка(Черные полосы). Воздействие 1000 мкг / мл в отсутствие экзогенного источника питательного цинка приводит к значительному ингибированию жизнеспособности бактерий (* P <0,05, t-критерию Стьюдента по сравнению со средним + цинковым состоянием). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Представлен эффективный протокол для экспрессии и очистки человеческого S100A12. Система экспрессии E. coli является наиболее распространенным инструментом, используемым для производства рекомбинантных белков, особенно когда количество мг требуется для биохимических и биофизических исследований. Ключевым усовершенствованием описанной здесь процедуры является использование автоиндукционных сред 26, которые увеличивают выход очищенного белка почти в тридцать раз по сравнению с экспрессией со стандартными средами Luria-broth 18 . Кроме того, автоиндукционные среды значительно упрощают работу с выражением протеинов. Используя обычные ростовые среды, культуры должны постоянно контролироваться, чтобы индуцирующий агент мог быть добавлен в фазу экспоненциального роста. Нет необходимости контролировать время удвоения при использовании автоиндукционных носителей. Культурам разрешено расти до насыщения. На начальных этапах роста с автоиндукциейНа средах E. coli использует глюкозу в качестве источника углерода. Как только глюкоза истощается, бактерии переключаются на лактозу в качестве источника углерода, который индуцирует экспрессию белка 26 . Композиция автоиндукционных сред изысканно настроена для обеспечения роста культур с высокой плотностью и, следовательно, для повышения экспрессии рекомбинантного белка. В нашем опыте с S100A12 автоиндукционные среды значительно увеличивают количество экспрессируемого белка, однако мы предупреждаем, что это может быть зависимым от белка и должно быть экспериментально проверено.

S100A12 экспрессируется в цитоплазматической фракции E.coli , что свидетельствует о его растворимости и хорошей складчатости. Первая стадия очистки включает добавление высокого процента сульфата аммония, который осаждает многие эндогенные белки E.coli . Этот шаг усиливает высокую стабильность и растворимость семейства белков S100. S100A12 является умеренно кислым (pI 5.81), Таким образом, S100A12 дополнительно очищают сильной анионообменной смолой. Последней стадией процесса очистки является колоночная эксклюзионная хроматографическая колонка, которая гарантирует, что S100A12 является монодисперсным и димерным. Этот этап протокола имеет решающее значение, так как показано, что S100A12 образует растворимые олигомеры 15, и неизвестно, что может повлиять на олигомеризацию на его противомикробную активность. Поскольку члены класса S100 имеют высокую последовательность и структурную гомологию, их физические свойства сходны 27 . Следовательно, этот способ очистки S100A12 может широко применяться ко всем белкам S100, которые экспрессируются в растворимой фракции E. coli.

Предыдущая работа продемонстрировала, что белки S100, такие как кальпротектин, обладают антимикробной активностью против бактериальных патогенов, таких как H.pylori, и что эта активность зависит от активности связывания с цинком 25 . АнтимикробнаяЦиальная активность S100A12 также зависит от цинка, но ингибирование роста, продемонстрированное в анализах роста бактерий, показывает, что для подавления роста требуется значительно больше S100A12 по сравнению с другими белками семейства S100, такими как кальпротектин. Таким образом, крайне важно использовать более высокие концентрации S100A12, чем кальпротектин, для достижения сходных фенотипов (ингибирование роста или изменения вирулентности). Будущие применения этого протокола могут быть применены для определения глобальных изменений в экспрессии бактериальных генов, метаболических или протеомических изменениях в ответ на металлическую секвестрацию, наложенную S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Департаментом по развитию карьеры при Департамента по делам ветеранов 1IK2BX001701, премией CTSA UL1TR000445 от Национального центра продвижения трансляционных наук, премий Национального научного фонда № 1547757 и 1400969 и гранта NIH GM05551. Его содержание полностью принадлежит авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национального центра продвижения трансляционных наук или Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter