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Biochemistry

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

여기에서는 S100A12 (calgranulin C)를 발현 및 정제하는 방법을 제시합니다. 우리는 인간 병원균 H. pylori 에 대한 항균 활성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

Calgranulin 단백질은 타고난 면제의 중요한 매개체이며 칼슘 결합 단백질 인 EF-hand 계열의 S100 클래스의 구성원입니다. 일부 S100 단백질은 전이 금속을 높은 친 화성으로 결합시킬 수 있고 "영양 면역"과정에서 미생물 병원균 침입으로부터 효과적으로 격리 할 수 ​​있습니다. S100A12 (EN-RAGE)는 아연과 구리를 모두 결합하며 대 식세포와 호중구와 같은 타고난 면역 세포에서 매우 풍부합니다. 우리는 활성, 금속 결합 구성에서 S100A12의 발현, 농축 및 정제를위한 정제 된 방법을보고합니다. 박테리아 증식 및 생존력 분석에서이 단백질의 이용은 S100A12가 박테리아 병원체 인 Helicobacter pylori 에 항균 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 항균 활성은 영양소 아연을 킬레이트 화하는 S100A12의 아연 결합 활성에 기인하며, 이로 인해 아연이 성장 및 P를 필요로하는 H.pylori 가 굶어 죽는다.위험.

Introduction

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S100 단백질은 다양한 기능을 가진 칼슘 결합 단백질의 일종입니다. 그것들은 조직과 세포 특유의 방식으로 발현되며 광범위한 세포 기능을 조절합니다 2 , 3 . 칼슘 결합 단백질에 고유 한 S100 단백질은 세포 내 및 세포 외 기능 모두를 나타냅니다 4 , 5 . 세포 내에서 Ca 2+ 결합은 단백질 결합 파트너를 특이 적으로 표적으로하는 소수성 표면을 노출시키는 구조 변화를 유도합니다. 이 세포 내 메커니즘은 세포 증식, 분화 및 에너지 대사와 같은 중요한 과정을 조절합니다. 세포 외 환경에서 S100 단백질은 두 가지 기능을 나타낸다. 하나는 손상된 분자 패턴 (DAMP) 단백질로 작용하고 친 염증을 일으킨다.패턴 인식 수용체와의 상호 작용을 통한 면역 반응의 초기 반응 8 , 9 . 또한 S100 단백질 군의 여러 구성원은 전이 금속을 격리하며 이는 영양 면역 10 , 11 이라고 불리는 과정에서 미생물 병원균을 굶어 죽이는 역할을한다.

S100A12 (calgranulin C 및 EN-RAGE라고도 함)는 대 식세포 및 호중구에서 많이 발현되며 염증성 질환의 잠재적 인 바이오 마커로 확인되었습니다 12 , 13 . 그것의 EF-Hand 부위에서 칼슘을 결합시키는 것 외에도, S100A12는 이량 체 인터페이스의 양단에 두 개의 고친 화성 전이 금속 결합 부위를 가지고있다 14,15. 각 결합 부위는 3 개의 히스티딘 잔기 및 1 개의 아스파르트 산 잔기로 구성되며 아연 또는 구리를 킬레이트 할 수있다 <sup class = "xref"> 16 , 17 . 최근에 우리는 S100A12 의존성 아연 결핍이 Helicobacter pylori의 성장과 염증성 독성 인자의 활성을 조절하는데 중요하다고보고했다.

헬리코박터 파일로리 (H. pylori )는 세계 인구의 약 절반에 해당하는 위장에 감염됩니다. 그것은 틀림없이 가장 성공적인 세균성 병원체 중 하나이다 19 . 헬리코박터 파이로리 감염위염 , 소화성 및 십이지장 궤양, 점막 관련 림프 성 조직 (MALT) 림프종 및 침윤성 위암 (위암)을 비롯한 중대한 위암 질환의 결과로 이어질 수 있습니다. 위암은 세계에서 비 - 심장 암 관련 사망의 주요 원인이며, 위암에 대한 가장 큰 관련 위험 요소는 H. pylori 감염 입니다.

헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 는 로브에도 불구하고 위장에 계속 존재한다.이 박테리아 감염을 통제하는 면역 기전의 더 나은 이해에 대한 필요성을 강조했다. 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori와 관련된 염증은 감염 부위에 S100A12를 포함한 항균성 단백질의 레파토리를 입금하는 다형 핵 세포 또는 호중구의 심한 침윤을 특징으로합니다 18 , 24 , 25 . 숙주와 병원체 사이의 복잡한 대화를 이해하기 위해 S100A12를 정제하고이 의학적으로 관련이있는 병원균에 미치는 항생제 영향을 연구하기 위해이 기술을 사용하려고했습니다. 아래의 프로토콜은 생물학적 활성 상태에서의 S100A12 정제 기술을 개량 한 것입니다. 높은 affini와 영양 금속을 바인딩 할 수타이 미생물 침입으로부터 그들을 킬레이트 화시킨다. 또한, 아래의 방법은 선천적 인 항균 분자가 박테리아 병원체의 성장을 제한하는 메커니즘을 연구하기위한 중요한 시약으로서이 단백질의 유용성을 강조합니다.

S100A 계열 단백질은 숙주 방어뿐만 아니라 면역 신호 전달에 관여하는 선천성 면역계 분자의 중요한 그룹으로 인식되어왔다. 이들 중 가장 잘 연구 된 화합물은 calprotectin (MRP-8 / 14, calgranulin A / B, S100A8 / A9)입니다 (28 , 29 , 30) . Calprotectin은 이합체 계면에서 전이 금속을 결합하는 S100A8과 S100A9 서브 유닛의 헤테로 다이머를 형성하는 호중구 - 관련 단백질이다. Calprotectin은 두 개의 금속 결합 부위를 가지고있는 것으로 나타났습니다. Site 1은 Zn 2+ , Mn 2+ 또는 Fe 2+ 를 결합 할 수 있고 Site 2는 Zn 2+ 31 , 32를 결합하라. Calprotectin은 Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , H. pylori 와 같은 다양한 병원균에 대한 항균 활성을 가지고 있으며 저해 효과는 calprotectin 25 , 28 , 29 .

이전 연구에서 calprotectin은 외막의 지질 A 구조를 변경하고, H.pylori 내 주요 proinflammatory virulence factor 인 cag- Type IV 분비 시스템을 억제하고, biofilm 형성을 유도하고, 억제하는 등 헬리코박터 균에 대한 수많은 활동을 수행했다. 헬리코박터 파이로리 성장 및 생존률class = "xref"> 25 , 33 . 또한, 유전 적 및 생화학 적 분석 결과 칼로필틴의 H. pylori 에 대한 항균 활성은 주로 영양소 인 아연 결합 능력에서 비롯된 것으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 는 아연이 필요하며,이 병원균의 미량 영양소 요구량을 확인하기 위해 화학적으로 정의 된 배지를 이용하여 성장하고 증식시키는 이전의 연구에 의해 결정되었다. 또한 칼로 펙틴은 헬리코박터 파일로리에 감염된 조직 내에서 매우 풍부하게 존재하며 호중구의 침윤 물과 관련이 있으며, 이는 감염 및 후속 염증시 항균제로 calprotectin을 사용할 수 있음을 나타냅니다 25 , 35 .

편향된 프로테오믹스 스크리닝 기술로부터 얻은 최근의 증거에 따르면, 반응성 산소 종이 풍부한 조건 하에서는 calprotec주석은 hexa-histidine 결합 부위를 변경하는 post-translational modification을 거침으로써 단백질 36 의 금속 결합 활성을 억제한다. 이와 같이, 우리는이 분자의 광범위한 레파토리 중 다른 S100A 계열 단백질이 잠재적으로 보조 금속 킬레이트 화제로 작용할 수 있다고 가정했다. S100A12는 후속 연구를 위해 전술 한 스크린에서 확인되지 않았기 때문에 S100A12를 선택했다. 아연과 결합 할 수있는 능력을 가지고 있으며 H. pylori 감염 개체에서 유래 한 인간 조직에서 매우 풍부하다.

우리의 연구 결과에 따르면 S100A12는 H. pylori 의 G27 균주에서 H. pylori의 생장 및 생존력을 용량 의존적으로 억제 할 수 있으며,이 단백질의 항균 활성은 과량의 영양소 아연을 첨가함으로써 역전 될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 PMSS1 및 7.1에 대한 S100A12 항균 활성을 나타내는 이전 연구를 보완합니다3 종의 H. pylori 균주가 H. pylori 18 균주 및 임상 분리 균주에 대한 광범위한 항균 활성을 입증했다. 함께, 이러한 결과는 영양 면제를 통해 박테리아 성장 및 증식을 조절하는 메커니즘으로서 S100A12의 중요성을 확인합니다. 이 중요한 숙주 - 박테리아 상호 작용에 대한 향후 연구에는 숙주 조직 내 박테리아 부담을 줄이거 나 H. pylori 감염과 관련하여 면역 신호 전달에 대한이 단백질의 기여도를 결정하기 위해 S100A12의 활성을 이용하는 것이 포함될 수 있습니다.

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Protocol

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1. S100A12의 발현

  1. 표준 열 충격 프로토콜 18을 사용하여 pGEMEX - S100a12 플라스미드로 유능한 BL21 DE3 세포를 변환하십시오. 얼음에 microcentrifuge 튜브에 박테리아의 50 μL에 플라스미드 1 ~ 5 μL를 추가합니다. 20 분 동안 품어 낸다.
  2. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 열 충격시킵니다.
  3. 얼음에 2 분 동안 세포를 품어.
  4. 세포에 SOC 배지 500 μL를 첨가하십시오. 1 시간 동안 궤도 진탕 기에서 250 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양하십시오.
  5. LB - 한천 배지 (100 μg / ML 암피실린으로 보충)에 변형 반응의 플레이트 150 μL. 37 ° C에서 12-16 시간 동안 품어 낸다.
  6. 하나의 식민지를 선택하십시오. LB (100 μg / ML 암피실린과 보충) 2 ML을 예방 접종.
  7. 궤도 진탕 기 (300 rpm)로 37 ° C에서 4 ~ 6 시간 동안 품어 낸다. OD 600 은 1 ~ 3 흡광도 단위를 읽어야합니다.
  8. ZYM-5052 autoindu 50 mL에 starter culture 500 μL 첨가ampicillin 100 μg / mL가 보충 된 배양액 26. 최상의 통기와 최대 발현을 위해서는 250 mL의 배플이있는 삼각 플라스크를 사용하십시오. 37 ° C에서 24 시간 동안 흔들어줍니다 (300 rpm).
  9. 세균 현탁액을 원심 분리 튜브로 옮긴다. 4 ° C에서 원심 분리 (4,000 xg, 10 분)하여 세포를 펠렛.
  10. 미디어를 기울이십시오, 샘플을 기록하고 -80 ° C에 셀 붙여 넣기를 저장하십시오. 샘플은 수년간 안정적입니다.

2. 저압 크로마토 그래피를 이용한 S100A12의 정제

  1. 20 MM 트리스, 산도 8.0의 30 ML에 Resuspend 세포.
  2. 세포 현탁액을 얼음으로 녹여 세포를 용해시킵니다. 5 분 동안 ~ 20W 출력, 5 초 켜짐 및 5 초 꺼짐 사이클 사용.
  3. 솔루션을 고속 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 20,000 xg의 원심 분리로 세포 용 해물을 명확히하십시오.
  4. 상등액을 따라 내고 깨끗한 100 mL 폴리 프로필렌 비이커로 옮긴다. 비이커를 얼음에 붓고 용액을 냉각시킵니다. 약동 추가황산 암모늄 11.20g을 천천히 첨가한다. 용액을 얼음에서 1 시간 더 저어 준다. 이것은 황산 암모늄의 60 % 용액을 만들고 대부분의 대장균 내생 단백질을 침전시킵니다. S100A12는 가용성을 유지합니다.
  5. 침전 된 단백질을 펠렛으로 만들기 위해 20 분 동안 4 ℃, 20,000 xg에서 용액을 원심 분리한다.
  6. 상층 액을 버리고 투석 튜브 (MWCO 3,500 kDa)로 옮긴다. 4 ℃에서 1 L의 20 mM Tris, pH 8.0에 대한 Dialyze. 투석 버퍼를 두 번 변경하십시오. 변경 사이에 4 시간을 허용하십시오.
  7. 음이온 교환 크로마토 그래피
    1. 저압 시스템에서 크로마토 그래피를 수행하십시오. 일반적인 유속은 1 mL / min입니다.
    2. 20 ML 트리스, 산도 8.0 10 ML 5 ML 세파 로즈 컬럼을 평형.
    3. 샘플 펌프를 사용하여 ~ 40 mL의 S100A12 용액을 채 웁니다 (흐름을 수집하십시오).
    4. 컬럼을 20 mM Tris (pH 8) 10 mL로 씻는다.
    5. 0-30 % 그라디언트로 컬럼을 만듭니다 (BuB 컬럼은 19 컬럼 부피 (CV, 95 mL)에서 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl이다. 5 ML 분수를 수집합니다.
    6. 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 쿠마시 염색법으로 MES SDS PAGE를 사용하여 분석하십시오. 30 분 동안 정전압 (20V / cm)을 사용하여 겔을 실행하십시오.
    7. S100A12를 포함한 풀 분획. S100A12는 변성 겔에서 ~ 10 kDa 단백질에서 작동합니다.
    8. 한외 여과 장치 (MWCO 10 kDa)를 사용하여 분획물을 5 mL로 농축시킨다. ~ 8 분 동안 3,000 xg에서 원심 분리하십시오. 최고 분수를 가져 가라.
  8. 크기 - 배제 크로마토 그래피
    1. S75 컬럼을 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl 1 CV (120 mL)로 평형화한다.
    2. 이온 교환 크로마토 그래피에서 얻은 5 mL 이하의 농축 S100A12 분획을 주입하십시오.
    3. 120 mL에 1 mL / m의 유속으로 컬럼을 현상한다. 5 ML 분수를 수집합니다.
    4. 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 SDS PAGE를 사용하여 Coomassie 염색법으로 분석하십시오. 다음을 사용하여 단백질 확인웨스턴 블랏 또는 질량 분광법 (단량체 서브 유닛 10,575.0Da의 계산 된 분자량, 10575.4Da로 측정).
  9. 풀 분수
    1. 분광 광도계를 사용하여 단백질 A 280 의 흡광도를 측정합니다. SEC 버퍼를 공백으로 사용하십시오. S100A12 호모 다이머의 계산 된 흡광 계수는 5960M -1 cm -1 입니다.
      참고 : 일반적인 수확량은 배양액 50 mL 당 S100A12 35-45 mg입니다.
    2. 분주 한 S100A12를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브 (1 mg / 튜브)에 넣고 -80 ° C에서 액체 질소와 플래시에서 동결합니다.

3. 항균 활성 분석

  1. 5 % 양 혈액 (혈액 한천 플레이트)이 보충 된 tryptic soy 한천 플레이트에 H. pylori 균주 G27 균주. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 2-3 일 성장하십시오.
  2. H. pylori 를 1x 콜레스테롤이 보충 된 Brucella 배지에 접종합니다. 문화는 끝났어.37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 밤새 (250rpm) 흔들었다.
  3. H. pylori 1:10을 50 % Brucella broth, 50 % calprotectin 완충액 + 1x cholesterol에 희석하고 배지 단독으로 배양하거나 100 μM zinc chloride와 0, 100 또는 1,000 μg / mL의 정제 된 S100A12를 보충합니다. 37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기 중에서 밤새 진탕 (250 rpm).
  4. 다음날, 일련의 희석을 실시하고 혈액 한천 플레이트에 옮긴다. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ℃에서 2 ~ 3 일 동안 박테리아 콜로니가 자랄 수있게하십시오. S100A12 및 / 또는 외인성 아연의 존재 또는 부재하에 박테리아 성장을 계산하기 위해 식민지 형성 단위를 열거하십시오.

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Representative Results

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S100A12 발현 및 정제

세 단계의 정제로 세균 배양액 50 mL에서 재조합 S100A12를 ~ 40 mg 생산했습니다. 첫 번째 단계는 내재 E. coli 단백질의 황산 암모늄 침전이었다. 이 단계 다음에 음이온 - 교환 크로마토 그래피 ( 그림 1A )가 뒤따 랐다. 단백질은 Coomassie Brilliant Blue로 염색 된 SDS-PAGE에 의해 추적됩니다 ( 그림 1B ). 정화 절차의 마지막 단계는 단백질을 분자량과 형태로 분리하는 크기 - 배제 크로마토 그래피 ( 그림 2A )를위한 S100A12를 포함하는 분획을 모으는 것이 었습니다. S100A12는 호모 다이머 (서브 유닛 당 92 아미노산)이고 총 분자량은 약 21 kDa입니다. 크기 - 배제 크로마토 그래피로부터 수집 된 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시 염색에 의해 가시화 하였다 ( 도 2B

S100A12는 아연 킬레이트 활성을 통해 박테리아 성장을 억제합니다

S100A12의 항균 활성을 조사하기 위해 세균 생존력 분석을 정량 미생물 배양 기술을 통해 수행했습니다 ( 그림 3 ). 박테리아 세포의 열거는 S100A12를 100㎍ / mL에 노출 시키면 S100A12가 첨가되지 않은 대조군에 비해 박테리아 생존력을 현저하게 억제하지 못한다는 사실이 밝혀졌습니다 (P> 0.05, One way ANOVA). 그러나 배지 단독에서 S100A12 1000 μg / mL에 노출하면 배지 단독에 비해 박테리아 생존율이 69 배 감소합니다 (P = 0.0193, Student 's t Test, P> 0.05 One Way ANOVA). 이는 외인성 아연의 첨가에 의해 역전 된 결과이다 (P = 0.023, Student 's t Test). 이 결과는 deS100A12의 항균 활성은 아연 격리 활성에 좌우됩니다.

그림 1
그림 1 : 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 세포 용해 및 S100A12 정제 . ( a ) 이온 교환 정제의 크로마토 그램. 파란색으로 표시된 280nm에서의 UV 흡광도, 분홍색으로 그려진 소금 그라디언트, 빨간색으로 표시된 분획 수집. ( b ) 정제 단계의 SDS PAGE 겔. 레인 : 1) 분자량 표준 2) 가용성 용해 분획 3) 암모늄 설페이트 펠렛 4) 암모늄 설페이트 상등액 5-14) Q 크로마토 그래피 분획 6-15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 그림 2 : S100A12 정제의 크기 배제 크로마토 그래피 결과. ( a ) 크기 배제 결과의 크로마토 그램. 파란색으로 표시된 280 nm에서의 UV 흡광도의 추적은 적색으로 표시된 분획을 수집했습니다. ( b ) 크기 - 배제 크로마토 그래피의 SDS PAGE 겔. 레인 : 1) 분자량 마커 2) 샘플로드 3-15) 분수 10-21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : S100A12 의존 아연 킬 레이션에 대한 노출에 대한 세균 생존 능력의 정량적 인 배양 분석 박테리아는 배지 단독 (회색 막대) 또는 100μM 염화 아연이 보충 된 배지에서 0, 100 또는 100 μg / mL의 S100A12에 노출시켰다(검은 색 막대). 영양소 아연의 외부 공급원이없는 상태에서 1,000 μg / mL에 노출되면 박테리아 생존률이 유의하게 저해된다 (* P <0.05, 중성 아연과 비교하여 Student 's t test). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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인간 S100A12의 발현 및 정제를위한 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 대장균 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 사용되는 가장 일반적인 도구이며 특히 생화학 및 생물 물리학 연구에 mg이 필요한 경우에 사용됩니다. 여기에 설명 된 절차의 핵심적인 향상은 표준 Luria-broth media 18 을 사용한 발현과 비교하여 정제 단백질의 수율을 거의 30 배 증가시키는 자동 유도 미디어 26 의 사용입니다. 또한 자동 유도 미디어는 단백질 발현 워크 플로를 크게 단순화합니다. 재래 성장 매체를 사용하여, 지수 적 성장 단계 동안 유도제를 첨가 할 수 있도록 배양 물을 연속적으로 모니터링해야한다. 자동 유도 미디어를 사용할 때 배증 시간을 모니터링 할 필요가 없습니다. 배양 물은 포화 상태까지 자랄 수 있습니다. 자동 유도를 통한 성장의 초기 단계배지에서 대장균 은 탄소원으로 포도당을 사용합니다. 일단 포도당이 고갈되면 박테리아는 단백질 발현을 유도하는 탄소원으로 유당으로 전환합니다 26 . 자가 유도 배지의 조성은 고밀도 배양 물의 성장을 허용하고 이에 따라 재조합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있도록 절묘하게 조정됩니다. S100A12에 대한 우리의 경험에서, 자동 유도 배지는 단백질 발현 양을 크게 증가 시켰지만, 단백질 의존성 일 수 있으므로 실험적으로 검증해야합니다.

S100A12는 대장균 의 세포질 분획에서 발현 되며, 이는 가용성이며 잘 접혀 있음을 시사한다. 정화의 첫 번째 단계는 높은 백분율의 암모늄 설페이트를 첨가하여 많은 내인성 대장균 단백질을 침전시키는 것이다. 이 단계는 S100 단백질 군의 높은 안정성과 용해도를 이용합니다. S100A12는 중간 정도의 산성 (pI 5.81). 따라서 S100A12는 강한 음이온 교환 수지로 더 정제됩니다. 정제 과정의 마지막 단계는 S100A12가 단 분산 및 이량 체임을 보장하는 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼입니다. 이 프로토콜의 단계는 S100A12가 용해성 올리고머 15 를 형성하는 것으로 나타 났으며 올리고머 화가 항균 활성에 어떤 영향을 미치는지 알 수 없으므로 중요합니다. S100 클래스의 멤버는 높은 서열과 구조 상 동성을 공유하기 때문에 그들의 물리적 특성은 유사하다. 따라서, S100A12의 정제 방법은 대장균 의 가용성 분획에서 발현되는 모든 S100 단백질에 광범위하게 적용될 수있다 .

이전의 연구는 calprotectin과 같은 S100 단백질이 H. pylori 와 같은 세균성 병원균에 대한 항균 활성을 가지고 있으며이 활성이 아연 결합 활성에 좌우된다는 것을 증명했다. 항균제S100A12의 활성은 또한 아연 의존성이지만 박테리아 성장 분석에서 입증 된 성장 억제는 calprotectin과 같은 다른 S100 계열 단백질에 비해 성장을 억제하는 데 훨씬 많은 S100A12가 필요하다는 것을 보여줍니다. 따라서 유사한 phenotypes (성장 억제 또는 독성의 변경)을 달성하기 위해 calprotectin보다 높은 농도의 S100A12를 사용하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 향후 적용은 S100A12에 의해 부과 된 금속 격리에 대한 응답으로 박테리아 유전자 발현, 대사 체 또는 프로테오믹 변이의 세계적 변화를 결정하는 데 적용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 재향 군인의 직무 경력 개발 상 1IK2BX001701, 전진 과학 전담 센터의 CTSA 상 UL1TR000445, 국가 과학 재단 상 번호 1547757 및 1400969 및 NIH 부여 GM05551에 의해 지원되었습니다. 이의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 전진을위한 국립 중앙 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대표하지는 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성
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