Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Her præsenterer vi en metode til at udtrykke og rense S100A12 (calgranulin C). Vi beskriver en protokol til måling af dets antimikrobielle aktivitet mod det humane patogen H. pylori .

Abstract

Calgranulin-proteiner er vigtige mediatorer af medfødt immunitet og er medlemmer af S100-klassen af ​​EF-hånd-familien af ​​calciumbindende proteiner. Nogle S100 proteiner har evnen til at binde overgangsmetaller med høj affinitet og effektivt sekvestrere dem væk fra invaderende mikrobielle patogener i en proces, der betegnes "ernæringsmæssig immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både zink og kobber og er meget rigeligt i medfødte immunkeller, såsom makrofager og neutrofiler. Vi rapporterer en raffineret metode til udtryk, berigelse og oprensning af S100A12 i sin aktive, metalbindende konfiguration. Udnyttelse af dette protein i bakteriel vækst og levedygtighedsanalyser viser, at S100A12 har antimikrobiel aktivitet mod bakteriepatogenet Helicobacter pylori . Den antimikrobielle aktivitet er baseret på den zinkbindende aktivitet af S100A12, som chelaterer næringsstofzink og derved sultner H. pylori, der kræver zink til vækst og proliferation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100 proteiner er en klasse af EF-hånd-familien af ​​calciumbindende proteiner med en bred vifte af funktioner 1 . De udtrykkes på en vævs- og celle-specifik måde og regulerer et bredt spektrum af cellulære funktioner 2 , 3 . Unikke til calciumbindende proteiner, S100 proteiner udviser både intracellulære og ekstracellulære funktioner 4 , 5 . Inden for cellen inducerer Ca2 + -binding en konformationel ændring, der udsætter en hydrofob overflade, der specifikt målretter proteinbindende partnere 6 . Denne intracellulære mekanisme regulerer vigtige processer som celleproliferation, differentiering og energi metabolisme. I det ekstracellulære miljø udviser S100 proteiner to funktioner 7 . I en fungerer de som skade-relaterede molekylære mønster (DAMP) proteiner og initierer en proinflammationAtorisk immunrespons gennem interaktion med mønstergenkendelsesreceptorer 8 , 9 . Derudover overfører flere medlemmer af S100 proteinklasse-sekvestrerne metaller, en funktion, der tjener til at sulte mikrobielle patogener i en procesbetegnet næringsimmunitet 10 , 11 .

S100A12 (også kendt som calgranulin C og EN-RAGE) udtrykkes stærkt i makrofager og neutrofiler og er blevet identificeret som en potentiel biomarkør for inflammatoriske sygdomme 12 , 13 . Foruden bindende calcium ved dets EF-Hand-steder har S100A12 to højaffinitetsovergangsmetalbindingssteder placeret i modsatte ender af dimerinterfacet 14 , 15 . Hvert bindingssted består af tre histidinrester og en asparaginsyrerest og kan chelatere zink eller kobber <Sup class = "xref"> 16 , 17 . For nylig rapporterede vi, at S100A12-afhængig zinkhævelse er vigtig for regulering af Helicobacter pylori- vækst og aktiviteten af ​​proinflammatoriske virulensfaktorer 18 .

H. pylori inficerer maven på omkring halvdelen af ​​verdens menneskelige befolkning; Gør det uden tvivl et af de mest succesrige bakteriepatogener 19 . Infektion med H. pylori kan føre til betydelige gastrisk sygdomsresultater, herunder gastritis, peptisk og duodenalt sår, slimhindeassocieret lymfoidvæv (MALT) lymfom og invasivt gastrisk adenocarcinom (mavekræft). Mavekræft er den førende årsag til ikke-kardiokræft-relateret død i verden, og den største enkeltstående risikofaktor for mavekræft er infektion med H. pylori .

H. pylori fortsætter i gastrisk niche på trods af en robuSt immunrespons på patogenet, understreger behovet for en bedre forståelse af immunmekanismer til styring af denne bakterielle infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pyloriassocieret inflammation er karakteriseret ved en dyb infiltration af polymorfonukleære celler eller neutrofiler, som deponerer et repertoire af antimikrobielle proteiner, herunder S100A12, på infektionsstedet 18 , 24 , 25 . For at forstå den komplekse dialog mellem vært og patogen forsøgte vi at forbedre teknikken til at rense S100A12 og bruge den til at studere den antimikrobielle påvirkning, den udøver på dette medicinsk relevante patogen. Protokollen nedenfor skitserer en forbedret teknik til S100A12 rensning i sin biologisk aktive tilstand; I stand til at binde næringsmetaller med høj affiniTy og chelaterer dem væk fra invaderende mikroorganismer. Desuden fremhæver metoderne nedenfor brugen af ​​dette protein som et kritisk reagens for at studere mekanismen, hvorved indfødte antimikrobielle molekyler begrænser væksten af ​​bakterielle patogener.

S100A-familieproteiner har opnået anerkendelse som en vigtig gruppe af medfødte immunsystemmolekyler, der deltager i immunsignaler samt værtsforsvar 27 . De mest velundersøgte af disse er calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin er et neutrofil-associeret protein, der danner en heterodimer af S100A8- og S100A9-underenhederne, der binder overgangsmetaller ved dimer-grænsefladen 31 . Calprotectin har vist sig at besidde to metalbindingssteder: Site 1 kan binde Zn 2+ , Mn 2+ eller Fe 2+ og Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Talrige rapporter har vist, at calprotectin har antimikrobielle aktiviteter mod forskellige patogener, herunder Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli og H. pylori , og at de inhiberende virkninger skyldes metalcheleringsaktiviteten af ​​calprotectin 25 , 28 , 29 .

Tidligere arbejde demonstreret calprotectin udøver mange aktiviteter på H. pylori, herunder ændring af lipid A-strukturen i den ydre membran, undertrykkelse af cag-Type IV-sekretionssystemet (som er en stor proinflammatorisk virulensfaktor inden for H. pylori ), inducerende dannelse af biofilm og undertrykning H. pylori vækst og levedygtighed på en dosisafhængig mådeClass = "xref"> 25 , 33 . Desuden afslørede de genetiske og biokemiske analyser den antibakterielle aktivitet af calprotectin mod H. pylori i vid udstrækning afledt af dets evne til at binde næringszink 25 . H. pylori kræver zink, som det blev bestemt ved tidligere forskning, der anvendte et kemisk defineret medium for at fastslå mikronæringsstofkravene for dette patogen for at vokse og proliferere 34 . Derudover var calprotectin meget rigeligt inden for H. pylori- inficerede væv og associeret med neutrofile infiltrater, hvilket indikerer at værten kan anvende calprotectin som en antimikrobiell strategi under infektion og efterfølgende inflammation 25 , 35 .

Nylige bevis fra objektive proteomics screeningsteknikker antyder, at under betingelser, hvor reaktive iltarter er rigelige, calprotecTin gennemgår posttranslationelle modifikationer, som ændrer hexa-histidinbindingsstedet og derved hæmmer proteinbindelsens metalbindende aktivitet. Som sådan antydede vi, at andre S100A-familieproteiner blandt de brede repertoar af disse molekyler kunne potentielt fungere som hjælpemetalkelatorer. Vi valgte S100A12 til videre undersøgelse, fordi den ikke blev identificeret i den ovennævnte skærm for posttranslationel modifikation, den har kapacitet til at binde zink, og den er meget rigelig i humane væv stammer fra H. pylori- inficerede individer.

Vores arbejde indikerer, at S100A12 kan hæmme H. pylori- vækst og levedygtighed på en dosisafhængig måde i H. pylori- G27-stammen, og at den antimikrobielle aktivitet af dette protein kan reverseres ved tilsætning af overskydende næringsstofsink. Dette arbejde supplerer vores tidligere arbejde med angivelse af S100A12 udøvet antimikrobiel aktivitet mod PMSS1 og 7.13-stammer af H. pylori , der demonstrerer sin brede antibakterielle aktivitet mod talrige kliniske isolater og laboratorie-tilpassede stammer af H. pylori 18 . Sammen bekræfter disse resultater betydningen af ​​S100A12 som en mekanisme til at kontrollere bakteriel vækst og proliferation via ernæringsimmunitet. Fremtidige undersøgelser af denne vigtige værtsbakterieinteraktion kan omfatte udnyttelse af aktiviteten af ​​S100A12 for at reducere bakteriel byrde i værtsvæv eller bestemmelse af dette proteins bidrag til immun signalering i forbindelse med H. pylori- infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ekspression af S100A12

  1. Transform kompetente BL21 DE3 celler med et pGEMEX-S100a12 plasmid ved hjælp af en standard varmchokprotokol 18 . Tilsæt 1 til 5 μl plasmid til 50 μl bakterier i et mikrocentrifugerør på is. Inkubér i 20 min.
  2. Varme choker cellerne ved 42 ° C i 30 s.
  3. Inkubér cellerne på is i 2 minutter.
  4. Tilsæt 500 μL SOC medier til cellerne. Inkuber ved 37 ° C med omrystning ved 250 omdr./min. På en orbital shaker i 1 time.
  5. Plad 150 μl af transformationsreaktionen på LB-agarmedium (suppleret med 100 μg / ml ampicillin). Inkubér i 12-16 timer ved 37 ° C.
  6. Vælg en koloni. Inokulere 2 ml LB (suppleret med 100 μg / ml ampicillin).
  7. Inkubér i 4-6 timer ved 37 ° C på en orbital shaker (300 rpm). OD 600 skal læse mellem 1-3 absorbansenheder.
  8. Tilsæt 500 μl starterkultur til 50 ml ZYM-5052 autoinduCtion media 26 suppleret med 100 μg / ml ampicillin. For at opnå den bedste beluftning og maksimal ekspression, brug en 250 ml baffled Erlenmeyer-kolbe. Rystes (300 rpm) i 24 timer ved 37 ° C.
  9. Overfør bakteriel suspension til et centrifugerør. Pelleter cellerne ved centrifugering (4.000 xg, 10 min) ved 4 ° C.
  10. Dekanter medierne, logprøven og lagre cellepasta ved -80 ° C. Prøven er stabil i årevis.

2. Oprensning af S100A12 ved anvendelse af lavtrykskromatografi

  1. Resuspender celler i 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonikér suspensionen på is for at lyse celler. Brug ~ 20 W udgang, 5 s til og 5 s off cyklus i 5 min.
  3. Overfør opløsningen til højhastighedscentrifugerør. Clarificere cellelysatet ved centrifugering, 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
  4. Dekanter supernatanten og overfør til et rent 100 ml polypropylenbæger. Afkøl opløsningen ved at placere bægeret på is. Tilføj en omrøring baR og langsomt tilsæt 11,20 g ammoniumsulfat. Lad opløsningen røre på is i yderligere 1 time. Dette vil skabe en 60% opløsning af ammoniumsulfat og præcipitere de fleste af de E. coli endogene proteiner. S100A12 forbliver opløselige.
  5. Centrifug opløsningen ved 4 ° C, 20.000 xg i 20 minutter for at pille det udfældede protein.
  6. Dekanter supernatanten og overfør til dialyserør (MWCO 3.500 kDa). Dialyser mod 1 liter 20 mM Tris, pH 8,0 ved 4 ° C. Skift dialysebufferen to gange. Tillad 4 timer mellem ændringer.
  7. Anionbytningskromatografi
    1. Udfør kromatografi på et lavtrykssystem. Typisk strømningshastighed er 1 ml / min.
    2. Equilibrere en 5 ml Sepharose-søjle med 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Indlæs ~ 40 ml S100A12 opløsningen ved hjælp af prøvepumpen (saml strømmen igennem).
    4. Vask kolonnen med 10 ml 20 mM Tris, pH 8.
    5. Udvikle kolonnen med en 0-30% gradient (BuFfer B er 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) over 19 søjlevolumener (CV, 95 ml). Saml 5 ml fraktioner.
    6. Tag en 10 μl alikvot af hver fraktion og analyser ved anvendelse af MES SDS PAGE med Coomassie-farvning. Kør gel ved konstant spænding (20 V / cm) i 30 min.
    7. Poolfraktioner indeholdende S100A12. S100A12 kører ved ~ 10 kDa protein på en denaturerende gel.
    8. Koncentrer fraktioner til 5 ml ved anvendelse af en ultrafiltreringsindretning (MWCO 10 kDa). Centrifuge ved 3.000 xg i ~ 8 min. Tag den øverste fraktion.
  8. Størrelseseksklusionskromatografi
    1. Equilibrere S75 kolonne med 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Injicer <5 ml koncentrerede S100A12 fraktioner (fra ionbytningschromatografi).
    3. Udvikle kolonnen ved en strømningshastighed på 1 ml / m over 120 ml. Saml 5 ml fraktioner.
    4. Tag en 10 μl alikvot af hver fraktion og analysér ved anvendelse af SDS PAGE med Coomassie-farvning. Validere proteinidentitet ved anvendelse afWestern blot eller massespektrometri (beregnet molekylvægt af monomer subunit 10.575,0 Da, målt 10575,4 Da).
  9. Poolfraktioner
    1. Mål absorbansen af ​​proteinet A 280 ved anvendelse af et spektrofotometer. Brug SEC-bufferen som et tomt. Den beregnede ekstinktionskoefficient for S100A12 homodimer er 5960 M -1 cm -1 .
      BEMÆRK: Typiske udbytter er 35-45 mg S100A12 pr. 50 ml kultur.
    2. Aliquot S100A12 i 1,5 ml mikrocentrifugerør (1 mg / rør), flashfrys i flydende nitrogen og opbevar ved -80 ° C.

3. Antimikrobielle aktivitetstest

  1. Streak H. pylori stamme G27 på tryptiske soja agarplader suppleret med 5% fårblod (blod agarplader). Vok 2-3 dage ved 37 ° C i rumluft suppleret med 5% carbondioxid.
  2. Inokuler H. pylori i Brucella bouillon suppleret med 1x kolesterol. Kultur overNat rystning (250 rpm) ved 37 ° C i rumluft suppleret med 5% carbondioxid.
  3. Fortynd H. pylori 1:10 til 50% Brucella bouillon, 50% calprotectin buffer plus 1x cholesterol og kultur i medium alene eller suppleret med 100 μM zinkchlorid plus 0, 100 eller 1.000 μg / ml renset S100A12. Kultur natten over rystede (250 omdr./min.) Ved 37 ° C i rumluft suppleret med 5% kuldioxid.
  4. Den følgende dag udfører serielle fortyndinger og plade på blodagarplader. Tillad bakteriekolonier at vokse i 2-3 dage ved 37 ° C i rumluft suppleret med 5% carbondioxid. Opregne kolonidannende enheder til beregning af bakteriel vækst i nærvær eller fravær af S100A12 og / eller eksogent zink.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12-ekspression og oprensning

En tre-trins oprensning producerede ~ 40 mg rekombinant S100A12 fra 50 ml bakteriekultur. Det første trin var en ammoniumsulfatudfældning af endogene E. coli- proteiner. Dette trin blev efterfulgt af anionbytningskromatografi ( figur 1A ). Proteinet spores af en SDS-PAGE farvet med Coomassie Brilliant Blue ( Figur 1B ). Det sidste trin i oprensningsproceduren involverede pooling af fraktioner indeholdende S100A12 for størrelseseksklusionskromatografi, som adskiller proteiner med molekylvægt og form ( figur 2A ). S100A12 er en homodimer (92 aminosyrer pr. Underenhed) og har en total molekylvægt på ca. 21 kDa. Fraktioner opsamlet fra størrelseseksklusionskromatografi blev analyseret ved SDS-PAGE og visualiseret ved Coomassie-farvning ( Figur 2B

S100A12 undertrykker bakteriel vækst via zinkcheleringsaktivitet

For at undersøge den antimikrobielle aktivitet af S100A12 blev bakterielle levedygtighedsanalyser udført via kvantitative mikrobiologiske kulturteknikker ( figur 3 ). Opgørelse af bakterieceller afslører, at eksponering for 100 μg / ml S100A12 i nærvær eller fravær af en eksogen kilde til næringszink ikke signifikant hæmmer bakteriel levedygtighed sammenlignet med kontroller uden S100A12 tilsat (P> 0,05, One way ANOVA). Eksponering for 1000 μg / ml S100A12 i medium alene resulterer imidlertid i et 69-faldigt fald i bakteriel levedygtighed i forhold til medium alene (P = 0,0193, Student's t Test, P> 0,05 One Way ANOVA); Et resultat, der blev reverseret ved tilsætning af en eksogen kilde til næringszink (P = 0,023, Student's t Test). Disse resultater deMonstrere den antimikrobielle aktivitet af S100A12 er afhængig af sin zinksekvestreringsaktivitet.

figur 1
Figur 1: Celllysis og S100A12 rensning ved anionbytningskromatografi . ( A ) kromatogram af ionbytterrensning Spor af UV-absorbans ved 280 nm vist i blå, saltgradient afbildet i lyserøde, opsamlede fraktioner markeret med rødt. ( B ) SDS PAGE gel af oprensningstrin. Baner: 1) molekylvægt standard 2) opløselig lysatfraktion 3) ammoniumsulfatpellet 4) ammoniumsulfat supernatant 5-14) Q kromatografiske fraktioner 6-15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2 Figur 2: Størrelseseksklusionskromatografi resultater af S100A12 oprensning. ( A ) Kromatogram af størrelsesekskluderingsresultater. Spor af UV-absorbans ved 280 nm vist i blå, opsamlede fraktioner markeret med rødt. ( B ) SDS PAGE-gel af størrelseseksklusionskromatografi. Baner: 1) molekylvægtmarkør 2) prøvebelastning 3-15) fraktioner 10-21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Kvantitative kulturanalyser af bakteriel levedygtighed som reaktion på eksponering for S100A12-afhængig zinkchelation. Bakterier blev udsat for 0, 100 eller 100 μg / ml S100A12 i medium alene (gråstænger) eller medium suppleret med 100 μM zinkchlorid(Sorte søjler). Eksponering til 1000 μg / ml i fravær af en eksogen kilde til næringszink resulterer i signifikant inhibering af bakteriel levedygtighed (* P <0,05, Student's t-test sammenlignet med medium + zinktilstand). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En effektiv protokol til både ekspression og oprensning af human S100A12 er præsenteret. E. coli ekspressionssystemet er det mest almindelige værktøj, der anvendes til fremstilling af rekombinante proteiner, især når der kræves mg mængder til biokemiske og biofysiske undersøgelser. En nøgleforøgelse af fremgangsmåden beskrevet her er brugen af ​​auto-induktionsmedium 26, som forøger udbyttet af oprenset protein med en faktor på næsten tredive sammenlignet med ekspression med standard-Luria-bouillonmedium 18 . Derudover forenkler auto-induktionsmediet i høj grad proteinpræget arbejdsprocessen. Ved anvendelse af konventionelle vækstmedier skal kulturer overvåges kontinuerligt, således at et inducerende middel kan tilsættes under den eksponentielle vækstfase. Der er ingen grund til at overvåge fordoblingstiderne, når der anvendes auto-induktionsmedier. Kulturerne får lov til at vokse til mætning. Under de indledende stadier af vækst med auto-induktionPå medier bruger E. coli glukose som carbonkilde. Når glukosen er udtømt, skifter bakterierne til lactose som en carbonkilde, der inducerer proteinekspression 26 . Sammensætningen af ​​auto-induktionsmediet er udsøgt indstillet for at tillade vækst af kulturer med høj densitet og derfor øget ekspression af rekombinant protein. I vores erfaring med S100A12 øger automatisk induktionsmedier mængden af ​​udtrykt protein, men vi advarer om, at dette kan være proteinafhængigt og bør verificeres eksperimentelt.

S100A12 udtrykkes i den cytoplasmatiske fraktion af E. coli, hvilket antyder, at den er opløselig og velfoldet. Det første trin i rensningen involverer tilsætning af en høj procentdel af ammoniumsulfat, der udfælder mange af de endogene E. coli proteiner. Dette trin udnytter den høje stabilitet og opløselighed af S100-familien af ​​proteiner. S100A12 er moderat surt (pI 5,81). Således renses S100A12 yderligere med en stærk anionbytterharpiks. Det sidste trin i oprensningsprocessen er en størrelseseksklusionskromatografikolonne, som sikrer, at S100A12 er monodispers og dimerisk. Dette trin i protokollen er afgørende, da S100A12 har vist sig at danne opløselige oligomerer 15, og det er ukendt, hvilken påvirkning oligomerisering kan have på dens antimikrobielle aktivitet. Da medlemmer af S100-klassen deler høj sekvens og strukturel homologi, svarer deres fysiske egenskaber til 27 . Denne fremgangsmåde til oprensning af S100A12 kan derfor være bredt anvendelig for alle S100 proteiner, der udtrykkes i den opløselige fraktion af E. coli.

Tidligere arbejde har vist, at S100 proteiner, såsom calprotectin, har antimikrobiel aktivitet mod bakteriepatogener såsom H. pylori, og at denne aktivitet er afhængig af zinkbindende aktivitet 25 . AntimikrobiIal aktivitet af S100A12 er også zinkafhængig, men væksthæmmelsen demonstreret i bakterievækstanalyser afslører, at signifikant mere S100A12 er påkrævet for at inhibere vækst sammenlignet med andre S100-familieproteiner, såsom calprotectin. Det er således kritisk at anvende højere koncentrationer af S100A12 end calprotectin for at opnå lignende fænotyper (væksthæmning eller ændringer i virulens). Fremtidige anvendelser af denne protokol kunne anvendes til at bestemme globale ændringer i bakterielle genekspression, metabolomiske eller proteomiske ændringer som følge af metalsekvestrering pålagt af S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Department of Veterans Affairs Karriereudvikling Award 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 fra National Center for Advance Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 og 1400969, og NIH tildele GM05551. Dens indhold er udelukkende forfatterens ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis officielle synspunkter på National Center for Advancement of Translational Sciences eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter