Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Abstract

Calgranulin-Proteine ​​sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunität und sind Mitglieder der S100-Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen. Einige S100-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Übergangsmetalle mit hoher Affinität zu binden und sie effektiv von eindringenden mikrobiellen Pathogenen in einem Prozess abzuscheiden, der als "ernährungsbedingte Immunität" bezeichnet wird. S100A12 (EN-RAGE) bindet sowohl Zink als auch Kupfer und ist in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Neutrophilen sehr reichlich vorhanden. Wir berichten über eine verfeinerte Methode für die Expression, Anreicherung und Reinigung von S100A12 in ihrer aktiven, metallbindenden Konfiguration. Die Verwendung dieses Proteins in Bakterienwachstums- und Lebensfähigkeitsanalysen zeigt, dass S100A12 eine antimikrobielle Wirkung gegen den bakteriellen Pathogen, Helicobacter pylori, aufweist . Die antimikrobielle Aktivität beruht auf der Zinkbindungsaktivität von S100A12, die Nährstoffzink chelatisiert und dadurch H. pylori verhungert, was Zink für Wachstum und p erfordertRolltation

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100-Proteine ​​sind eine Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit einer Vielzahl von Funktionen 1 . Sie werden in einer gewebe- und zellspezifischen Weise exprimiert und regeln ein breites Spektrum an zellulären Funktionen 2 , 3 . Einzigartige Calcium-bindende Proteine, S100-Proteine ​​zeigen sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Funktionen 4 , 5 . Innerhalb der Zelle induziert die Ca 2+ -Bindung eine Konformationsänderung, die eine hydrophobe Oberfläche aussetzt, die spezifisch auf Proteinbindungspartner 6 abzielt. Dieser intrazelluläre Mechanismus reguliert wichtige Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Energiestoffwechsel. Im extrazellulären Milieu zeigen S100-Proteine ​​zwei Funktionen 7 . In einem, sie fungieren als Schmerz assoziierte molekulare Muster (DAMP) Proteine ​​und initiieren einen Pro-inflammAtory Immunantwort durch Interaktion mit Mustererkennungsrezeptoren 8 , 9 . Zusätzlich sind mehrere Mitglieder der S100-Protein-Klassen-Sequester-Übergangsmetalle, eine Funktion, die dazu dient, mikrobielle Pathogene in einem Prozess zu verhungern, der als Ernährungsstörung 10 , 11 bezeichnet wird .

S100A12 (auch bekannt als Calgranulin C und EN-RAGE) wird in Makrophagen und Neutrophilen stark exprimiert und als potentieller Biomarker für entzündliche Erkrankungen identifiziert 12 , 13 . Zusätzlich zu dem Binden von Calcium an seinen EF-Hand-Stellen hat S100A12 zwei hochaffine Übergangsmetall-Bindungsstellen, die sich an gegenüberliegenden Enden der Dimer-Grenzfläche 14 , 15 befinden . Jede Bindungsstelle besteht aus drei Histidinresten und einem Asparaginsäurerest und kann Zink oder Kupfer chelatierenSup class = "xref"> 16 , 17 . In letzter Zeit haben wir berichtet, dass S100A12-abhängiger Zink-Hunger bei der Regulierung des Helicobacter pylori -Wachstums und der Aktivität der entzündlichen Virulenzfaktoren wichtig ist.

H. pylori infiziert den Magen von etwa der Hälfte der menschlichen Bevölkerung der Welt; Es ist wohl einer der erfolgreichsten bakteriellen Pathogene 19 . Infektion mit H. pylori kann zu signifikanten Magen-Krankheit Ergebnisse einschließlich Gastritis, Magen-und Zwölffingerdarm-Geschwür, Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und invasiven Magen-Adenokarzinom (Magenkrebs) führen. Magenkrebs ist die führende Ursache für Nicht-Cardia-Krebs-assoziierten Tod in der Welt, und der einzige größte assoziierte Risikofaktor für Magenkrebs ist Infektion mit H. pylori .

H. pylori bleibt in der Magen-Nische trotz einer robuEine Immunantwort auf den Erreger und unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von Immunmechanismen zur Bekämpfung dieser bakteriellen Infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assoziierte Entzündungen zeichnen sich durch eine tiefe Infiltration von polymorphonuklearen Zellen oder Neutrophilen aus, die ein Repertoire antimikrobieller Proteine, einschließlich S100A12, an der Stelle der Infektion 18 , 24 , 25 ablagern. In dem Bemühen, den komplexen Dialog zwischen Host und Pathogen zu verstehen, suchten wir die Technik zu verfeinern, um S100A12 zu reinigen und es zu verwenden, um die antimikrobielle Wirkung zu untersuchen, die sie auf diesen medizinisch relevanten Erreger ausübt. Das Protokoll unten beschreibt eine verbesserte Technik für die S100A12-Reinigung in ihrem biologisch aktiven Zustand; Fähig, Nährstoffmetalle mit hohem Affini zu bindenTy und chelatisieren sie weg von eindringenden Mikroorganismen. Darüber hinaus unterstreichen die nachstehenden Methoden die Nützlichkeit dieses Proteins als kritisches Reagenz, um den Mechanismus zu untersuchen, durch den angeborene antimikrobielle Moleküle das Wachstum von bakteriellen Pathogenen einschränken.

S100A-Familie Proteine ​​haben Anerkennung als eine wichtige Gruppe von angeborenen Immunsystem Moleküle gewonnen, die an der Immunsignalisierung sowie Host Verteidigung teilnehmen 27 . Das am meisten untersuchte ist Calprotectin (MRP-8/14, Calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin ist ein Neutrophil-assoziiertes Protein, das ein Heterodimer der S100A8- und S100A9-Untereinheiten bildet, die Übergangsmetalle an der Dimer-Grenzfläche 31 bindet. Es wurde gezeigt, dass Calprotektin zwei Metallbindungsstellen besitzt: Standort 1 kann Zn 2+ , Mn 2+ oder Fe 2+ binden und Standort 2 können Binden Zn 2+ 31 , 32 . Zahlreiche Berichte haben gezeigt, dass Calprotektin antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Pathogene wie Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli und H. pylori aufweist und dass die hemmenden Wirkungen auf die Metallchelataktivität von Calprotectin 25 , 28 zurückzuführen sind , 29 .

Bisherige Arbeiten zeigten, dass Calprotektin zahlreiche Aktivitäten auf H. pylori ausübt, einschließlich der Veränderung der Lipid-A-Struktur in der äußeren Membran und unterdrückt das Cag-Typ IV-Sekretionssystem (das ein wichtiger proinflammatorischer Virulenzfaktor innerhalb von H. pylori ist ), wodurch die Biofilmbildung und die Unterdrückung induziert wird H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen WeiseClass = "xref"> 25 , 33 . Darüber hinaus zeigten genetische und biochemische Assays die antibakterielle Aktivität von Calprotectin gegen H. pylori wurde weitgehend aus seiner Fähigkeit, Nährstoff Zink 25 zu binden abgeleitet. H. pylori erfordert Zink, wie es bei früheren Untersuchungen bestimmt wurde, die ein chemisch definiertes Medium nutzten, um die Mikronährstoffanforderungen für dieses Pathogen zu ermitteln, um zu wachsen und zu vermehren 34 . Zusätzlich war Calprotectin in H. pylori- infizierten Geweben sehr reichlich vorhanden und mit neutrophilen Infiltraten assoziiert, was anzeigt, dass der Wirt Calprotektin als antimikrobielle Strategie während der Infektion und nachfolgende Entzündung 25 , 35 einsetzen kann .

Der jüngste Beweis von den unvoreingenommenen Proteomik-Screening-Techniken deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen reaktive Sauerstoffspezies reichlich vorhanden sind, calprotecZinn unterliegt posttranslationalen Modifikationen, die die Hexa-Histidin-Bindungsstelle verändern und dadurch die Metallbindungsaktivität des Proteins 36 hemmen. Als solches haben wir vermutet, dass andere S100A-Familienproteine ​​unter dem breiten Repertoire dieser Moleküle potentiell als Hilfsmetall-Chelatoren wirken könnten. Wir haben S100A12 für eine weitere Studie ausgewählt, weil es in dem oben erwähnten Screen für die posttranslationale Modifikation nicht identifiziert wurde, es hat die Fähigkeit, Zink zu binden, und es ist sehr reich an menschlichen Geweben, die von H. pylori- infizierten Individuen stammen.

Unsere Arbeit zeigt, dass S100A12 H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen Weise im G27-Stamm von H. pylori hemmen kann und dass die antimikrobielle Aktivität dieses Proteins durch die Zugabe von überschüssigem Nährstoff-Zink umgekehrt werden kann. Diese Arbeit ergänzt unsere bisherige Arbeit, die darauf hinweist, dass S100A12 antimikrobielle Aktivität gegen PMSS1 und 7.1 ausübt3-Stämme von H. pylori , die ihre breite antibakterielle Wirkung gegen zahlreiche klinische Isolate und Labor-adaptierte Stämme von H. pylori 18 zeigen . Gemeinsam bestätigen diese Ergebnisse die Bedeutung von S100A12 als Mechanismus zur Kontrolle des Bakterienwachstums und der Proliferation durch Ernährungsunempfindlichkeit. Zukünftige Untersuchungen dieser wichtigen Wirtsbakterien-Interaktion könnten die Ausnutzung der Aktivität von S100A12 zur Verringerung der Bakterienbelastung innerhalb von Wirtsgeweben oder die Bestimmung des Beitrags dieses Proteins zur Immunsignalisierung im Kontext der H. pylori- Infektion umfassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ausdruck von S100A12

  1. Transformieren Sie kompetente BL21 DE3-Zellen mit einem pGEMEX-S100a12-Plasmid unter Verwendung eines Standard-Hitzeschock-Protokolls 18 . Füge 1 bis 5 μl Plasmid zu 50 μl Bakterien in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu. Inkubieren für 20 min.
  2. Schütteln Sie die Zellen bei 42 ° C für 30 s.
  3. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min.
  4. Füge 500 μl SOC-Medium zu den Zellen hinzu. Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln bei 250 U / min auf einem Orbitalschüttler für 1 h.
  5. Plättchen 150 μl der Transformationsreaktion auf LB-Agar-Medium (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). Inkubieren für 12-16 h bei 37 ° C.
  6. Wähle eine Kolonie. Inokulieren Sie 2 ml LB (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin).
  7. Inkubieren für 4-6 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler (300 U / min). Die OD 600 sollte zwischen 1-3 Absorptionseinheiten lesen.
  8. Füge 500 μl Starterkultur zu 50 ml ZYM-5052 Autoindu hinzuCtion media 26, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Für eine optimale Belüftung und maximale Expression verwenden Sie einen 250 mL verwirrten Erlenmeyerkolben. Schütteln Sie (300 U / min) für 24 h bei 37 ° C.
  9. Bakteriensuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (4.000 xg, 10 min) bei 4 ° C.
  10. Dekantieren Sie das Medium, protokollieren Sie Probe und speichern Sie Zellpaste bei -80 ° C. Die Probe ist seit Jahren stabil.

2. Reinigung von S100A12 unter Verwendung von Niederdruckchromatographie

  1. Resuspendieren von Zellen in 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonate die Suspension auf Eis, um Zellen zu lysieren. Verwenden Sie ~ 20 W Ausgang, 5 s und 5 s aus Zyklus für 5 min.
  3. Übertragen Sie die Lösung auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation, 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
  4. Den Überstand dekantieren und auf einen sauberen 100 ml Polypropylen-Becher überführen. Kühlen Sie die Lösung ab, indem Sie den Becher auf Eis legen. Rührei hinzufügenR und fügen langsam 11,20 g Ammoniumsulfat hinzu. Lassen Sie die Lösung auf Eis für weitere 1 h rühren. Dies wird eine 60% ige Lösung von Ammoniumsulfat schaffen und die meisten der E. coli endogenen Proteine ​​präzipitieren. S100A12 bleibt löslich.
  5. Die Lösung bei 4 ° C, 20.000 xg für 20 min zentrifugieren, um das ausgefällte Protein zu pelletieren.
  6. Den Überstand dekantieren und auf Dialyseschlauch übertragen (MWCO 3.500 kDa). Dialyse gegen 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 bei 4 ° C. Ändern Sie den Dialysepuffer zweimal. Erlaube 4 Stunden zwischen den Änderungen.
  7. Anionenaustauschchromatographie
    1. Führen Sie die Chromatographie auf einem Niederdrucksystem durch. Die typische Durchflussmenge beträgt 1 mL / min.
    2. Äquilibrieren einer 5 ml Sepharose-Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Laden Sie die ~ 40 ml S100A12-Lösung mit der Probenpumpe (sammeln Sie den Durchfluss).
    4. Die Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8, waschen.
    5. Entwickeln Sie die Säule mit einem 0-30% Gradienten (BuFfer B ist 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) über 19 Säulenvolumina (CV, 95 ml). Sammle 5 ml Fraktionen.
    6. Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit MES SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Gel mit konstanter Spannung (20 V / cm) für 30 min laufen lassen.
    7. Poolfraktionen mit S100A12. S100A12 läuft bei ~ 10 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel.
    8. Konzentrieren Sie die Fraktionen auf 5 ml unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (MWCO 10 kDa). Zentrifuge bei 3.000 xg für ~ 8 min. Nehmen Sie den Spitzenbruch.
  8. Größenausschlusschromatographie
    1. Äquilibrieren Sie die S75-Säule mit 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Injizieren Sie <5 ml konzentrierte S100A12-Fraktionen (aus der Ionenaustauschchromatographie).
    3. Die Säule mit einer Durchflussmenge von 1 mL / m über 120 mL entwickeln. Sammle 5 ml Fraktionen.
    4. Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Validieren Sie die Proteinidentität mitWestern-Blot oder Massenspektrometrie (berechnete Molekülmasse der monomeren Untereinheit 10.575.0 Da, gemessen 10575.4 Da).
  9. Poolfraktionen
    1. Messen Sie die Extinktion des Proteins A 280 mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie den SEC-Puffer als Leerzeichen. Der berechnete Extinktionskoeffizient für S100A12-Homodimer beträgt 5960 M -1 cm -1 .
      HINWEIS: Typische Ausbeuten sind 35-45 mg S100A12 pro 50 ml Kultur.
    2. Aliquot S100A12 in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 mg / Röhrchen) einfrieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren.

3. Antimikrobielle Aktivität Assays

  1. Streifen H. pylori- Stamm G27 auf tryptische Soja-Agarplatten, ergänzt mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten). Wachsen 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid.
  2. Hacken Sie H. pylori in Brucella Brühe, ergänzt mit 1x Cholesterin. Kultur überNachtschütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid.
  3. Verdünnen Sie H. pylori 1:10 in 50% Brucella-Bouillon, 50% Calprotectin-Puffer plus 1x Cholesterin und Kultur im Medium allein oder ergänzt mit 100 μM Zinkchlorid plus 0, 100 oder 1000 μg / ml gereinigtem S100A12. Kultur über Nacht schütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid.
  4. Am nächsten Tag führen Sie serielle Verdünnungen und Platten auf Blut-Agar-Platten. Bakterienkolonien für 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft wachsen lassen, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. Aufzählen der koloniebildenden Einheiten zur Berechnung des Bakterienwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von S100A12 und / oder exogenem Zink.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12 Expression und Reinigung

Eine dreistufige Reinigung ergab 40 mg rekombinantes S100A12 aus 50 ml Bakterienkultur. Der erste Schritt war eine Ammoniumsulfat-Präzipitation von endogenen E. coli- Proteinen. Dieser Stufe folgte eine Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 1A ). Das Protein wird von einer SDS-PAGE verfolgt, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt ist (Abbildung 1B ). Der letzte Schritt des Reinigungsverfahrens war das Binden von Fraktionen, die S100A12 enthielten, für die Größenausschlusschromatographie, die Proteine ​​durch Molekulargewicht und Form trennt ( 2A ). S100A12 ist ein Homodimer (92 Aminosäuren pro Untereinheit) und hat ein Gesamtmolekulargewicht von etwa 21 kDa. Fraktionen, die aus der Größenausschlusschromatographie gesammelt wurden, wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht ( 2B

S100A12 unterdrückt das Bakterienwachstum durch Zinkchelationsaktivität

Um die antimikrobielle Aktivität von S100A12 zu untersuchen, wurden bakterielle Lebensfähigkeitsanalysen über quantitative mikrobiologische Kulturtechniken durchgeführt (Abbildung 3 ). Die Aufzählung von Bakterienzellen zeigt, dass die Exposition gegenüber 100 μg / ml S100A12 in Gegenwart oder Abwesenheit einer exogenen Quelle von Nährstoff-Zink die Bakterienlebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollen ohne S100A12 nicht signifikant inhibiert (P> 0,05, Einweg-ANOVA). Die Exposition gegenüber 1000 & mgr; g / ml S100A12 im Medium allein führt jedoch zu einer 69-fachen Abnahme der Bakterienlebensfähigkeit im Vergleich zu Medium allein (P = 0,0193, Student's Test, P> 0,05 Einweg-ANOVA); Ein Ergebnis, das durch die Zugabe einer exogenen Quelle von Nährstoff-Zink (P = 0,023, Student's Test) umgekehrt wurde. Diese Ergebnisse deDie antimikrobielle Aktivität von S100A12 ist abhängig von der Zink-Sequestrierungsaktivität.

Abbildung 1
Abbildung 1: Zelllyse und S100A12-Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie . ( A ) Chromatogramm der Ionenaustauschreinigung. Spur der UV-Absorption bei 280 nm in blau, Salzgefälle in rosa dargestellt, gesammelte Fraktionen in rot markiert. ( B ) SDS-PAGE-Gel von Reinigungsschritten Bahnen: 1) Molekulargewichtsstandard 2) lösliche Lysatfraktion 3) Ammoniumsulfatpellet 4) Ammoniumsulfatüberstand 5-14) Q-Chromatographiefraktionen 6-15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2 Abbildung 2: Größenausschlusschromatographie Ergebnisse der S100A12-Reinigung. ( A ) Chromatogramm der Größenausschlussergebnisse. Spur der UV-Absorption bei 280 nm in blau dargestellt, gesammelte Fraktionen in rot markiert. ( B ) SDS-PAGE-Gel der Größenausschlusschromatographie. Bahnen: 1) Molekülgewichtsmarker 2) Probenbelastung 3-15) Fraktionen 10-21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Quantitative Kulturanalysen der bakteriellen Lebensfähigkeit in Reaktion auf die Exposition gegenüber S100A12-abhängiger Zinkchelation. Bakterien wurden 0, 100 oder 100 μg / ml S100A12 in Medium allein (graue Balken) oder Medium, ergänzt mit 100 & mgr; M Zinkchlorid, ausgesetzt(Schwarze Balken). Die Exposition gegenüber 1.000 μg / ml in Abwesenheit einer exogenen Quelle von Nährstoffzink führt zu einer signifikanten Hemmung der Bakterienlebensfähigkeit (* P <0,05, Student's Test im Vergleich zu Medium + Zink-Zustand). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Es wird ein effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung von humanem S100A12 vorgestellt. Das E. coli- Expressionssystem ist das häufigste Mittel, das für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wird, insbesondere wenn mg-Mengen für biochemische und biophysikalische Studien erforderlich sind. Eine Schlüsselverbesserung des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung von Autoinduktionsmedien 26 , die die Ausbeute an gereinigtem Protein um einen Faktor von fast dreißig im Vergleich zur Expression mit Standard-Luria-Brühe-Medien 18 erhöht. Darüber hinaus vereinfacht Auto-Induktionsmedien den Protein-Expression-Workflow erheblich. Unter Verwendung herkömmlicher Wachstumsmedien müssen die Kulturen kontinuierlich überwacht werden, so dass ein Induktionsmittel während der exponentiellen Wachstumsphase zugegeben werden kann. Es besteht keine Notwendigkeit, die Verdopplungszeiten bei der Verwendung von Auto-Induktionsmedien zu überwachen. Die Kulturen können bis zur Sättigung wachsen. Während der Anfangsphasen des Wachstums mit Auto-InduktiAuf medien verwendet E. coli Glukose als Kohlenstoffquelle. Sobald die Glukose verbraucht ist, wechseln die Bakterien zu Lactose als Kohlenstoffquelle, die die Proteinexpression 26 induziert. Die Zusammensetzung des Autoinduktionsmediums ist exquisit abgestimmt, um das Wachstum von hochdichten Kulturen und damit eine erhöhte Expression von rekombinantem Protein zu ermöglichen. In unserer Erfahrung mit S100A12, Auto-Induktion Medien stark erhöht die Menge an exprimiertem Protein, aber wir sind darauf aufmerksam, dass dies kann Protein abhängig und sollte experimentell überprüft werden.

S100A12 wird in der zytoplasmatischen Fraktion von E. coli exprimiert, was darauf hindeutet, dass es löslich und gut gefaltet ist. Der erste Schritt der Reinigung beinhaltet die Zugabe eines hohen Prozentsatzes an Ammoniumsulfat, der viele der endogenen E. coli- Proteine ​​ausfällt. Dieser Schritt nutzt die hohe Stabilität und Löslichkeit der S100-Familie von Proteinen. S100A12 ist mäßig sauer (pI 5.81). So wird S100A12 weiter mit einem starken Anionenaustauscherharz gereinigt. Der letzte Schritt des Reinigungsprozesses ist eine Größenausschluss-Chromatographie-Säule, die sicherstellt, dass S100A12 monodispers und dimer ist. Dieser Schritt des Protokolls ist entscheidend, da S100A12 gezeigt worden ist, um lösliche Oligomere 15 zu bilden, und es ist unbekannt, was die Oligomerisierung auf ihre antimikrobielle Aktivität haben kann. Da Mitglieder der S100-Klasse eine hohe Sequenz und strukturelle Homologie teilen, sind ihre physikalischen Eigenschaften ähnlich 27 . Daher kann dieses Verfahren zur Reinigung von S100A12 weitgehend auf alle S100-Proteine ​​anwendbar sein, die in der löslichen Fraktion von E. coli exprimiert werden .

Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass S100-Proteine ​​wie Calprotektin eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen bakterielle Pathogene wie H. pylori aufweisen und dass diese Aktivität von der Zinkbindungsaktivität abhängig ist. Das AntimikrobumDie Aktivität von S100A12 ist ebenfalls zinkabhängig, aber die Wachstumshemmung, die in bakteriellen Wachstumsassays gezeigt wird, zeigt, dass signifikant mehr S100A12 erforderlich ist, um das Wachstum im Vergleich zu anderen S100-Familienproteinen wie Calprotektin zu hemmen. Daher ist es entscheidend, höhere Konzentrationen von S100A12 als Calprotectin zu verwenden, um ähnliche Phänotypen zu erreichen (Wachstumshemmung oder Veränderungen in der Virulenz). Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls könnten angewendet werden, um globale Veränderungen in der bakteriellen Genexpression, metabolischen oder proteomischen Veränderungen in Reaktion auf die Metallsequestrierung, die durch S100A12 auferlegt wird, zu bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der Abteilung für Veteranen Angelegenheiten Karriere Entwicklung Award 1IK2BX001701, CTSA Award UL1TR000445 aus dem National Center for Advancing Translational Sciences, die National Science Foundation Award Nummern 1547757 und 1400969 und NIH Grant GM05551 unterstützt. Ihr Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt offizielle Ansichten des Nationalen Zentrums für die Förderung der Translationswissenschaften oder der National Institutes of Health dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter