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Biochemistry

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Abstract

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell'immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato "immunitario nutrizionale". S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l'espressione, l'arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L'utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un'attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L'attività antimicrobica è basata sull'attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

Introduction

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Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni 1 . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari 2 , 3 . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari 4 , 5 . All'interno della cellula, il legame Ca 2+ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina 6 . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell'ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni 7 . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l'interazione con i recettori di riconoscimento del pattern 8 , 9 . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale 10 , 11 .

S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie 12 , 13 . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell'interfaccia dimerica 14 , 15 . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = "xref"> 16 , 17 . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l'attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria 18 .

H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti 19 . L'infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l'infezione da H. pylori .

H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica 20 , 21 , 22 , 23 . L' infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell'infezione 18 , 24 , 25 . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l'effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l'utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici.

Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l'apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell'ospite 27 . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all'interfaccia dimerica 31 . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ e il sito 2 può Lega Zn 2+ 31 , 32 . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all'attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 , 29 .

Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all'interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = "xref"> 25 , 33 . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l'attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale 25 . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare 34 . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l'ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l'infezione e successiva infiammazione 25 , 35 .

Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l'attività legante del metallo della proteina 36 . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l'ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori .

Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l'attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l'aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l'attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori 18 . Insieme, questi risultati confermano l'importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l'immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell'attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell'host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell'infezione da H. pylori .

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Protocol

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1. Espressione di S100A12

  1. Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min.
  2. Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s.
  3. Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min.
  4. Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min su un agitatore orbitale per 1 h.
  5. Piastra 150 μL della reazione di trasformazione sul supporto LB-agar (integrato con 100 μg / mL ampicillina). Incubare per 12-16 h a 37 ° C.
  6. Scegli una colonia. Inoculare 2 mL di LB (integrato con 100 μg / mL ampicillina).
  7. Incubare per 4-6 h a 37 ° C su un agitatore orbitale (300 rpm). L'OD 600 dovrebbe leggere tra 1-3 unità di assorbanza.
  8. Aggiungere 500 μl di coltura d'avviamento a 50 ml di autoinduzione ZYM-5052Cazione media 26 integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Per una migliore aerazione e massima espressione, utilizzare un pallone Erlenmeyer confuso da 250 mL. Agitare (300 giri / min) per 24 h, a 37 ° C.
  9. Trasferire la sospensione batterica in un tubo di centrifuga. Pellet le cellule per centrifugazione (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C.
  10. Decantare il supporto, il campione di registro e memorizzare la pasta cellulare a -80 ° C. Il campione è stabile per anni.

2. Purificazione di S100A12 utilizzando la cromatografia a bassa pressione

  1. Riposizionare le cellule in 30 mL di 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonicare la sospensione sul ghiaccio per lire le cellule. Usare ~ 20 W uscita, 5 s su e 5 s fuori ciclo per 5 min.
  3. Trasferire la soluzione ai tubi centrifughi ad alta velocità. Chiarire il lisato cellulare per centrifugazione, 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C.
  4. Decantare il surnatante e trasferire in un bicchiere da 100 ml di polipropilene pulito. Raffreddare la soluzione posando il bicchiere sul ghiaccio. Aggiungete un agitatoreR e aggiungere lentamente 11,20 g di solfato di ammonio. Lasciare agire la soluzione su ghiaccio per altri 1 h. Questo creerà una soluzione al 60% di solfato di ammonio e precipita la maggior parte delle proteine ​​endogene di E. coli . S100A12 resterà solubile.
  5. Centrifugare la soluzione a 4 ° C, 20.000 xg per 20 minuti per far pelliccare la proteina precipitata.
  6. Decantare il surnatante e trasferire in tubo di dialisi (MWCO 3.500 kDa). Dializzare contro 1 L di 20 mM Tris, pH 8,0 a 4 ° C. Cambiare due volte il buffer di dialisi. Permettono 4 ore tra le modifiche.
  7. Cianografia cromatica anionica
    1. Eseguire la cromatografia su un sistema a bassa pressione. La portata tipica è di 1 mL / min.
    2. Equilibrare una colonna di Sepharose da 5 ml con 10 mi di 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Caricare la ~ 40 mL di soluzione S100A12 utilizzando la pompa di campionamento (raccogliere il flusso attraverso).
    4. Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM Tris, pH 8.
    5. Sviluppare la colonna con una gradiente 0-30% (BuFfer B è 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) su 19 volumi di colonna (CV, 95 mL). Raccogliere 5 ml di frazioni.
    6. Prendere un' aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare utilizzando MES SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Eseguire il gel con tensione costante (20 V / cm) per 30 min.
    7. Frazioni di pool contenenti S100A12. S100A12 funziona a ~ 10 kDa proteina su un gel di denaturazione.
    8. Frazioni concentrate a 5 mL utilizzando un dispositivo di ultrasuono (MWCO 10 kDa). Centrifugare a 3.000 xg per ~ 8 min. Prendi la frazione superiore.
  8. Cromatografia di esclusione di dimensioni
    1. Equilibrare la colonna S75 con 1 CV (120 mL) di 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Iniettare <5 mL di frazioni concentrate S100A12 (dalla cromatografia di scambio ionico).
    3. Sviluppare la colonna con una portata di 1 mL / m su 120 mL. Raccogliere 5 ml di frazioni.
    4. Prendere un' aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare usando SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Convalida l'identità di proteine ​​utilizzandoWestern blot o spettrometria di massa (massa molecolare calcolata di subunità monomerica 10.575.0 Da, misurata 10575.4 Da).
  9. Frazioni di pool
    1. Misurare l'assorbanza della proteina A 280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer SEC come un vuoto. Il coefficiente di estinzione calcolato per l'omodimero S100A12 è di 5960 M -1 cm -1 .
      NOTA: Le rese tipiche sono 35-45 mg di S100A12 per 50 ml di coltura.
    2. Aliquot S100A12 in 1,5 mL di microcentrifuga (1 mg / tubo), congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

3. Analisi di attività antimicrobiche

  1. Streak H. pylori ceppo G27 su piatti triplici di agar di soia integrati con 5% di sangue di pecora (piastre agarico di sangue). Crescere 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica.
  2. Inoculare H. pylori nel brodo Brucella integrato con 1x colesterolo. Cultura oltreScuotendo la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica.
  3. Diluire H. pylori 1:10 in brodo Brucella al 50%, 50% tampone di calprotectina più 1x colesterolo e coltura in mezzo solo o integrato con 100 μM cloruro di zinco più 0, 100 o 1.000 μg / mL di S100A12 purificato. La cultura si scuota durante la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con il 5% di anidride carbonica.
  4. Il giorno successivo, eseguire le diluizioni e la piastra seriali sulle piastre di agar sangue. Lasciare colonie batteriche a crescere per 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. Enumerare le unità formanti colonia per calcolare la crescita batterica in presenza o in assenza di S100A12 e / o di zinco esogeno.

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Representative Results

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S100A12 espressione e purificazione

Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Brilliant Blue ( figura 1B ). L'ultima fase della procedura di purificazione comprendeva le frazioni di raccolta contenenti S100A12 per la cromatografia di esclusione di dimensioni che separa le proteine ​​dal peso e dalla forma molecolare ( Figura 2A ). S100A12 è un omodimero (92 aminoacidi per subunità) e ha un peso molecolare complessivo di circa 21 kDa. Le frazioni raccolte dalla cromatografia di esclusione di dimensioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE e visualizzate mediante colorazione di Coomassie ( figura 2B

S100A12 reprime la crescita batterica attraverso l'attività di chelation della zinco

Per studiare l'attività antimicrobica di S100A12, le analisi della vitalità batterica sono state eseguite mediante tecniche di coltura microbiologica quantitativa ( Figura 3 ). L'enumerazione delle cellule batteriche rivela che l'esposizione a 100 μg / mL di S100A12 in presenza o in assenza di una fonte esogena di zinco nutrizionale non inibisce in modo significativo la vitalità batterica rispetto ai controlli senza aggiunta di S100A12 (P> 0,05, ANOVA a senso unico). Tuttavia, l'esposizione a 1000 μg / mL di S100A12 in mezzo solo comporta una diminuzione del 69% rispetto alla sola media (P = 0.0193, Student's t Test, P> 0.05 One Way ANOVA); Un risultato che è stato invertito con l'aggiunta di una fonte esogena di zinco nutrizionale (P = 0.023, Student's t Test). Questi risultati deMonstrare l'attività antimicrobica di S100A12 dipende dalla sua attività di sequestro di zinco.

Figura 1
Figura 1: Lysis cellulare e purificazione di S100A12 mediante cromatografia di anion exchange . ( A ) Chromatogramma della depurazione delle scambi di ioni. Traccia di assorbanza UV a 280 nm mostrato in blu, gradiente di sale raffigurato in rosa, frazioni raccolte segnate in rosso. ( B ) SDS PAGE gel di passi di purificazione. Lunghezze: 1) peso molecolare 2) frazioni di lisato solubile 3) pellet di ammonio solfato 4) supernatante di ammonio solfato 5-14) frazioni di cromatografia Q 6-15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2 Figura 2: Risultati di cromatografia di esclusione di dimensione della purificazione di S100A12. ( A ) Cromatogramma dei risultati di esclusione di dimensioni. Tracce di assorbanza UV a 280 nm mostrate in blu, frazioni raccolte segnate in rosso. ( B ) SDS PAGE gel di cromatografia di esclusione di dimensioni. Lunghezze: 1) marker di peso molecolare 2) carico campione 3-15) frazioni 10-21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Analisi della cultura quantitativa della vitalità batterica in risposta all'esposizione alla chelazione zinco-dipendente S100A12. I batteri sono stati esposti a 0, 100 o 100 μg / mL di S100A12 in sola media (barre grigie), o mezzo aggiunto con cloruro di zinco da 100 μM(Barre nere). L'esposizione a 1.000 μg / mL in assenza di una sorgente esogena di zinco nutriente determina una inibizione significativa della vitalità batterica (* P <0.05, test t dello studente rispetto allo stato medio + zinco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Viene presentato un protocollo efficiente sia per l'espressione che per la purificazione dell'uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l'uso di mezzi autoinduttivi 26 che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta rispetto all'espressione con i supporti Luria-broth standard 18 . Inoltre, i mezzi auto-induzione semplificano notevolmente il flusso di lavoro di espressione di proteine. Utilizzando mezzi di crescita convenzionali, le colture devono essere monitorate in modo continuo in modo che un agente induttivo possa essere aggiunto durante la fase di crescita esponenziale. Non è necessario monitorare i tempi di raddoppiamento quando si utilizzano supporti autoinduttivi. Le culture sono autorizzate a crescere fino alla saturazione. Durante le fasi iniziali di crescita con auto-inductiSul supporto, E. coli usa il glucosio come fonte di carbonio. Una volta che il glucosio è esaurito, i batteri passano al lattosio come fonte di carbonio che induce l'espressione proteica 26 . La composizione dei mezzi di auto-induzione è perfettamente sintonizzata per consentire la crescita di colture ad alta densità e quindi una maggiore espressione di proteine ​​ricombinanti. Nella nostra esperienza con S100A12, i mezzi di auto-induzione aumentano notevolmente la quantità di proteine ​​espresse, tuttavia citiamo che questo possa essere dipendente dalla proteina e dovrebbe essere verificato sperimentalmente.

S100A12 è espresso nella frazione citoplasmatica di E. coli che suggerisce che sia solubile e ben piegato. La prima fase della purificazione comporta l'aggiunta di una percentuale elevata di solfato di ammonio che precipita molte delle proteine ​​endogene di E. coli . Questo passo sfrutta l'elevata stabilità e la solubilità della famiglia di proteine ​​S100. S100A12 è moderatamente acido (pI 5.81). Così S100A12 viene purificato ulteriormente con una forte resina di scambio di anioni. L'ultima fase del processo di purificazione è una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni che assicura che S100A12 sia monodispersa e dimerica. Questa fase del protocollo è cruciale poiché S100A12 è stato dimostrato di formare oligomeri solubili 15 e non è noto che cosa influenza l'oligomerizzazione può avere sulla sua attività antimicrobica. Poiché i membri della classe S100 condividono l'alta sequenza e l'omologia strutturale, le loro proprietà fisiche sono simili 27 . Quindi questo metodo di purificazione di S100A12 può essere generalmente applicabile a tutte le proteine ​​S100 che sono espresse nella frazione solubile di E. coli.

Precedenti lavori hanno dimostrato che le proteine ​​S100, come la calprotectina, hanno un'attività antimicrobica contro gli agenti patogeni batterici come H. pylori e che questa attività dipende dall'attività di legame di zinco 25 . L'antimicrobL'attività di S100A12 è anche dipendente da zinco, ma l'inibizione della crescita dimostrata nei test di crescita batterica rivela che è necessariamente più S100A12 per inibire la crescita rispetto ad altre proteine ​​della famiglia S100 come la calprotectina. Pertanto, è fondamentale utilizzare concentrazioni superiori di S100A12 rispetto alla calprotectina per ottenere fenotipi simili (inibizione della crescita o alterazioni della virulenza). Le applicazioni future di questo protocollo potrebbero essere applicate per determinare le variazioni globali nell'espressione genica batterica, alterazioni metabolomiche o proteomiche in risposta al sequestro metallico imposto da S100A12.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento per i Premi Veterans Affairs Award di sviluppo professionale 1IK2BX001701, il premio CTSA UL1TR000445 dal Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze Traslazionali, il National Science Foundation Award Numbers 1547757 e 1400969 e NIH concede GM05551. Il suo contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente una visione ufficiale del Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze Traslazionali o degli Istituti Nazionali di Salute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12
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Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

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