Her presenterer vi en metode for å uttrykke og rense S100A12 (calgranulin C). Vi beskriver en protokoll for å måle sin antimikrobielle aktivitet mot det humane patogenet H. pylori .
Calgranulin-proteiner er viktige mediatorer av medfødt immunitet og er medlemmer av S100-klassen i EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner. Noen S100 proteiner har kapasitet til å binde overgangsmetaller med høy affinitet og effektivt sekvestrere dem fra invaderende mikrobielle patogener i en prosess som kalles "ernæringsmessig immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både sink og kobber og er svært rikelig i medfødte immunkeller som makrofager og nøytrofiler. Vi rapporterer en raffinert metode for uttrykk, anrikning og rensing av S100A12 i sin aktive, metallbindende konfigurasjon. Utnyttelse av dette proteinet i bakteriell vekst og levedyktighetsanalyser viser at S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenet Helicobacter pylori . Den antimikrobielle aktiviteten er basert på den sinkbindende aktiviteten til S100A12, som chelaterer næringssink, derved sultende H. pylori som krever sink for vekst og proliferation.
S100 proteiner er en klasse av EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner med et mangfoldig utvalg av funksjoner 1 . De uttrykkes i vev og celle-spesifikk måte, og regulerer et bredt spekter av cellefunksjoner 2 , 3 . Unik for kalsiumbindende proteiner, S100-proteiner viser både intracellulære og ekstracellulære funksjoner 4 , 5 . Innenfor cellen fremkaller Ca 2+ -binding en konformasjonsendring som avslører en hydrofob overflate som spesifikt retter seg mot proteinbindingspartnere 6 . Denne intracellulære mekanismen regulerer viktige prosesser som celleproliferasjon, differensiering og energi metabolisme. I det ekstracellulære miljøet utviser S100-proteiner to funksjoner 7 . I en, fungerer de som skade-relaterte molekylære mønster (DAMP) proteiner og initierer en pro-inflammatorAtorisk immunrespons gjennom interaksjon med mønstergenkjenningsreceptorer 8 , 9 . I tillegg har flere medlemmer av S100 proteinklasse-sekvestreren overgangsmetaller, en funksjon som tjener til å sulte mikrobielle patogener i en prosess betegnet næringsimmunitet 10 , 11 .
S100A12 (også kjent som calgranulin C og EN-RAGE) er svært uttrykt i makrofager og nøytrofiler og har blitt identifisert som en potensiell biomarkør for inflammatoriske sykdommer 12 , 13 . I tillegg til bindende kalsium ved sine EF-Hand-steder, har S100A12 to høyaffinitetsovergangsmetallbindingssteder lokalisert i motsatte ender av dimergrensesnittet 14 , 15 . Hvert bindingssted består av tre histidinrester og en asparaginsyrerest og kan chelere sink eller kobber <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Nylig rapporterte vi at S100A12-avhengig sinkhung er viktig for å regulere Helicobacter pylori- vekst og aktiviteten av proinflammatoriske virulensfaktorer 18 .
H. pylori infiserer magen på omtrent halvparten av verdens menneskelige befolkning; Noe som gjør det uten tvil en av de mest vellykkede bakterielle patogener 19 . Infeksjon med H. pylori kan føre til signifikante gastriske sykdomsutfall, inkludert gastritt, peptisk og duodenalt sår, slimhinde assosiert lymfoidvev (MALT) lymfom og invasivt gastrisk adenokarsinom (magekreft). Magekreft er den viktigste årsaken til ikke-kardiokreft-assosiert død i verden, og den største enkeltstående risikofaktoren for magekreft er infeksjon med H. pylori .
H. pylori fortsetter i gastrisk nisje til tross for en robuSt immunrespons på patogenet, understreker behovet for en bedre forståelse av immunmekanismer for å kontrollere denne bakterielle infeksjonen 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assosiert betennelse er preget av en dyp infiltrering av polymorfonukleære celler eller nøytrofiler som deponerer et repertoar av antimikrobielle proteiner, inkludert S100A12, på infeksjonsstedet 18 , 24 , 25 . I et forsøk på å forstå den komplekse dialogen mellom verten og patogenet, søkte vi å avgrense teknikken for å rense S100A12 og bruke den til å studere den antimikrobielle påvirkning den utøver på dette medisinsk relevante patogenet. Protokollen nedenfor skisserer en forbedret teknikk for S100A12 rensing i sin biologisk aktive tilstand; I stand til å binde næringsmetaller med høy affiniTy og chelater dem bort fra invaderende mikroorganismer. Videre fremhever metodene nedenfor bruken av dette proteinet som et kritisk reagens for å studere mekanismen ved hvilke medfødte antimikrobielle molekyler begrenser veksten av bakterielle patogener.
S100A-familieproteiner har fått takknemlighet som en viktig gruppe medfødte immunsystemmolekyler som deltar i immunsignaler samt vert-forsvar 27 . De mest godt studerte av disse er calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin er et neutrofilt assosiert protein som danner en heterodimer av S100A8- og S100A9-underenhetene som binder overgangsmetaller ved dimergrensesnittet 31 . Calprotectin har vist seg å ha to metallbindingssteder: Nettsted 1 kan binde Zn 2+ , Mn 2+ , eller Fe 2+ og Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Tallrike rapporter har vist at calprotectin har antimikrobielle aktiviteter mot forskjellige patogener, inkludert Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli og H. pylori , og at de hemmeffektene skyldes metallkeleringsaktiviteten til calprotectin 25 , 28 , 29 .
Tidligere arbeid demonstrert calprotectin utøver en rekke aktiviteter på H. pylori, inkludert å endre lipid A-strukturen i den ytre membranen, undertrykke cag- Type IV sekresjonssystemet (som er en stor proinflammatorisk virulensfaktor innen H. pylori ), indusere biofilmdannelse og undertrykke H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måteClass = "xref"> 25 , 33 . Videre viste genetiske og biokjemiske analyser den antibakterielle aktiviteten til calprotectin mot H. pylori i stor grad avledet fra sin evne til å binde næringssink 25 . H. pylori krever sink, som ble bestemt av tidligere forskning som benyttet et kjemisk definert medium for å fastslå mikronæringsstoffkravene for dette patogenet for å vokse og proliferere 34 . I tillegg var calprotectin svært rikelig innenfor H. pylori- infiserte vev og assosiert med neutrofile infiltrater, hvilket indikerer at verten kan benytte calprotectin som en antimikrobiell strategi under infeksjon og påfølgende inflammasjon 25 , 35 .
Nylige bevis fra objektive proteomics screening teknikker antyder at under forhold der reaktive oksygen arter er rikelig, calprotecTinn gjennomgår posttranslasjonelle modifikasjoner som endrer heksa-histidinbindingsstedet og derved hemmer den metallbindende aktivitet av proteinet 36 . Som sådan antydet vi at andre S100A-familieproteiner blant det brede repertoaret av disse molekylene kunne potensielt fungere som hjelpemetallkelatorer. Vi valgte S100A12 for videre studier fordi den ikke ble identifisert i den nevnte skjermen for posttranslasjonell modifikasjon, den har kapasitet til å binde sink, og den er svært rikelig i humant vev avledet fra H. pylori- infiserte personer.
Vårt arbeid indikerer at S100A12 kan hemme H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måte i G27-stammen av H. pylori , og at den antimikrobielle aktiviteten til dette proteinet kan reverseres ved tilsetning av overskudd av næringsinnholdssink. Dette arbeidet kompletterer vårt tidligere arbeid som indikerer at S100A12 utøver antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 og 7.13 stammer av H. pylori , som demonstrerer sin brede antibakterielle aktivitet mot mange kliniske isolater og laboratorie-tilpassede stammer av H. pylori 18 . Sammen, disse resultatene bekrefter betydningen av S100A12 som en mekanisme for å kontrollere bakteriell vekst og spredning via ernæringsmessig immunitet. Fremtidige studier av denne viktige vertsbakterieinteraksjonen kan omfatte å utnytte aktiviteten til S100A12 for å redusere bakteriell byrde i vertsvev, eller bestemme bidraget av dette proteinet til immun-signalering i sammenheng med H. pylori- infeksjon.
En effektiv protokoll for både ekspresjon og rensing av human S100A12 presenteres. E. coli- ekspresjonssystemet er det vanligste verktøyet som brukes til fremstilling av rekombinante proteiner, spesielt når mg mengder kreves for biokjemiske og biofysiske studier. En nøkkelforbedring av prosedyren beskrevet her er bruk av auto-induksjonsmedium 26 som øker utbyttet av renset protein med en faktor på nesten tretti sammenlignet med ekspresjon med standard Luria-buljongmedium <sup class…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Department of Veterans Affairs Karriereutvikling Pris 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 fra National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 og 1400969, og NIH gi GM05551. Innholdet er utelukkende av forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis offisielle synspunkter på Nasjonalt senter for fremme av oversettelseskunnskap eller Nasjonalt institutt for helse.
S100A12 Expression | ||
Expression cells | ||
BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
Autoinduction medium components | ||
Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
Selection agent | ||
ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
S100A12 Purification | ||
AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
H. pylori Culture | ||
Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |