Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Her presenterer vi en metode for å uttrykke og rense S100A12 (calgranulin C). Vi beskriver en protokoll for å måle sin antimikrobielle aktivitet mot det humane patogenet H. pylori .

Abstract

Calgranulin-proteiner er viktige mediatorer av medfødt immunitet og er medlemmer av S100-klassen i EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner. Noen S100 proteiner har kapasitet til å binde overgangsmetaller med høy affinitet og effektivt sekvestrere dem fra invaderende mikrobielle patogener i en prosess som kalles "ernæringsmessig immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både sink og kobber og er svært rikelig i medfødte immunkeller som makrofager og nøytrofiler. Vi rapporterer en raffinert metode for uttrykk, anrikning og rensing av S100A12 i sin aktive, metallbindende konfigurasjon. Utnyttelse av dette proteinet i bakteriell vekst og levedyktighetsanalyser viser at S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenet Helicobacter pylori . Den antimikrobielle aktiviteten er basert på den sinkbindende aktiviteten til S100A12, som chelaterer næringssink, derved sultende H. pylori som krever sink for vekst og proliferation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100 proteiner er en klasse av EF-hånd-familien av kalsiumbindende proteiner med et mangfoldig utvalg av funksjoner 1 . De uttrykkes i vev og celle-spesifikk måte, og regulerer et bredt spekter av cellefunksjoner 2 , 3 . Unik for kalsiumbindende proteiner, S100-proteiner viser både intracellulære og ekstracellulære funksjoner 4 , 5 . Innenfor cellen fremkaller Ca 2+ -binding en konformasjonsendring som avslører en hydrofob overflate som spesifikt retter seg mot proteinbindingspartnere 6 . Denne intracellulære mekanismen regulerer viktige prosesser som celleproliferasjon, differensiering og energi metabolisme. I det ekstracellulære miljøet utviser S100-proteiner to funksjoner 7 . I en, fungerer de som skade-relaterte molekylære mønster (DAMP) proteiner og initierer en pro-inflammatorAtorisk immunrespons gjennom interaksjon med mønstergenkjenningsreceptorer 8 , 9 . I tillegg har flere medlemmer av S100 proteinklasse-sekvestreren overgangsmetaller, en funksjon som tjener til å sulte mikrobielle patogener i en prosess betegnet næringsimmunitet 10 , 11 .

S100A12 (også kjent som calgranulin C og EN-RAGE) er svært uttrykt i makrofager og nøytrofiler og har blitt identifisert som en potensiell biomarkør for inflammatoriske sykdommer 12 , 13 . I tillegg til bindende kalsium ved sine EF-Hand-steder, har S100A12 to høyaffinitetsovergangsmetallbindingssteder lokalisert i motsatte ender av dimergrensesnittet 14 , 15 . Hvert bindingssted består av tre histidinrester og en asparaginsyrerest og kan chelere sink eller kobber <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Nylig rapporterte vi at S100A12-avhengig sinkhung er viktig for å regulere Helicobacter pylori- vekst og aktiviteten av proinflammatoriske virulensfaktorer 18 .

H. pylori infiserer magen på omtrent halvparten av verdens menneskelige befolkning; Noe som gjør det uten tvil en av de mest vellykkede bakterielle patogener 19 . Infeksjon med H. pylori kan føre til signifikante gastriske sykdomsutfall, inkludert gastritt, peptisk og duodenalt sår, slimhinde assosiert lymfoidvev (MALT) lymfom og invasivt gastrisk adenokarsinom (magekreft). Magekreft er den viktigste årsaken til ikke-kardiokreft-assosiert død i verden, og den største enkeltstående risikofaktoren for magekreft er infeksjon med H. pylori .

H. pylori fortsetter i gastrisk nisje til tross for en robuSt immunrespons på patogenet, understreker behovet for en bedre forståelse av immunmekanismer for å kontrollere denne bakterielle infeksjonen 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assosiert betennelse er preget av en dyp infiltrering av polymorfonukleære celler eller nøytrofiler som deponerer et repertoar av antimikrobielle proteiner, inkludert S100A12, på infeksjonsstedet 18 , 24 , 25 . I et forsøk på å forstå den komplekse dialogen mellom verten og patogenet, søkte vi å avgrense teknikken for å rense S100A12 og bruke den til å studere den antimikrobielle påvirkning den utøver på dette medisinsk relevante patogenet. Protokollen nedenfor skisserer en forbedret teknikk for S100A12 rensing i sin biologisk aktive tilstand; I stand til å binde næringsmetaller med høy affiniTy og chelater dem bort fra invaderende mikroorganismer. Videre fremhever metodene nedenfor bruken av dette proteinet som et kritisk reagens for å studere mekanismen ved hvilke medfødte antimikrobielle molekyler begrenser veksten av bakterielle patogener.

S100A-familieproteiner har fått takknemlighet som en viktig gruppe medfødte immunsystemmolekyler som deltar i immunsignaler samt vert-forsvar 27 . De mest godt studerte av disse er calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin er et neutrofilt assosiert protein som danner en heterodimer av S100A8- og S100A9-underenhetene som binder overgangsmetaller ved dimergrensesnittet 31 . Calprotectin har vist seg å ha to metallbindingssteder: Nettsted 1 kan binde Zn 2+ , Mn 2+ , eller Fe 2+ og Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Tallrike rapporter har vist at calprotectin har antimikrobielle aktiviteter mot forskjellige patogener, inkludert Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli og H. pylori , og at de hemmeffektene skyldes metallkeleringsaktiviteten til calprotectin 25 , 28 , 29 .

Tidligere arbeid demonstrert calprotectin utøver en rekke aktiviteter på H. pylori, inkludert å endre lipid A-strukturen i den ytre membranen, undertrykke cag- Type IV sekresjonssystemet (som er en stor proinflammatorisk virulensfaktor innen H. pylori ), indusere biofilmdannelse og undertrykke H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måteClass = "xref"> 25 , 33 . Videre viste genetiske og biokjemiske analyser den antibakterielle aktiviteten til calprotectin mot H. pylori i stor grad avledet fra sin evne til å binde næringssink 25 . H. pylori krever sink, som ble bestemt av tidligere forskning som benyttet et kjemisk definert medium for å fastslå mikronæringsstoffkravene for dette patogenet for å vokse og proliferere 34 . I tillegg var calprotectin svært rikelig innenfor H. pylori- infiserte vev og assosiert med neutrofile infiltrater, hvilket indikerer at verten kan benytte calprotectin som en antimikrobiell strategi under infeksjon og påfølgende inflammasjon 25 , 35 .

Nylige bevis fra objektive proteomics screening teknikker antyder at under forhold der reaktive oksygen arter er rikelig, calprotecTinn gjennomgår posttranslasjonelle modifikasjoner som endrer heksa-histidinbindingsstedet og derved hemmer den metallbindende aktivitet av proteinet 36 . Som sådan antydet vi at andre S100A-familieproteiner blant det brede repertoaret av disse molekylene kunne potensielt fungere som hjelpemetallkelatorer. Vi valgte S100A12 for videre studier fordi den ikke ble identifisert i den nevnte skjermen for posttranslasjonell modifikasjon, den har kapasitet til å binde sink, og den er svært rikelig i humant vev avledet fra H. pylori- infiserte personer.

Vårt arbeid indikerer at S100A12 kan hemme H. pylori vekst og levedyktighet på en doseavhengig måte i G27-stammen av H. pylori , og at den antimikrobielle aktiviteten til dette proteinet kan reverseres ved tilsetning av overskudd av næringsinnholdssink. Dette arbeidet kompletterer vårt tidligere arbeid som indikerer at S100A12 utøver antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 og 7.13 stammer av H. pylori , som demonstrerer sin brede antibakterielle aktivitet mot mange kliniske isolater og laboratorie-tilpassede stammer av H. pylori 18 . Sammen, disse resultatene bekrefter betydningen av S100A12 som en mekanisme for å kontrollere bakteriell vekst og spredning via ernæringsmessig immunitet. Fremtidige studier av denne viktige vertsbakterieinteraksjonen kan omfatte å utnytte aktiviteten til S100A12 for å redusere bakteriell byrde i vertsvev, eller bestemme bidraget av dette proteinet til immun-signalering i sammenheng med H. pylori- infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ekspression av S100A12

  1. Transform kompetent BL21 DE3-celler med et pGEMEX-S100a12-plasmid ved bruk av en standard varmeskokprotokoll 18 . Tilsett 1 til 5 μl plasmid til 50 μl bakterier i et mikrocentrifugerør på is. Inkuber i 20 min.
  2. Varm støt cellene ved 42 ° C i 30 s.
  3. Inkubér cellene på is i 2 minutter.
  4. Tilsett 500 μL SOC media til cellene. Inkuber ved 37 ° C ved risting ved 250 rpm på en orbital shaker i 1 time.
  5. Plate 150 μl av transformasjonsreaksjonen på LB-agar medium (tilsatt 100 μg / ml ampicillin). Inkuber i 12-16 timer ved 37 ° C.
  6. Velg en koloni. Inokuler 2 ml LB (tilsatt 100 μg / ml ampicillin).
  7. Inkubér i 4-6 timer ved 37 ° C på en orbital shaker (300 rpm). OD 600 skal lese mellom 1-3 absorbansenheter.
  8. Tilsett 500 μl starterkultur til 50 ml ZYM-5052 autoinduCtion media 26 tilsatt 100 μg / ml ampicillin. For best lufting og maksimal ekspresjon, bruk en 250 ml baffled Erlenmeyer-kolbe. Rist (300 rpm) i 24 timer ved 37 ° C.
  9. Overfør bakteriell suspensjon til et sentrifugerør. Pellene cellene ved sentrifugering (4000 xg, 10 min) ved 4 ° C.
  10. Dekanter media, logg prøve og lagre cellepasta ved -80 ° C. Prøven er stabil i mange år.

2. Rensing av S100A12 ved bruk av lavtrykkskromatografi

  1. Resuspender celler i 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonikere suspensjonen på is for å lyse celler. Bruk ~ 20 W utgang, 5 s på og 5 s av syklus i 5 min.
  3. Overfør løsningen til høyhastighets sentrifugerør. Klargjør cellelysatet ved sentrifugering, 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
  4. Dekanter supernatanten og overfør til en ren 100 ml polypropylenbeaker. Avkjøl løsningen ved å plassere begeret på is. Legg til en rørledningR og sakte tilsett 11,20 g ammoniumsulfat. La løsningen røre på is i ytterligere 1 time. Dette vil skape en 60% løsning av ammoniumsulfat og utfelle de fleste E. coli endogene proteiner. S100A12 forblir oppløselig.
  5. Sentrifuger løsningen ved 4 ° C, 20.000 xg i 20 minutter for å pelletere det utfelte protein.
  6. Dekanter supernatanten og overfør til dialyserør (MWCO 3,500 kDa). Dialyser mot 1 1 av 20 mM Tris, pH 8,0 ved 4 ° C. Bytt dialysebufferen to ganger. Tillat 4 timer mellom endringer.
  7. Anion utveksling kromatografi
    1. Utfør kromatografi på et lavtrykkssystem. Typisk strømningshastighet er 1 ml / min.
    2. Equilibrere en 5 ml Sepharose-kolonne med 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Last opp ~ 40 ml S100A12-løsningen ved hjelp av prøvepumpe (samle gjennomstrømningen).
    4. Vask kolonnen med 10 ml 20 mM Tris, pH 8.
    5. Utvikle kolonnen med en 0-30% gradient (BuFfer B er 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) over 19 kolonnevolumer (CV, 95 ml). Samle 5 ml fraksjoner.
    6. Ta en 10 μl alikvot av hver fraksjon og analyser ved å bruke MES SDS PAGE med Coomassie-farging. Kjør gel med konstant spenning (20 V / cm) i 30 min.
    7. Bassengfraksjoner som inneholder S100A12. S100A12 kjører ved ~ 10 kDa protein på en denaturerende gel.
    8. Konsentrer fraksjoner til 5 ml ved hjelp av en ultrafiltreringsanordning (MWCO 10 kDa). Sentrifuge ved 3000 xg i ~ 8 min. Ta toppfraksjonen.
  8. Størrelsesekskluderingskromatografi
    1. Equilibrere S75 kolonne med 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Injiser <5 ml konsentrerte S100A12 fraksjoner (fra ionebyttekromatografi).
    3. Utvikle kolonnen ved en strømningshastighet på 1 mL / m over 120 mL. Samle 5 ml fraksjoner.
    4. Ta en 10 μl alikvot av hver fraksjon og analyser ved å bruke SDS PAGE med Coomassie-farging. Validere proteinidentitet ved bruk avWestern blot eller massespektrometri (beregnet molekylvekt av monomer subunit 10,575,0 Da, målt 10575,4 Da).
  9. Bassengfraksjoner
    1. Mål absorbansen av proteinet A 280 ved bruk av et spektrofotometer. Bruk SEC-bufferen som et tomt. Den beregnede utryddelseskoeffisient for S100A12 homodimer er 5960 M -1 cm -1 .
      MERK: Typiske utbytter er 35-45 mg S100A12 per 50 ml kultur.
    2. Aliquot S100A12 i 1,5 ml mikrocentrifugerør (1 mg / rør), flashfrys i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C.

3. Antimikrobielle aktivitetsanalyser

  1. Strikk H. pylori- stammen G27 på tryptiske soyagarplater suppleres med 5% fårblod (blodagarplater). Vok 2-3 dager ved 37 ° C i romluft tilsatt 5% karbondioksid.
  2. Inokuler H. pylori i Brucella kjøttkraft supplert med 1x kolesterol. Kultur overNattristing (250 rpm) ved 37 ° C i romluft tilsatt 5% karbondioksid.
  3. Fortynn H. pylori 1:10 i 50% Brucella buljong, 50% calprotectin buffer plus 1x kolesterol og kultur i medium alene eller supplert med 100 μM sinkklorid pluss 0, 100 eller 1000 μg / ml renset S100A12. Kultur natten over rystes (250 rpm) ved 37 ° C i romluft tilsatt 5% karbondioksid.
  4. Følgende dag utfører serielle fortynninger og plate på blodagarplater. La bakteriekolonier vokse i 2-3 dager ved 37 ° C i romluft tilsatt 5% karbondioksid. Oppsummer kolonidannende enheter for å beregne bakteriell vekst i nærvær eller fravær av S100A12 og / eller eksogent sink.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12-uttrykk og rensing

En tre-trinns rensing ga ~ 40 mg rekombinant S100A12 fra 50 ml bakteriekultur. Det første trinnet var en ammoniumsulfatutfelling av endogene E. coli- proteiner. Dette trinn ble fulgt av anionbytterkromatografi ( figur 1A ). Proteinet spores av en SDS-PAGE farget med Coomassie Brilliant Blue ( figur 1B ). Det siste trinnet i rensingsprosedyren involverte samlefraksjoner som inneholder S100A12 for størrelsesekskluderingskromatografi som separerer proteiner med molekylvekt og form ( figur 2A ). S100A12 er en homodimer (92 aminosyrer per underenhet) og har en total molekylvekt på ca. 21 kDa. Fraksjoner oppsamlet fra størrelseseksklusjonskromatografi ble analysert ved SDS-PAGE og visualisert ved Coomassie-farging ( Figur 2B

S100A12 undertrykker bakteriell vekst via sinkkeleringsaktivitet

For å undersøke den antimikrobielle aktiviteten til S100A12 ble bakterielle levedyktighetsanalyser utført via kvantitative mikrobiologiske kulturteknikker ( figur 3 ). Oppsummering av bakterielle celler viser at eksponering for 100 μg / mL S100A12 i nærvær eller fravær av en eksogen kilde til næringssink ikke signifikant hemmer bakteriell levedyktighet sammenlignet med kontroller uten S100A12 tilsatt (P> 0,05, One way ANOVA). Eksponering for 1000 μg / mL S100A12 i medium alene resulterer i en 69 ganger nedsatt bakteriel levedyktighet sammenlignet med medium alene (P = 0,0193, Studentens t Test, P> 0,05 One Way ANOVA); Et resultat som ble reversert ved tilsetning av en eksogen kilde til næringssink (P = 0,023, Studentens t- test). Disse resultatene deMonstrate den antimikrobielle aktiviteten til S100A12 er avhengig av sin sink sekvestreringsaktivitet.

Figur 1
Figur 1: Cellelys og S100A12 rensing ved anionutvekslingskromatografi . ( A ) Kromatogram av ionbytterrensing. Spor av UV-absorbanse ved 280 nm vist i blå, saltgradient vist i rosa, oppsamlede fraksjoner merket med rødt. ( B ) SDS PAGE-gel av rensingstrinn. Baner: 1) molekylvekt standard 2) løselig lysatfraksjon 3) ammoniumsulfatpellet 4) ammoniumsulfat-supernatant 5-14) Q-kromatografiske fraksjoner 6-15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Figur 2: Størrelsesekskluderingskromatografi resultater av S100A12 rensing. ( A ) Kromatogram av størrelsesekskluderingsresultater. Spor av UV-absorbans ved 280 nm vist i blå, oppsamlede fraksjoner merket med rødt. ( B ) SDS PAGE-gel av størrelseseksklusjonskromatografi. Baner: 1) molekylvektmarkør 2) prøvebelastning 3-15) fraksjoner 10-21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Kvantitative kulturanalyser av bakteriell levedyktighet som respons på eksponering for S100A12-avhengig sinkinkelering. Bakterier ble eksponert for 0, 100 eller 100 μg / ml S100A12 i medium alene (gråstenger) eller medium tilsatt 100 μM sinkklorid(Sorte barer). Eksponering til 1000 μg / ml i fravær av en eksogen kilde til næringssink resulterer i signifikant inhibering av bakteriell levedyktighet (* P <0,05, Studentens t-test sammenlignet med medium + sink tilstand). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En effektiv protokoll for både ekspresjon og rensing av human S100A12 presenteres. E. coli- ekspresjonssystemet er det vanligste verktøyet som brukes til fremstilling av rekombinante proteiner, spesielt når mg mengder kreves for biokjemiske og biofysiske studier. En nøkkelforbedring av prosedyren beskrevet her er bruk av auto-induksjonsmedium 26 som øker utbyttet av renset protein med en faktor på nesten tretti sammenlignet med ekspresjon med standard Luria-buljongmedium 18 . I tillegg forenkler auto-induksjonsmediet i stor grad prosessen med proteinuttrykk. Ved bruk av konvensjonelle vekstmedier må kulturer overvåkes kontinuerlig slik at et induksjonsmiddel kan tilsettes under eksponentiell vekstfase. Det er ikke nødvendig å overvåke doblingstidene ved bruk av auto-induksjonsmedier. Kulturen får lov til å vokse til metning. Under de første stadiene av vekst med auto-induksjonPå media bruker E. coli glukose som karbonkilde. Når glukosen er utarmet, bytter bakteriene til laktose som en karbonkilde som inducerer proteinuttrykk 26 . Sammensetningen av auto-induksjonsmediet er utsøkt innstilt for å tillate vekst av høydensitetskulturer og derfor økt ekspresjon av rekombinant protein. I vår erfaring med S100A12 øker auto-induksjonsmediet økt mengde uttrykt protein, men vi varsler om at dette kan være proteinavhengig og bør verifiseres eksperimentelt.

S100A12 uttrykkes i den cytoplasmatiske fraksjonen av E. coli som antyder at den er løselig og brettet. Det første trinnet i rensingen innebærer å tilsette en høy prosentandel ammoniumsulfat som utfeller mange av de endogene E. coli proteiner. Dette trinnet utnytter den høye stabiliteten og oppløseligheten av S100-familien av proteiner. S100A12 er moderat surt (pI 5,81). Således renses S100A12 videre med en sterk anionbytterharpiks. Det siste trinnet i renseprosessen er en størrelsesekskluderingskromatografikolonne som sikrer at S100A12 er monodispers og dimerisk. Dette trinnet i protokollen er avgjørende ettersom S100A12 har vist seg å danne oppløselige oligomerer 15, og det er ukjent hvilken påvirkning oligomeriseringen kan ha på sin antimikrobielle aktivitet. Siden medlemmer av S100-klassen deler høy sekvens og strukturell homologi, er deres fysiske egenskaper like 27 . Derfor kan denne rensemetoden for S100A12 være bredt anvendelig for alle S100 proteiner som uttrykkes i den løselige fraksjon av E. coli.

Tidligere arbeid har vist at S100 proteiner, som for eksempel calprotectin, har antimikrobiell aktivitet mot bakterielle patogener som H. pylori, og at denne aktiviteten er avhengig av sinkbindende aktivitet 25 . AntimikrobotenIal aktivitet av S100A12 er også sinkavhengig, men vekstinhiberingen demonstrert i bakterievekstforsøk avslører at betydelig mer S100A12 er nødvendig for å hemme vekst sammenlignet med andre S100-familieproteiner som calprotectin. Det er derfor kritisk å bruke høyere konsentrasjoner av S100A12 enn kalprotektin for å oppnå lignende fenotyper (vekstinhibering eller forandringer i virulens). Fremtidige bruksområder av denne protokollen kan brukes for å bestemme globale endringer i bakterielle genuttrykk, metabolomiske eller proteomiske endringer som følge av metallsekvestrasjonen pålagt av S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Department of Veterans Affairs Karriereutvikling Pris 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 fra National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 og 1400969, og NIH gi GM05551. Innholdet er utelukkende av forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis offisielle synspunkter på Nasjonalt senter for fremme av oversettelseskunnskap eller Nasjonalt institutt for helse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter