Här presenterar vi en metod för att uttrycka och rena S100A12 (kalgranulin C). Vi beskriver ett protokoll för att mäta dess antimikrobiella aktivitet mot den mänskliga patogenen H. pylori .
Calgranulin-proteiner är viktiga medlare av medfödd immunitet och är medlemmar i S100-klassen i EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner. Vissa S100 proteiner har kapacitet att binda övergångsmetaller med hög affinitet och effektivt sekvestrera dem bort från invaderande mikrobiella patogener i en process som kallas "näringsrik immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både zink och koppar och är mycket rikligt i medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Vi rapporterar en förfinad metod för uttryck, berikning och rening av S100A12 i sin aktiva, metallbindande konfiguration. Utnyttjande av detta protein i bakteriell tillväxt och genomförbarhetsanalyser visar att S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenen Helicobacter pylori . Den antimikrobiella aktiviteten är baserad på den zinkbindande aktiviteten hos S100A12, som chelaterar näringszink och därmed svälter H. pylori som kräver zink för tillväxt och proliferation.
S100-proteiner är en klass av EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner med en mängd olika funktioner 1 . De uttrycks på ett vävnads- och cellspecifikt sätt och reglerar ett brett spektrum av cellulära funktioner 2 , 3 . Unika för kalciumbindande proteiner, S100-proteiner uppvisar både intracellulära och extracellulära funktioner 4 , 5 . Inuti cellen inducerar Ca2 + -bindning en konformationsändring som exponerar en hydrofob yta som specifikt riktar proteinbindande partner 6 . Denna intracellulära mekanism reglerar viktiga processer som cellproliferation, differentiering och energimetabolism. I den extracellulära miljön uppvisar S100-proteiner två funktioner 7 . I en fungerar de som skador associerade molekylära mönster (DAMP) proteiner och initierar en pro-inflammatorAtom immunsvar genom interaktion med mönsterigenkänningsreceptorer 8 , 9 . Dessutom adderar flera medlemmar av S100 proteinklass-sekvestreringsmetaller, en funktion som tjänar till att svälta mikrobiella patogener i en process som kallas näringsmässig immunitet 10 , 11 .
S100A12 (även känd som calgranulin C och EN-RAGE) uttrycks starkt i makrofager och neutrofiler och har identifierats som en potentiell biomarkör för inflammatoriska sjukdomar 12 , 13 . Förutom bindande kalcium vid sina EF-Hand-ställen har S100A12 två högaffinitetsövergångsmetallbindningsställen belägna i motsatta ändar av dimergränssnittet 14 , 15 . Varje bindningsställe består av tre histidinrester och en asparaginsyrarest och kan kelatera zink eller koppar <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Nyligen rapporterade vi att S100A12-beroende zinksulten är viktig för att reglera Helicobacter pylori -tillväxten och aktiviteten av proinflammatoriska virulensfaktorer 18 .
H. pylori infekterar magen på ungefär hälften av världens mänskliga befolkning; Gör det förmodligen ett av de mest framgångsrika bakteriepatogenerna 19 . Infektion med H. pylori kan leda till signifikanta gastriska sjukdomar, inklusive gastrit, peptiskt och duodenalt sår, slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom och invasivt gastrisk adenokarcinom (magkreft). Magskräft är den främsta orsaken till den icke-kardiocancerrelaterade döden i världen, och den enskilt största associerade riskfaktorn för magcancer är infektion med H. pylori .
H. pylori kvarstår i magisk nisch trots en robuSt immunsvar mot patogenen, vilket understryker behovet av en bättre förståelse av immunmekanismer för att kontrollera denna bakteriella infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pyloriassocierad inflammation kännetecknas av en djup infiltrering av polymorfonukleära celler eller neutrofiler som deponerar en repertoar av antimikrobiella proteiner, inklusive S100A12, vid infektionsstället 18 , 24 , 25 . I ett försök att förstå den komplexa dialogen mellan värd och patogen, försökte vi förfina tekniken för att rena S100A12 och använda den för att studera den antimikrobiella påverkan den utövar på denna medicinskt relevanta patogen. Protokollet nedan beskriver en förbättrad teknik för S100A12-rening i sitt biologiskt aktiva tillstånd; Kunna binda näringsmetaller med hög affiniTy och chelatera dem bort från invaderande mikroorganismer. Vidare markerar metoderna nedan nyttan av detta protein som ett kritiskt reagens för att studera mekanismen genom vilken medfödda antimikrobiella molekyler begränsar tillväxten av bakteriella patogener.
S100A-familjeproteiner har fått uppskattning som en viktig grupp av medfödda immunsystemmolekyler som deltar i immunförsvar samt värdförsvar 27 . De mest väl studerade av dessa är calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin är ett neutrofilt associerat protein som bildar en heterodimer av S100A8- och S100A9-subenheterna som binder övergångsmetaller vid dimergränssnittet 31 . Kalprotektin har visat sig ha två metallbindningsställen: Ställe 1 kan binda Zn 2+ , Mn 2+ eller Fe 2+ och Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Många rapporter har visat att calprotectin har antimikrobiella aktiviteter mot olika patogener, inklusive Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli och H. pylori , och att de inhiberande effekterna beror på metallkeleringsaktiviteten hos calprotectin 25 , 28 , 29 .
Tidigare arbete visat sig kalprotektin utövar många aktiviteter på H. pylori, inklusive förändring av lipid A-strukturen i yttermembranet, undertryckande av cag- TYP IV-sekretionssystemet (vilket är en stor proinflammatorisk virulensfaktor inom H. pylori ), inducerar biofilmbildning och undertrycker H. pylori tillväxt och lönsamhet på ett dosberoende sättClass = "xref"> 25 , 33 . Vidare avslöjade genetiska och biokemiska analyser den antibakteriella aktiviteten hos kalprotektin mot H. pylori till stor del härleddes från dess förmåga att binda näringszink 25 . H. pylori kräver zink, vilket bestämdes av tidigare forskning, som utnyttjade ett kemiskt definierat medium för att fastställa mikronäringsämneskraven för denna patogen att växa och proliferera 34 . Dessutom var calprotectin mycket rikligt inom H. pylori- infekterade vävnader och associerade med neutrofila infiltrat, vilket indikerar att värden kan använda kalprotektin som en antimikrobiell strategi under infektion och efterföljande inflammation 25 , 35 .
Nyliga bevis från objektiva proteomics screeningstekniker antyder att under betingelser där reaktiva syrearter är rikliga, kalprotecTenn genomgår post-translationella modifieringar som förändrar hexa-histidinbindningsstället och därmed hämmar den metallbindande aktiviteten hos proteinet 36 . Som sådan förutsåg vi att andra S100A-familjeproteiner bland den breda repertoaren av dessa molekyler potentiellt kan fungera som hjälpmetallkelatorer. Vi valde S100A12 för vidare studier eftersom den inte identifierades i ovannämnda skärm för posttranslationell modifiering, den har kapacitet att binda zink och det är mycket rikligt i humana vävnader härrörande från H. pyloriinfekterade individer.
Vårt arbete indikerar att S100A12 kan hämma H. pylori- tillväxt och livskraft på ett dosberoende sätt i G27-stammen av H. pylori , och att den antimikrobiella aktiviteten hos detta protein kan reverseras genom tillsats av överskott av näringssänkt zink. Detta arbete kompletterar vårt tidigare arbete som indikerar S100A12 utövat antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 och 7.13-stammar av H. pylori , som demonstrerar sin breda antibakteriella aktivitet mot många kliniska isolat och laboratorieanpassade stammar av H. pylori 18 . Tillsammans bekräftar dessa resultat betydelsen av S100A12 som en mekanism för att kontrollera bakteriell tillväxt och proliferation via näringsförmåga. Framtida studier av denna viktiga värd-bakteriella interaktion kan innefatta utnyttjande av aktiviteten av S100A12 för att minska bakteriell börda i värdvävnader eller bestämning av detta proteins bidrag till immun-signalering i samband med H. pylori- infektion.
Ett effektivt protokoll för både uttryck och rening av humant S100A12 presenteras. E. coli- expressionssystemet är det vanligaste verktyget som används för framställning av rekombinanta proteiner, särskilt när mängder krävs för biokemiska och biofysiska studier. En nyckelförbättring av proceduren som beskrivs här är användningen av auto-induktionsmedium 26 som ökar utbytet av renat protein med en faktor på nästan trettio jämfört med uttryck med standard Luria-buljong…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Department of Veterans Affairs Karriärutvecklingspris 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 från National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 och 1400969, och NIH bevilja GM05551. Dess innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis officiella synpunkter på National Center for Advancing Translational Sciences eller National Institutes of Health.
S100A12 Expression | ||
Expression cells | ||
BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
Autoinduction medium components | ||
Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
Selection agent | ||
ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
S100A12 Purification | ||
AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
H. pylori Culture | ||
Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |