Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

Här presenterar vi en metod för att uttrycka och rena S100A12 (kalgranulin C). Vi beskriver ett protokoll för att mäta dess antimikrobiella aktivitet mot den mänskliga patogenen H. pylori .

Abstract

Calgranulin-proteiner är viktiga medlare av medfödd immunitet och är medlemmar i S100-klassen i EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner. Vissa S100 proteiner har kapacitet att binda övergångsmetaller med hög affinitet och effektivt sekvestrera dem bort från invaderande mikrobiella patogener i en process som kallas "näringsrik immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både zink och koppar och är mycket rikligt i medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Vi rapporterar en förfinad metod för uttryck, berikning och rening av S100A12 i sin aktiva, metallbindande konfiguration. Utnyttjande av detta protein i bakteriell tillväxt och genomförbarhetsanalyser visar att S100A12 har antimikrobiell aktivitet mot bakteriepatogenen Helicobacter pylori . Den antimikrobiella aktiviteten är baserad på den zinkbindande aktiviteten hos S100A12, som chelaterar näringszink och därmed svälter H. pylori som kräver zink för tillväxt och proliferation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100-proteiner är en klass av EF-hand-familjen av kalciumbindande proteiner med en mängd olika funktioner 1 . De uttrycks på ett vävnads- och cellspecifikt sätt och reglerar ett brett spektrum av cellulära funktioner 2 , 3 . Unika för kalciumbindande proteiner, S100-proteiner uppvisar både intracellulära och extracellulära funktioner 4 , 5 . Inuti cellen inducerar Ca2 + -bindning en konformationsändring som exponerar en hydrofob yta som specifikt riktar proteinbindande partner 6 . Denna intracellulära mekanism reglerar viktiga processer som cellproliferation, differentiering och energimetabolism. I den extracellulära miljön uppvisar S100-proteiner två funktioner 7 . I en fungerar de som skador associerade molekylära mönster (DAMP) proteiner och initierar en pro-inflammatorAtom immunsvar genom interaktion med mönsterigenkänningsreceptorer 8 , 9 . Dessutom adderar flera medlemmar av S100 proteinklass-sekvestreringsmetaller, en funktion som tjänar till att svälta mikrobiella patogener i en process som kallas näringsmässig immunitet 10 , 11 .

S100A12 (även känd som calgranulin C och EN-RAGE) uttrycks starkt i makrofager och neutrofiler och har identifierats som en potentiell biomarkör för inflammatoriska sjukdomar 12 , 13 . Förutom bindande kalcium vid sina EF-Hand-ställen har S100A12 två högaffinitetsövergångsmetallbindningsställen belägna i motsatta ändar av dimergränssnittet 14 , 15 . Varje bindningsställe består av tre histidinrester och en asparaginsyrarest och kan kelatera zink eller koppar <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Nyligen rapporterade vi att S100A12-beroende zinksulten är viktig för att reglera Helicobacter pylori -tillväxten och aktiviteten av proinflammatoriska virulensfaktorer 18 .

H. pylori infekterar magen på ungefär hälften av världens mänskliga befolkning; Gör det förmodligen ett av de mest framgångsrika bakteriepatogenerna 19 . Infektion med H. pylori kan leda till signifikanta gastriska sjukdomar, inklusive gastrit, peptiskt och duodenalt sår, slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom och invasivt gastrisk adenokarcinom (magkreft). Magskräft är den främsta orsaken till den icke-kardiocancerrelaterade döden i världen, och den enskilt största associerade riskfaktorn för magcancer är infektion med H. pylori .

H. pylori kvarstår i magisk nisch trots en robuSt immunsvar mot patogenen, vilket understryker behovet av en bättre förståelse av immunmekanismer för att kontrollera denna bakteriella infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pyloriassocierad inflammation kännetecknas av en djup infiltrering av polymorfonukleära celler eller neutrofiler som deponerar en repertoar av antimikrobiella proteiner, inklusive S100A12, vid infektionsstället 18 , 24 , 25 . I ett försök att förstå den komplexa dialogen mellan värd och patogen, försökte vi förfina tekniken för att rena S100A12 och använda den för att studera den antimikrobiella påverkan den utövar på denna medicinskt relevanta patogen. Protokollet nedan beskriver en förbättrad teknik för S100A12-rening i sitt biologiskt aktiva tillstånd; Kunna binda näringsmetaller med hög affiniTy och chelatera dem bort från invaderande mikroorganismer. Vidare markerar metoderna nedan nyttan av detta protein som ett kritiskt reagens för att studera mekanismen genom vilken medfödda antimikrobiella molekyler begränsar tillväxten av bakteriella patogener.

S100A-familjeproteiner har fått uppskattning som en viktig grupp av medfödda immunsystemmolekyler som deltar i immunförsvar samt värdförsvar 27 . De mest väl studerade av dessa är calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin är ett neutrofilt associerat protein som bildar en heterodimer av S100A8- och S100A9-subenheterna som binder övergångsmetaller vid dimergränssnittet 31 . Kalprotektin har visat sig ha två metallbindningsställen: Ställe 1 kan binda Zn 2+ , Mn 2+ eller Fe 2+ och Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Många rapporter har visat att calprotectin har antimikrobiella aktiviteter mot olika patogener, inklusive Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli och H. pylori , och att de inhiberande effekterna beror på metallkeleringsaktiviteten hos calprotectin 25 , 28 , 29 .

Tidigare arbete visat sig kalprotektin utövar många aktiviteter på H. pylori, inklusive förändring av lipid A-strukturen i yttermembranet, undertryckande av cag- TYP IV-sekretionssystemet (vilket är en stor proinflammatorisk virulensfaktor inom H. pylori ), inducerar biofilmbildning och undertrycker H. pylori tillväxt och lönsamhet på ett dosberoende sättClass = "xref"> 25 , 33 . Vidare avslöjade genetiska och biokemiska analyser den antibakteriella aktiviteten hos kalprotektin mot H. pylori till stor del härleddes från dess förmåga att binda näringszink 25 . H. pylori kräver zink, vilket bestämdes av tidigare forskning, som utnyttjade ett kemiskt definierat medium för att fastställa mikronäringsämneskraven för denna patogen att växa och proliferera 34 . Dessutom var calprotectin mycket rikligt inom H. pylori- infekterade vävnader och associerade med neutrofila infiltrat, vilket indikerar att värden kan använda kalprotektin som en antimikrobiell strategi under infektion och efterföljande inflammation 25 , 35 .

Nyliga bevis från objektiva proteomics screeningstekniker antyder att under betingelser där reaktiva syrearter är rikliga, kalprotecTenn genomgår post-translationella modifieringar som förändrar hexa-histidinbindningsstället och därmed hämmar den metallbindande aktiviteten hos proteinet 36 . Som sådan förutsåg vi att andra S100A-familjeproteiner bland den breda repertoaren av dessa molekyler potentiellt kan fungera som hjälpmetallkelatorer. Vi valde S100A12 för vidare studier eftersom den inte identifierades i ovannämnda skärm för posttranslationell modifiering, den har kapacitet att binda zink och det är mycket rikligt i humana vävnader härrörande från H. pyloriinfekterade individer.

Vårt arbete indikerar att S100A12 kan hämma H. pylori- tillväxt och livskraft på ett dosberoende sätt i G27-stammen av H. pylori , och att den antimikrobiella aktiviteten hos detta protein kan reverseras genom tillsats av överskott av näringssänkt zink. Detta arbete kompletterar vårt tidigare arbete som indikerar S100A12 utövat antimikrobiell aktivitet mot PMSS1 och 7.13-stammar av H. pylori , som demonstrerar sin breda antibakteriella aktivitet mot många kliniska isolat och laboratorieanpassade stammar av H. pylori 18 . Tillsammans bekräftar dessa resultat betydelsen av S100A12 som en mekanism för att kontrollera bakteriell tillväxt och proliferation via näringsförmåga. Framtida studier av denna viktiga värd-bakteriella interaktion kan innefatta utnyttjande av aktiviteten av S100A12 för att minska bakteriell börda i värdvävnader eller bestämning av detta proteins bidrag till immun-signalering i samband med H. pylori- infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Uttryck av S100A12

  1. Transformera kompetenta BL21 DE3-celler med en pGEMEX-S100a12-plasmid med användning av ett standard-värmekokprotokoll 18 . Tillsätt 1 till 5 pi plasmid till 50 pi bakterier i ett mikrocentrifugrör på is. Inkubera i 20 min.
  2. Värme chocker cellerna vid 42 ° C i 30 s.
  3. Inkubera cellerna på is under 2 minuter.
  4. Tillsätt 500 μl SOC media till cellerna. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm på en orbital-skakare under 1 timme.
  5. Plåt 150 μl av transformationsreaktionen på LB-agarmedium (kompletterat med 100 | ig / ml ampicillin). Inkubera i 12-16 h vid 37 ° C.
  6. Välj en koloni. Inokulera 2 ml LB (kompletterat med 100 μg / ml ampicillin).
  7. Inkubera i 4-6 timmar vid 37 ° C på en orbital shaker (300 rpm). OD 600 bör läsa mellan 1-3 absorbansenheter.
  8. Tillsätt 500 μl startkultur till 50 ml ZYM-5052 autoinduCtion media 26 kompletterat med 100 | ig / ml ampicillin. För bästa beluftning och maximala uttryck, använd en 250 ml förkylad Erlenmeyer-kolv. Skaka (300 rpm) i 24 h vid 37 ° C.
  9. Överför bakteriell suspension till ett centrifugrör. Pelleten cellerna genom centrifugering (4000 xg, 10 min) vid 4 ° C.
  10. Dekantera media, loggprov och lagra cellpasta vid -80 ° C. Provet är stabilt i flera år.

2. Rening av S100A12 med användning av lågtryckskromatografi

  1. Resuspendera celler i 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonikera suspensionen på is för att lysera celler. Använd ~ 20 W utmatning, 5 s on och 5 s off cykel i 5 min.
  3. Överför lösningen till höghastighetscentrifugrör. Klarera celllysatet genom centrifugering, 20 000 xg i 30 min vid 4 ° C.
  4. Dekantera supernatanten och överföra till en ren 100 ml polypropylenbägare. Kyl lösningen genom att placera bägaren på is. Lägg till en omrörning baR och tillsätt långsamt 11,20 g ammoniumsulfat. Låt lösningen omröra på is under ytterligare 1 h. Detta kommer att skapa en 60% lösning av ammoniumsulfat och fälla ut de flesta av de E. coli endogena proteinerna. S100A12 kommer att förbli löslig.
  5. Centrifugera lösningen vid 4 ° C, 20 000 xg under 20 minuter för att pelleta det utfällda proteinet.
  6. Dekantera supernatanten och överföra till dialysrör (MWCO 3,500 kDa). Dialysera mot 1 1 av 20 mM Tris, pH 8,0 vid 4 ° C. Byt dialysbufferten två gånger. Tillåt 4 timmar mellan ändringarna.
  7. Anjonbytarkromatografi
    1. Utför kromatografi på ett lågtrycksystem. Typisk flödeshastighet är 1 ml / min.
    2. Ekvilibrera en 5 ml Sepharose-kolonn med 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Ladda upp ~ 40 ml S100A12-lösningen med hjälp av provpumpen (samla flödet genom).
    4. Tvätta kolonnen med 10 ml 20 mM Tris, pH 8.
    5. Utveckla kolonnen med en 0-30% gradient (BuFfer B är 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) över 19 kolonnvolymer (CV, 95 ml). Samla 5 ml fraktioner.
    6. Ta en 10 μl alikvot av varje fraktion och analysera med användning av MES SDS PAGE med Coomassie-färgning. Kör gel med konstant spänning (20 V / cm) i 30 min.
    7. Poolfraktioner innehållande S100A12. S100A12 körs vid ~ 10 kDa protein på en denaturerande gel.
    8. Koncentrera fraktioner till 5 ml med hjälp av en ultrafiltreringsanordning (MWCO 10 kDa). Centrifugera vid 3000 xg i ~ 8 min. Ta den bästa fraktionen.
  8. Storleksuteslutningskromatografi
    1. Ekvilibrera S75 kolonn med 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Injicera <5 ml koncentrerade S100A12-fraktioner (från jonbyteskromatografi).
    3. Utveckla kolonnen med en flödeshastighet på 1 ml / m över 120 ml. Samla 5 ml fraktioner.
    4. Ta en 10 μl alikvot av varje fraktion och analysera med användning av SDS PAGE med Coomassie-färgning. Validera proteinidentitet med användning avWestern blot eller masspektrometri (beräknad molekylvikt av monomer subenhet 10,575,0 Da, mätt 10575,4 Da).
  9. Poolfraktioner
    1. Mät absorbansen av proteinet A 280 med användning av en spektrofotometer. Använd SEC-bufferten som ett tomt. Den beräknade extinktionskoefficienten för S100A12 homodimer är 5960 M -1 cm -1 .
      OBS: Typiska utbyten är 35-45 mg S100A12 per 50 ml odling.
    2. Aliquot S100A12 i 1,5 ml mikrocentrifugrör (1 mg / rör), bli fryst i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.

3. Antimikrobiella aktivitetsanalyser

  1. Streak H. pylori stam G27 på tryptiska soja agarplattor kompletterade med 5% fårblod (blodagarplattor). Växa 2-3 dagar vid 37 ° C i rumsluft kompletterad med 5% koldioxid.
  2. Inokulera H. pylori i Brucella buljong kompletterad med 1x kolesterol. Kultur överNattskakning (250 rpm) vid 37 ° C i rumsluft kompletterad med 5% koldioxid.
  3. Späd H. pylori 1:10 till 50% Brucella buljong, 50% kalprotektinbuffert plus 1x kolesterol och odling i medium ensamt eller kompletterat med 100 | iM zinkklorid plus 0, 100 eller 1000 | ig / ml renad S100A12. Kultur över natt skakning (250 rpm) vid 37 ° C i rumsluft kompletterad med 5% koldioxid.
  4. Följande dag utför seriella utspädningar och plattan på blodagarplattor. Låt bakteriekolonier växa i 2-3 dagar vid 37 ° C i rumsluft kompletterad med 5% koldioxid. Räkna upp kolonidannande enheter för att beräkna bakteriell tillväxt i närvaro eller frånvaro av S100A12 och / eller exogen zink.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12-uttryck och rening

En tre-stegs rening gav ~ 40 mg rekombinant S100A12 från 50 ml bakteriekultur. Det första steget var en ammoniumsulfatutfällning av endogena E. coli- proteiner. Detta steg följdes av anjonbyteskromatografi ( Figur 1A ). Proteinet spåras av en SDS-PAGE färgad med Coomassie Brilliant Blue ( Figur 1B ). Det sista steget i reningsproceduren involverade sammanslagning av fraktioner innehållande S100A12 för storlekselimineringskromatografi som separerar proteiner med molekylvikt och form ( Figur 2A ). S100A12 är en homodimer (92 aminosyror per subenhet) och har en total molekylvikt av ca 21 kDa. Fraktioner uppsamlade från storlekselimineringskromatografi analyserades med SDS-PAGE och visualiserades genom Coomassie-färgning ( Figur 2B

S100A12 bekämpar bakteriell tillväxt via zinkkeleringsaktivitet

För att undersöka den antimikrobiella aktiviteten av S100A12 utfördes analyser av bakteriell bärbarhet genom kvantitativ mikrobiologisk odlingsteknik ( Figur 3 ). Uppräkning av bakterieceller visar att exponering för 100 μg / ml S100A12 i närvaro eller frånvaro av en exogen källa av näringszink inte signifikant hämmar bakteriell bärbarhet jämfört med kontroller utan S100A12 tillsatt (P> 0,05, Envägs ANOVA). Exponering för 1000 μg / ml S100A12 i medium ger emellertid en 69-faldig minskning av bakteriell bärbarhet jämfört med mediet ensamt (P = 0,0193, Studentens t- test, P> 0,05 One Way ANOVA); Ett resultat som reverserades genom tillsats av en exogen källa av näringszink (P = 0,023, Studentens t- test). Dessa resultat deMonstrera den antimikrobiella aktiviteten hos S100A12 är beroende av sin zinksekvestreringsaktivitet.

Figur 1
Figur 1: Celllys och S100A12-rening genom anjonbytarkromatografi . ( A ) Kromatogram av jonbytesrening. Spår av UV-absorbans vid 280 nm, visad i blått, saltgradient avbildad i rosa, uppsamlade fraktioner märkta i rött. ( B ) SDS PAGE-gel av reningssteg. Banor: 1) molekylviktstandard 2) löslig lysatfraktion 3) ammoniumsulfatpellet 4) ammoniumsulfatsupernatant 5-14) Q-kromatografiska fraktioner 6-15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2 Figur 2: Storleksutslagningskromatografi resultat av S100A12 rening. ( A ) Kromatogram av resultat för storleksfel. Spår av UV-absorbans vid 280 nm i blå, uppsamlade fraktioner märkta i rött. ( B ) SDS PAGE-gel av storlekselimineringskromatografi. Banor: 1) molekylviktmarkör 2) provbelastning 3-15) fraktioner 10-21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Kvantitativa kulturanalyser av bakteriell bärbarhet som svar på exponering för S100A12-beroende zinkkelation. Bakterier exponerades för 0, 100 eller 100 | ig / ml S100A12 i medium ensamt (gråstänger) eller medium kompletterat med 100 | iM zinkklorid(Svarta staplar). Exponering till 1000 μg / ml i frånvaro av en exogen källa av näringszink resulterar i signifikant inhibering av bakteriell bärbarhet (* P <0,05, Studentens t-test jämfört med medel + zinktillstånd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett effektivt protokoll för både uttryck och rening av humant S100A12 presenteras. E. coli- expressionssystemet är det vanligaste verktyget som används för framställning av rekombinanta proteiner, särskilt när mängder krävs för biokemiska och biofysiska studier. En nyckelförbättring av proceduren som beskrivs här är användningen av auto-induktionsmedium 26 som ökar utbytet av renat protein med en faktor på nästan trettio jämfört med uttryck med standard Luria-buljongmedium 18 . Dessutom förenklar auto-induktionsmediet kraftigt proteinuttryckets arbetsflöde. Med användning av konventionella tillväxtmedier måste kulturer kontinuerligt övervakas så att ett inducerande medel kan tillsättas under exponentiell tillväxtfas. Det är inte nödvändigt att övervaka fördubblingstiderna vid användning av auto-induktionsmedia. Kulturerna får växa till mättnad. Under de första stadierna av tillväxt med autoinduktiPå media använder E. coli glukos som kolkälla. När glukosen är utarmad växlar bakterierna till laktos som en kolkälla som inducerar proteinuttryck 26 . Sammansättningen av det auto-inducerande mediet är utsökt inställt för att möjliggöra tillväxten av kulturer med hög densitet och därmed ökat uttryck av rekombinant protein. I vår erfarenhet av S100A12 ökar auto-induktionsmediet kraftigt mängden uttryckt protein, men vi varnar för att detta kan vara proteinberoende och bör verifieras experimentellt.

S100A12 uttrycks i den cytoplasmatiska fraktionen av E. coli vilket antyder att den är löslig och välviktad. Det första steget i reningen innebär att man tillsätter en hög procentandel av ammoniumsulfat som utfäller många av de endogena E. coli- proteinerna. Detta steg utnyttjar den höga stabiliteten och lösligheten hos S100-familjen av proteiner. S100A12 är måttligt surt (pI 5,81). Sålunda renas S100A12 vidare med ett starkt anjonbytarharts. Det sista steget i reningsprocessen är en kolonn med storlekselimineringskromatografi som säkerställer att S100A12 är monodispers och dimerisk. Detta steg i protokollet är avgörande eftersom S100A12 har visats bilda lösliga oligomerer 15 och det är okänt vilken påverkan oligomerisering kan ha på dess antimikrobiella aktivitet. Eftersom medlemmar i S100-klassen delar hög sekvens och strukturell homologi, är deras fysikaliska egenskaper liknande 27 . Följaktligen kan denna reningsmetod av S100A12 vara brett tillämplig på alla S100 proteiner som uttrycks i den lösliga fraktionen av E. coli.

Tidigare arbete har visat att S100-proteiner, såsom kalprotektin, har antimikrobiell aktivitet mot bakteriella patogener, såsom H. pylori, och att denna aktivitet är beroende av zinkbindande aktivitet 25 . AntimikrobiDen aktiva aktiviteten hos S100A12 är också zinkberoende, men tillväxthämningen som visas i bakterieutvecklingsanalyser avslöjar att betydligt mer S100A12 krävs för att hämma tillväxt jämfört med andra S100-familjeproteiner, såsom kalprotektin. Det är således kritiskt att använda högre koncentrationer av S100A12 än kalprotektin för att uppnå liknande fenotyper (tillväxtinhibering eller förändringar i virulens). Framtida tillämpningar av detta protokoll kan användas för att bestämma globala förändringar i bakteriella genuttryck, metabolomiska eller proteomiska förändringar som svar på den metallbindning som införs av S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Department of Veterans Affairs Karriärutvecklingspris 1IK2BX001701, CTSA-pris UL1TR000445 från National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 och 1400969, och NIH bevilja GM05551. Dess innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis officiella synpunkter på National Center for Advancing Translational Sciences eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter