Summary
在这里，我们描述了用于通过液相色谱法和质谱分析法从金黄色葡萄球菌和它们的后续分析的代谢物的提取的协议。
Abstract
在努力阻止细菌病原体，主机往往限制了营养素在感染部位的可用性。这种限制可以改变，其调控因子做出响应，调节细胞代谢关键代谢物的丰度。近年来，一些蛋白质和RNA已成为致病基因表达的重要调节器。例如，科迪蛋白响应支链氨基酸和GTP的水平并广泛保守的低G + C革兰氏阳性细菌。如金黄色葡萄球菌全球监管机构，科迪控制数十种毒性和代谢基因的表达。我们推测， 金黄色葡萄球菌使用CODY，部分地改变在努力适应宿主环境可能遇到的营养限制条件的代谢状态。这个手稿描述了使用加上质谱液相色谱法从金黄色葡萄球菌提取并分析代谢物的方法trometry，开发是为了检验这一假设的协议。该方法还强调，将确保严密性和可重复性的最佳做法，如维持生物稳态和不断充气，无需使用连续恒化培养。相对于USA200甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌分离UAMS-1亲本菌株，同基因的突变体科迪表现出从天门冬氨酸（ 例如 ，苏氨酸和异亮氨酸）衍生的氨基酸显著增加和它们的前体下降（ 例如 ，天冬氨酸和O- -acetylhomoserine ）。这些发现与RNA-SEQ分析获得的转录数据良好相关：基因在这些途径均在科迪无效突变体10和800倍之间上调。耦合转录组和代谢组的整体分析可以揭示细菌如何改变它们的代谢，当面对的环境或营养应激，提供潜在洞察的PHY与养分枯竭相关iological变化感染期间经历。这些发现可能铺平新型抗感染药物和治疗学的发展道路。
Introduction
细菌病原体必须与主机环境中的诸多挑战抗衡。除了通过免疫细胞直接攻击时，主机还吸收营养物质对细菌的生存和复制，产生营养免疫力1，2至关重要。为了生存，这些恶劣的环境中，细菌病原体部署致病因子。其中的一些因素使得细菌逃避免疫反应;其他因素包括分泌的消化酶，如透明质酸酶，热核反应的，和脂肪酶，其可以使得细菌通过消耗组织来源的成分3，4，5以补充缺少的营养成分。事实上，细菌已经进化出扎细胞的生理状态到生产毒力因子6,7的调节系统，
越来越多的证据指向身体科迪到作为一个关键调节器连接代谢和毒性。虽然在枯草芽孢杆菌首先发现作为二肽通透（DPP）基因11的阻遏，科迪现在已知要产生由几乎所有的低G + C革兰氏阳性菌12,13和调节几十参与碳基因和氮代谢14，15，16，17，18，19。在致病物种，科迪还控制的一些最重要的毒力基因20，21的表达，。EF“> 22，23，24，25，26，27科迪被激活为DNA结合蛋白由两个类配体：支链氨基酸（支链氨基酸;异亮氨酸，亮氨酸，和缬氨酸[ILV]）和GTP当这些营养丰富，科迪压制（或在某些情况下，刺激）转录。由于这些营养物变得有限，科迪活性逐渐降低，导致分级转录应答重新路由通过连接到中心代谢的各种代谢途径的前体28，29，30。
串联耦合到质谱（LC-MS）液相色谱法是一种强大的技术，可以准确地识别和量化小分子的细胞内代谢物31。当与创见配对riptome分析（ 例如，RNA测序），该分析工作流可以提供深入了解发生在响应于环境或营养应激的生理变化。这里，我们提出用于通过LC-MS从金黄色葡萄球菌细胞，并随后分析代谢物的提取的方法。这种方法已被用来证明科迪对金黄色葡萄球菌生理的多效性影响。
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Protocol
1.缓冲溶液的制备
- 制备磷酸盐缓冲盐水;通过稀释10倍的PBS中的储备溶液，以1倍的用超纯水的最终浓度（PBS pH 7.4）中（蒸馏水和去离子）水。
- 通过组合2毫升乙腈，2毫升甲醇，1毫升超纯H 2 O和甲酸的19微升（0.1毫摩尔终浓度）制备骤冷溶液。
- 制备LC-MS通过添加甲酸（0.2％[v / v]的终浓度），以超纯水溶剂A。
- 通过添加甲酸（0.2％[v / v]的终浓度），以乙腈制备LC-MS溶剂B。
注：所有的溶液应使用最高纯度的试剂可用（通常高效液相色谱级）来制备。解决方案应准备每次实验前新鲜的和储存到使用前的冰。
2.稳态金黄色葡萄球菌生长的建立
- 条纹S.黄色葡萄球菌从冷冻甘油股票的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）隔离兴趣小号株。孵育在37℃下16-24小时。
- 接种4毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或与各菌株的单菌落无菌玻璃试管孵育另一种合适的介质中。孵育倾斜（〜70°角），在37℃下16-20小时在每分钟（rpm）的60转旋转。
注：过夜培养物使用标准方法时，包括在步骤2.2中所述，这会影响细胞生理学容易发生氧梯度。因此，我们采用了多背稀释战略，以确保生物稳态（见步骤2.4-3.2，下同）。 - 使用分光光度计从步骤2.2在600nm（OD 600）测量所述培养物的光密度。使用无菌介质作为光学参考（空白）。稀释这些细胞的0.05在50ml无菌TSB培养基的OD 600（预热至37℃）在单独的，250个毫升烧瓶德朗。
- INCU软化剂在37℃下与在280rpm下摇动的水浴中培养。
- 每隔30分钟，采取OD 600个测量结果;作为光密度的增加，可能变得需要稀释培养物与TSB，使它们保持分光光度计的线性吸光度范围内。
- 当来自步骤2.5培养物实现的〜0.8-1.0的OD 600时 ，传代培养这些入50mL 37℃的TSB到0.01-0.05的OD 600，并重复步骤2.4和2.5。
3.样品采集设置
- 制备碎干冰的床在合适的容器（ 例如，玻璃皿，冰桶，或冷却器）。
- 作为培养物的光密度接近期望收获点，添加猝灭溶液到35毫米的未经处理的培养皿中，并在干冰 - 凉爽预为≥5分钟1毫升。
注意：“期望的收获点”将取决于实验的目标有所不同。例如，如果一个人检查米etabolites有氧生长期间，这种状态的关键指标包括醋酸排泄和在指数生长后阶段32，33乙酸盐再同化。通常，这一点应该是一个特定的生长阶段（ 例如，指数期）内。与此级相关联的特定OD 600个值可能不同的细菌菌株和生长介质之间变化。 - 放置一个不锈钢过滤器料（预冷却至-20℃）中的橡胶塞，并把它连接到一个室内真空或真空泵的真空烧瓶的顶部。
- 施加真空并在顶部放置一个混合纤维素酯膜（0.22微米孔径）。
注意：关键是要使用的过滤器的直径等于玻璃料和适当居中此过滤器，以确保在样品通过过滤器，而不是在边缘绘制。用冰冷，无菌水润湿膜2 O可以帮助与定位膜。
4.样品收获
- 在OD 600〜0.4-0.5，使用一个血清移液管从烧瓶中除去13毫升培养物，并在样品应用到过滤器。
- 整个样品已经被过滤之后，立即清洗过滤用冰冷的PBS的≥5mL至洗去介质相关的代谢物。
- 断开真空，并使用一对无菌镊子从玻璃料除去过滤器。倒置滤波器（电池侧下）插入预冷的淬灭溶液中。
注意：要快速执行上述步骤是非常重要的（ 即，几秒钟内），并一旦液体已被移除，以确保细胞的快速淬火，阻止代谢活性。 - 孵育在干冰上急冷溶液中的滤波器为≥20分钟。
- 使用无菌镊子，反转在陪替氏培养皿的过滤器（细胞的一面朝上），并使用微量吸管冲洗细胞关闭t的他膜进入骤冷溶液。
- 重新悬浮在骤冷液中的细胞，然后将细胞悬浮液转移到含有100〜μL为0.1mm二氧化硅珠的无菌2mL的耐冲击管。存储此在干冰上或在-80℃下。
5.代谢物提取
- 在湿冰上解冻样品和破坏在均化器将细胞与4 30秒脉冲串以6000rpm，与周期之间干冰2 min的冷却周期。
- 澄清15分钟裂解物中以最大速度预冷，冷藏微量（ 即，在≤4℃下18213×g）离心。
- 将上清转移至干净的微离心管中。
- 使用微量，转移样品到用于在步骤6的残余肽含量定量微量离心管的一小部分;存储在-80℃下的余数。
注：保留样品的体积而变化，这取决于在步骤6.1中使用的BCA测定。这个样品应被存储在立即分析湿冰上或在-80℃冷冻。
6.二喹啉甲酸（BCA）测定法
- 所推荐的试剂盒制造商，使用来自步骤5.4的样品，以测定每一样品的残余肽浓度进行BCA测定。
7. LC-MS
- 混合用LC-MS溶剂B的75μL75 S的μL 黄色葡萄球菌提取物，在步骤1.4制备。
- 涡旋混合和旋以13,000×g离心5分钟。
- 放置100μL的上清液的成液相色谱（LC）小瓶中，并且盖住它。确保没有气泡被俘获于样品中。
- 装入小瓶LC到LC-MS自动进样器和软件中编辑的运行列表“脱机工作列表编辑器”。
- 填写“样品名称”（ 例如，野生型-1）， “样本位置”（ 例如，P1-A1）， “方法”（ 例如，甲酸甲CID-负的方法），和“数据文件”（ 例如，野生型-1）列。点击按钮“保存工作列表”按钮。打开“质谱数据采集工作站”软件，并输入以前保存的工作列表。点击“开始运行工作列表”按钮，开始连续LC-MS测定。
- 分离样品在列，列链接到飞行（TOF）光谱仪的时间，夫妇与LC系统的TOF质谱仪。如下使用移动相梯度：0-2分钟，85％溶剂B; 3-5分钟，80％溶剂B; 6-7分钟，75％溶剂B; 8-9分钟，70％溶剂B; 10-11.1分钟，50％溶剂B; 11.1-14分钟，20％溶剂B;和14.1-24分钟，5％溶剂B;与在85％溶剂B在10分钟再平衡阶段和0.4毫升分钟-1的流速结束。
- 使用等度泵，注入一个参考质量溶液与运行，以允许同时质量轴校准。
注：此步骤是基于标准TOF光谱仪手册。- 使用乙酸D4和六（1H，1H，3H四氟）膦嗪作为参考质量溶液进行实时校准的混合物。使用具有2.5毫升分钟的流速等度泵-1输注。
8.离子计数的批量修正
- 指定的任何样品，以作为批次校正的参考样品（ 例如，野生型，复制1）。
- 计算离子计数的总和的参考样品之内的所有代谢物。重复此计算所有样本。
- 由参考样品的总离子计数将每个样品的总离子计数以产生一个比率。
- 除以样本/参照比值的样品内，用于每种代谢物的离子计数以获得用于每种代谢物的分批校正离子计数。
9.肽规范化
- ðivide对于在步骤8中通过与步骤6中的BCA测定法测定，得到的归一化值，每种代谢物的肽浓度而获得的每个样品的批校正离子计数值。
注：在步骤9.1获得的每种代谢物的归一化，批次间歇校正离子计数可菌株之间直接进行比较，并进行统计分析（ 例如，曼- -惠特尼U -test）。可替换地，已知的代谢物以不改变或者通过治疗或遗传背景可以被用作一个归一化器，以检测由于代谢物分解的变化。在提取缓冲液L-正缬氨酸或gluraric酸的已知量的内含物可用于样品处理34期间校正损失。
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Representative Results
在一个丰富的，复杂的媒体在体外生长过程中我们分析了金黄色葡萄球菌胞内代谢库。作为原则证明，我们比较了甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌骨髓炎之间代谢特征隔离UAMS-1（野生型WT]）和缺少全局转录调节科迪（Δ 科迪 ）26的等基因菌株。稳态中，WT和Cody菌株的指数培养物建立于TSB培养基，如在该协议的步骤2中描述。野生型和Cody -null突变体培养物的生长行为是相似的，与仅在生长产量和速率（ 图1）轻微的差异。使用RNA-Seq的和微阵列技术，我们和其他人发现，多个基因编码参与从天门冬氨酸衍生的氨基酸生物合成酶在科迪 -null突变ç去压抑在TSB中的体外生长（ 图2）25，27，30中ompared到WT细胞。此外，brnQ1和brnQ2，对于支链氨基酸透性酶，其代码，过表达在codY-无效突变体30，35。
以确定与该途径在无效突变体被改变相关联的代谢物的稳态细胞内丰度，我们进行了基于LC-MS-代谢物图谱的程度。 WT和codY-无效突变体细胞生长至生物稳态和在协议中的步骤4中描述进行取样。我们确定代谢物的丰度通过积分峰面积离子强度对使用分析软件包中的每个色谱解决代谢物（参见材料列表）。我们更正了差异在生物质erences通过归一化的代谢物的丰度，以每个样品的残余肽浓度。通过计算各样品中所有代谢的平均离子计数，并通过使用与野生型样品作为基准值，我们进一步校正用于样品之间的潜在影响批次这些值。这种方法使整个环境的代谢物丰度的样本间的比较。给定样品内帧间代谢物比较可类似地通过首先从离子计数标准化转换代谢物的丰度磨牙使用标准加入法数量来实现。
我们比较了在UAMS-1及其codY-无效突变体的天冬氨酸途径关键中间体的水平。 如图3中看到的，该途径的终产物（ 例如，苏氨酸和（iso） -亮氨酸）在CODY -null突变的细胞更加丰富，而前体（ 例如，天冬氨酸和O-乙酰基高丝氨酸）在野生型细胞更丰富。 BrnQ的组合上调通透36和ILV生物合成途径可能导致异亮氨酸和亮氨酸30增加。尽管差异是相对小的（<4倍），LC-MS-基于定量和批次校正揭示健壮和统计学显著变化是与由科迪介导的转录的改变相一致。
图1： 金黄色葡萄球菌 UAMS-1的生长行为和在TSB同基因科迪 -null突变体。延长时间在稳态指数增长花费的细胞，培养物回稀释至0.05的光密度在新鲜培养基中预培养获得的OD 600〜1之后。共收集LC-MS代谢物分析样品从实验培养以〜0.5（箭头）的光密度。所示的数据代表三次生物学重复。
图2：示意从天门冬氨酸衍生所选代谢物。基因和操纵子，其产品催化天冬氨酸家族氨基酸以斜体表示的合成;在一个CODY -null突变体的增加转录物丰度与野生型相比，如通过RNA-SEQ分析29确定的，还应当注意。 DHP，2,6- diaminoheptanedioate（2,6-二氨基庚二酸）。
图3：在天冬氨酸家族的代谢产物的丰度被改变以CODY突变体。在所选代谢物的日志2倍变化codY-无效突变体相比UAMS-1（WT）被示出。的变化是由平均丰度的特·斯特兰三个生物学重复分割的codY-零应变的三次生物学重复的平均值丰度来确定。对于每种代谢物生物学重复之间的标准误差为<35％。虚线指示日志2 1.5倍的变化，在该实验中使用的截止。
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Discussion
所有小分子代谢物通过中央的代谢途径的共同起源地相互连接。在指数生长，细菌细胞在生物和代谢稳定状态下，在特定条件下提供所述生理状态的快照。 CODY通过响应ILV和GTP监视养分充分。由于ILV和GTP池下降，科迪活性很可能逐渐减少，调整它的靶基因的表达，以适应增加的养分耗竭30。甲科迪缺陷型菌株的行为就像ILV和GTP从环境耗尽但仅表现出相对生长行为的科迪-精通应变一个非常温和的差异（ 图1）。因此，代谢物的稳态池的在这些菌株的比较为我们提供了一个独特的机会以显示于其中，当养分匮乏代谢被重新配置的程度。应当指出的是，欧[R实验研究代谢物丰度时，科迪活性最大化（ILV和GTP是最丰富的指数期）。然而，其他问题可以在发展的其他阶段加以解决。例如，在指数生长期，三羧酸（TCA）循环的活性是非常低的;在指数后阶段，TCA循环被激活36。一些表型，包括代谢物的丰度，取决于该活化。此外，该AGR群体感应系统从指数生长至稳定期37的转换期间被激活。在指数后期或静止期采集的样本可能是研究解决这些主题的相关性。无论何时将样品收获，收集，洗涤和样品尽可能快地转移到提取缓冲液（ 即，S内），以尽量减少所发生的代谢物周转时稳定状态是扰动是很重要的。
这里所描述的色谱法是特别适合于分析极性和非极性氨基酸和中心碳代谢的化合物。然而，附加的特定类的方法可用于量化由该方法不色谱分辨感兴趣的特定化合物。例如，通过作为添加剂已经报道，使异亮氨酸和亮氨酸38的分辨率用乙酸代替甲酸改变色谱流动相的pH值。修改所述提取过程可以类似地使不稳定的代谢产物是在这里使用的提取方法敏感的回收和定量。例如，如半胱氨酸的化合物，它们很容易形成二硫键可以潜在地在用Ellman试剂39衍生回收。 用氮气气体喷射萃取缓冲液可以保存NAD +和NADH比率，从而允许细胞的氧化还原状态40的评估。核苷三磷酸可以基本或无缓冲解决方案，分解;酸化萃取溶液可提高这些分子41的恢复。
在成倍增长的细菌培养，一种或多种营养物质的消耗导致过渡到增长的指数后和固定相。这些生长阶段由不同的代谢状态42表征。基于恒化器培养物产生一个实际上连续的生物稳态理想基因表达和生理学研究。然而，该方法需要专门的设备，在技术上要求很高，并且需要一个营养限制被征收人在维持流动池的稳定的人口。后一要求导致转录和生理干扰由于比可变或再其他因素gulator被分析。为了确保我们的基础烧瓶结果代表在稳定状态，而不是两个阶段之间的过渡指数生长的细胞中，我们采用了一致的烧瓶双回稀释策略：体积比（以氧含量可导致细微变化改变的代谢36，42）。过夜培养物的初始稀释后，当它们到达的〜0.5的OD 600，这些细胞生长至OD 600〜1.0，后稀释至OD 600〜0.05，并收获。这样的方法也稀释过夜生长，包括稳定的RNA过程中积聚的胞质分子。事实上，RNAIII中，AGR群体感应系统的效应，是一种这样的RNA和调节的一些相同的基因靶作为CODY 25，43，44的表达。累计RNAIII可以掩盖CODY-DEPendent调节，导致由科迪（Sharma和布林斯梅德，未发表的结果）的压制或刺激的强度的低估。
这种分析的一个限制是，它提供了在细胞内代谢物的丰度的瞬时一瞥;没有结论可以从与经过任何给定的途径通量变化的结果得出。例如，检查并没有改变两个菌株之间的赖氨酸和蛋氨酸的丰度，尽管在codY-零应变生物合成酶的去阻遏（ 图2和3）。 科迪 -null应变实际上可能产生更多的赖氨酸和蛋氨酸，但是它们也可以迅速地转换成其它化合物;因此，这些分子不积累。使用13 C-或15 N-标记的碳或氮源将使我们能够通过主要的代谢结45 <遵循碳和氮骨架SUP>，46。
我们已经使用所描述的方法，以阐明在金黄色葡萄球菌中的代谢物集合的变化，枯草芽孢杆菌 29， 结核分枝杆菌 47，和屎肠球菌 48，但该方法可被应用到其它革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，包括其它人类病原体的实验室培养容易。事实上，整合代谢和转录信息可以揭示代谢和毒力之间的意外连接，这可能会导致新的策略来治疗感染。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院途径来独立奖（授予GM 099893）和教师的启动资金，SRB，以及一个研究项目资助（GM授予042219）的部分资助。该资助者在研究设计，数据收集和解释，或提交作品出版的决定没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| Sidearm Flask, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
| Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
| Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
| Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
| Impact-resistant tubes, 2 mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
| Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
| Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
| Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
| Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
| Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
| Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
| Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1x with ultra-pure water |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
| aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. | |||
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
- Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
- Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
- Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
- Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
- Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
- Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
- Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
- Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
- Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
- Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
- Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
- Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
- Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
- den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
- Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
- Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
- Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
- Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
- Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
- Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
- Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
- Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
- Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
- Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W.
- Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
- Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
- Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
- Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
- Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
- Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
- Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
- Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
- Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
- Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
- Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
- Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
- Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
- Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
- Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
- de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
- Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).
