Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

Abstract

במאמץ לסכל חיידקים פתוגנים, מארחים קרובים להגביל את הזמינות של חומרים מזינים באתר של זיהום. הגבלה זו יכולה לשנות את שכיחותם של מטבוליטים מפתח אשר גורם רגולטוריים להגיב, התאמת חילוף חומרים תאיים. בשנים האחרונות, מספר החלבונים ו- RNA צמח כמו רגולטורים חשובים של ביטוי גנים ארסיים. לדוגמה, החלבון Cody מגיב רמות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP ו נשמרת נרחב חיידקים G + C גראם חיובי נמוך. כרגולטור עולמי Staphylococcus aureus, Cody שולט הביטוי של עשרות ארסיות וגני מטבולית. אנו משערים כי S. aureus משתמשת cody, בין השאר, כדי לשנות מצב מטבולי שלה בניסיון להסתגל לתנאים מגבילים-מזין נתקלו פוטנציאלי בסביבה המארח. כתב יד זה מתאר שיטה לחילוץ וניתוח מטבוליטים מ S. aureus באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מפרט מוניתtrometry, פרוטוקול אשר פותח על מנת לבחון השערה זו. השיטה גם מדגישה מומלצת שיבטיחו הקפדת שחזור, כגון שמירה על מצב יציב ביולוגי אוורור קבוע ללא שימוש בתרבויות chemostat רציפות. ביחס aureus USA200 ס רגיש ל- methicillin לבודד UAMS-1 זן הורי, מוטצית Cody isogenic הציגה עליות משמעותיות חומצות אמינו הנגזרות aspartate (למשל, תראונין ואיזולויסין) וירידות קודמיהם (למשל, אספרטט ו- O -acetylhomoserine ). ממצאים אלה תואמים היטב עם נתוני תעתיק שהושגו עם ניתוח RNA-seq: גנים במסלולים אלה היו למעלה מוסדרים בין 10 ו 800 של פי מוטצית Cody null. צימוד ניתוחים הגלובליים של transcriptome ואת metabolome יכול לחשוף כמה חיידקים לשנות את חילוף החומרים שלהם כאשר הוא מתמודד עם לחץ סביבתי או תזונתי, המספק תובנה פוטנציאל לתוך להתעמלותשינויים iological הקשורים דלדול מזין חוו במהלך זיהום. תגליות אלה עשויות לסלול את הדרך לפיתוח תרופות נוגדת זיהום ואת הרומן.

Introduction

חיידקים פתוגנים חייבים להתמודד עם אתגרים רבים בתוך הסביבה המארחת. בנוסף התקפה ישירה על ידי תאי מערכת חיסון, המארח גם sequesters מזינים חיוניים להישרדות שכפול חיידקים, יצירת חסינויות תזונתיות 1, 2. כדי לשרוד בסביבה העוינת אלה, חיידקים פתוגנים לפרוס גורמים ארסיים. חלק מגורמים אלה מאפשרים החיידק להתחמק התגובה החיסונית; גורמים אחרים כוללים מופרש אנזימי עיכול, כגון hyaluronidase, thermonuclease, וטריפז, אשר עשוי לאפשר לחיידקים לחדש מזינים חסרים על ידי צריכת מרכיבים שמקורם ברקמה 3, 4, 5. ואכן, חיידקים התפתחו מערכות רגולטוריות שקושרים את המצב הפיזיולוגי של התא לייצור של גורמים בחיידק הגורם 6, 7, עד class = "Xref"> 8, 9, 10.

גוף גדל והולך של ראיות מצביע Cody כרגולטור קריטי המקשר חילוף חומרים ואת ארסיות. למרות גילו לראשונה subtilis Bacillus בתור מדכא של permease dipeptide (DPP) גן 11, קודי הוא ידוע כיום להיות מיוצר על ידי כמעט כל החיידקים G + C נמוך גראם חיובי 12, 13 ו מסדיר עשרות גנים המעורבים פחמן חנקן המטבוליזם 14, 15, 16, 17, 18, 19. במינים פתוגניים, Cody שולט גם הביטוי של כמה גנים הארסיים החשובים 20, 21,. EF "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 קודי מופעל בתור חלבון קושר DNA על ידי שתי כיתות של הליגנדים: חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAAs; ואיזולויסין, לאוצין, ו- וואלין [ILV]) ו GTP . כאשר מזין אלה נמצאים בשפע, Cody מדחיק (או במקרים מסוימים, מגרה) תעתיק. כמו חומרים מזינים אלו הופכים מוגבלים, פעילות Cody מצטמצמת בהדרגה, ומביא לתגובת תעתיק מדורגת כי חישוב מחדש של מסלולים מבשרים דרך מסלולי מטבוליים שונים הקשורים למטבוליזם מרכזי 28, 29, 30.
כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מצמידים ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הינה טכניקה שיכולה לזהות במדויק ולכמת מטבוליטים תאיים-מולקולה קטנה 31. כאשר יחד עם transcניתוח riptome (למשל, RNA-seq), עבודה אנליטית זה יכול לספק תובנות לגבי השינויים הפיסיולוגיים המתרחשים בתגובה לעקה סביבתית או תזונתית. כאן, אנו מציגים שיטה להפקת המטבוליט מתאי סטפילוקוקוס וניתוח שלאחר מכן באמצעות LC-MS. גישה זו נעשה שימוש כדי להדגים את ההשפעות pleiotropic של Cody על הפיזיולוגיה aureus S..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תמיסות בופר

  1. כן פוספט שנאגר מלוח (PBS; pH 7.4) על ידי דילול פתרון מניות של 10x PBS לריכוז סופי של 1X עם ultrapure (מזוקק ללא יונים) מים.
  2. הכן פתרון מרווה ידי שילוב 2 מ"ל של אצטוניטריל, 2 מ"ל של מתנול, 1 מ"ל של ultrapure H 2 O, ו 19 μL (0.1 ריכוז סופי מ"מ) של חומצה פורמית.
  3. כן LC-MS ממס A על ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי מי ultrapure.
  4. כן B ממס LC-MS-ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי acetonitrile.
    הערה: כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים באמצעות ריאגנטים הגבוהה ביותר טוהר זמין (כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים בדרך כלל כיתה). פתרונות יש להכין טרי לפני כל ניסוי ומאוחסן על קרח לפני השימוש.

2. הקמת צמיחת aureus היציבה S.

  1. Streak ס aureuזנים של בעלי עניין עבור בידוד על אגר סויה tryptic (TSA) ממלאי גליצרול קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות.
  2. לחסן 4 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) או אחר בינוני מתאים צינורות הדגירה זכוכית סטרילית עם מושבות אחת של כל זן. דגירה נוטה (~ 70 ° זווית) עם סיבוב ב 60 סיבובים לדקה (סל"ד) בשעה 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות.
    הערה: תרבויות לילה נוטים הדרגתיים חמצן בעת ​​שימוש בשיטות סטנדרטיות, כולל אלה המתוארים בשלב 2.2, אשר משפיעים הפיזיולוגיה הסלולר. לפיכך, אנו מעסיקים אסטרטגית גב דילול מרובה כדי להבטיח מצב יציב ביולוגי (ראה צעדים 2.4-3.2, להלן).
  3. השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית של תרבויות משלב 2.2 ב 600 ננומטר (OD 600). השתמש בינוני סטרילי כהפניה אופטית (ריק). לדלל תאים אלה כדי OD 600 של 0.05 ב 50 מ"ל של מדיום TSB סטרילי (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ב נפרדת, 250 בקבוקונים מ"ל DeLong.
  4. Incuבייט התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם רועד ב 280 סל"ד.
  5. כל 30 דק ', לקחת OD 600 מדידות; כמו הצפיפות האופטית להגדיל, זה עשוי להיות נחוץ כדי לדלל את התרבויות עם TSB, כך שהם יישארו בטווח הספיג ליניארי של ספקטרופוטומטר.
  6. כאשר תרבויות משלב 2.5 להשיג OD 600 של ~ 0.8-1.0, תת אותם לתוך 50 מ"ל של 37 ° C TSB ל OD 600 של 0.01-0.05 וחזור על שלבים 2.4 ו 2.5.

3. הגדרת אוסף דוגמאות

  1. כן מצע הקרח יבש כתוש בתוך כלי מתאים (למשל, צלחת זכוכית, דלי קרח, או מצנן).
  2. כמו הצפיפות האופטית של התרבויות מתקרבת לנקודת הקציר הרצויה, להוסיף 1 מיליליטר של מרווית פתרון בצלחת 35 מ"מ מטופל פטרי טרום מגניב על קרח יבש ≥5 דקות.
    הערה: "נקודת הקציר הרצויה" תשתנה בהתאם מטרות ניסוי. לדוגמא, אם אחד היה לבחון מטרetabolites במהלך צמיחה אירובית, אינדיקטורים מרכזיים של המדינה הזאת כוללים הפרשה תצטט מחדש התבוללות של אצטט במהלך שלב הצמיחה שלאחר מעריכי 32, 33. באופן כללי, בשלב זה צריך להיות בתוך במת צמיחה ספציפית (למשל, שלב מעריכים). הערכים הספציפיים OD 600 הקשורים בשלב זה עשויים להשתנות בין זני חיידקים שונים בתקשורת צמיחה.
  3. מניחים frit מסנן נירוסטה (טרום צונן כדי -20 ° C) בתוך פקק גומי ולמקם אותו על גבי תֶרמוֹס מחובר משאבת ואקום או ואקום הבית.
  4. החל את הוואקום ולמקם קרום אסתר תאית מעורב (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) על גבי.
    הערה: חשוב מאוד להשתמש במסנן בקוטר שווה לזה של frit ולמרכז זה מסנן כראוי כדי להבטיח כי המדגם הוא נמשך דרך המסנן ולא מעבר לקצה. הרטבת הממברנה עם קר כקרח, סטרילי H 2 O עשויה לעזורעם מיצוב הממברנה.

4. לדוגמא קציר

  1. בשעה OD של 600 ~ 0.4-0.5, להשתמש פיפטה סרולוגיות להסיר 13 מ"ל של תרבות מהצפחת כדי להחיל את המדגם כדי המסנן.
  2. לאחר המדגם כולו סוננה, מיד לשטוף את המסנן עם ≥5 מ"ל של PBS קר כקרח לשטוף מטבוליטים הקשורים בינוני.
  3. נתק את הוואקום ולהשתמש פינצטה סטרילית כדי להסיר את המסנן מן frit. הפוך את המסנן (תא בצד למטה) לתוך התמיסה להרוות טרום צוננת.
    הערה: חשוב לבצע את הפעולות הנ"ל במהירות (כלומר, בתוך שניות) וברגע הנוזל הוסר כדי להבטיח את המרווה המהירה של התאים, עצר פעילות מטבולית.
  4. דגירה המסננת בתמיסה להרוות על קרח יבש ≥20 דקות.
  5. בעזרת פינצטה סטרילי, להפוך את המסנן (עד התא בצד) בצלחת פטרי ולהשתמש micropipette כדי לשטוף את התאים מעל tהוא הממברנה לתוך הפתרון להרוות.
  6. Re-השעה את התאים בתמיסה להרוות ולאחר מכן להעביר את השעית תא צינור מיליליטר 2 סטרילי השפעה עמיד המכיל ~ 100 μL של חרוזי סיליקה 0.1 מ"מ. בחנות זו על קרח יבש או -80 מעלות צלזיוס.

5. הפקת המטבוליט

  1. דגימות להפשיר על קרח רטוב לשבש את תאי homogenizer עם ארבע התפרצויות 30 שניות על 6000 סל"ד, עם 2 תקופות צינון דקות על קרח יבש בין מחזורים.
  2. להבהיר את lysates עבור 15 דקות ב microcentrifuge טרום צונן, בקירור במהירות המרבית (כלומר, 18,213 XG ב C ° ≤4).
  3. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge נקי.
  4. שימוש micropipette, להעביר חלק קטן מהמדגם צינור microcentrifuge עבור כימות של התוכן פפטיד שיורית צעד 6; לאחסן את השארית ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: היקף מדגם שמורות משתנה, תלוי assay BCA בשימוש בשלב 6.1. זֶההמדגם צריך להיות מאוחסן על קרח רטוב לניתוח מיידי או קפוא ב -80 מעלות צלזיוס.

Assay 6. Bicinchoninic חומצה (BCA)

  1. בצע assay BCA כפי מומלץ על ידי יצרן הערכה, באמצעות דגימות משלב 5.4 כדי לקבוע את ריכוז הפפטיד שיורי עבור כל דגימה.

7. LC-MS

  1. מערבבים 75 μL של ס תמצית aureus עם 75 μL של LC-MS הממס B, מוכן בשלב 1.4.
  2. וורטקס לערבב ספין על 13,000 XG במשך 5 דקות.
  3. מניחים 100 μL של supernatant לתוך כרומטוגרפיה נוזלית (LC) הבקבוקון מכסה אותו. ודא כי אין בועות אוויר לכודות במדגם.
  4. טען את מבחנות LC על autosampler LC-MS ולערוך את רשימת ריצה בתוכנה "עורך Worklist מנותק."
    1. מלא את "שם לדוגמא" (למשל, wild-type-1), "עמדה לדוגמא" (למשל, P1-A1), "שיטה" (למשל, נמליםCID-שלילי שיטה), ו "קובץ נתונים" (למשל, עמודות מסוג פרא-1). לחץ על כפתור "שמור Worklist" כפתור. פתח את תוכנת "Workstation קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה" והזן את worklist שנשמר בעבר. לחץ על כפתור "Run Worklist התחל" כדי להתחיל את המדידה LC-MS רציפה.
  5. הפרד את הדגימות על עמודה, לקשר את עמודת זמן הטיסה (TOF) ספקטרומטר, ומשלב ספקטרומטר TOF עם מערכת LC. השתמש שיפוע נייד פאזי כדלקמן: 0-2 דק ', 85% B ממס; 3-5 דק ', 80% B ממס; 6-7 דק ', 75% B ממס; 8-9 דק ', 70% B ממס; 10-11.1 דקות, 50% B ממס; 11.1-14 דקות, 20% B ממס; ו 14.1-24 דקות, 5% B ממס; להסתיים תקופת 10 דקות מחדש איזון ב B 85% ממס בשיעור זרימת -1 0.4 מ"ל min.
  6. באמצעות משאבת isocratic, להשרות פתרון המוני הפניה עם הריצה כדי לאפשר כיול ציר סימולטני המוני.
    הערה: זה צעדמבוסס על במדריך TOF ספקטרומטר סטנדרטי.
    1. השתמש בתערובת של חומצה אצטית D4 ו- hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine כפתרון המונית הפניה לביצוע כיול בזמן אמת. השתמש במשאבה isocratic עם קצב הזרימה של דק 2.5 מ"ל -1 עבור עירוי.

8. תיקון אצווה של רוזני יון

  1. ציין בכל אחת מהדוגמאות כדי לשמש דוגמה התייחסות תיקון אצווה (למשל, wild-type, לשכפל 1).
  2. חשב את הסכום של ספירת יון לכל מטבוליטים בתוך מדגם התייחסות. חזור על חישוב זה עבור כל הדגימות.
  3. מחלק את ספירת היון הכוללת של כל דגימה על ידי ספירת היון הכוללת של מדגם ההתייחסות ליצור יחס.
  4. מחלק את ספירת היון לכל המטבוליט בתוך מדגם ידי היחס המדגם / ההפניה להשיג ספירת יון תצווה-מתוקן לכל המטבוליט.

9. פפטיד נורמליזציה

  1. Divide ערכי ספירת יון אצווה תיקן עבור כל דגימה שהושגו בשלב 8 על ידי ריכוז הפפטיד נקבע עם assay BCA בשלב 6 להניב ערך מנורמל עבור כל המטבוליט.
    הערה: ספירת יון תיקן המנורמלת, יצווה-תצווה עבור כל המטבוליט שהושג בשלב 9.1 ניתן להשוות באופן ישיר בין זנים ו נתון ניתוח סטטיסטי (למשל, מאן-ויטני U -test). לחלופין, מטבוליט הידוע להיות ללא שינוי או על ידי הטיפול או רקע גנטי עשויים לשמש מנרמל כדי לזהות שינויים עקב המטבוליט פירוק. הכללת כמות ידועה של L-norvaline או חומצה gluraric במאגר החילוץ יכול לשמש כדי לתקן הפסד במהלך מדגם עיבוד 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתחנו בריכות המטבוליט תאיים ב S. aureus במהלך הצמיחה במבחנה במדיום עשיר, מורכב. כהוכחה עקרוני, השווינו פרופילים המטבוליט בין אוסטאומיאליטיס aureus methicillin-רגישים ס לבודד UAMS-1 (wild-type [WT]) וכן זן isogenic חסר הרגולטור תעתיק העולמי Cody (Δ Cody) 26. מצב יציב, תרבויות מעריכים של זני WT והקודים הוקמו במדיום TSB, כמתואר בשלב 2 של הפרוטוקול. התנהגות הצמיחה של wild-type ותרבויות מוטצית -null Cody הייתה דומה, עם הבדלים קלים בלבד בתשואת צמיחה וקצב (איור 1). באמצעות RNA-seq וטכנולוגית microarray, אנו ואחרים חשפו כי מספר רב של גנים המקודדים אנזימים מעורבים ביוסינתזה של חומצות אמינו הנגזרות aspartate היו דה-המודחק ג מוטצית -null Codyompared לתאי WT במהלך הצמיחה במבחנה ב TSB (איור 2) 25, 27, 30. יתר על כן, brnQ1 ו brnQ2, אשר קוד עבור permeases חומצות אמינו מסועפות שרשרת, הם ביטוי יתר של מוטציה codY- null 30, 35.

כדי לקבוע את המידה שבה יציבה שכיחותם התאית של מטבוליטים הקשורים מסלול זה הם שינה מוטצית null, בצעו פרופיל המטבוליט LC-מבוסס MS. תאי מוטנטים null WT ו codY- גדלו ל מצב יציב ביולוגי נדגמו כמתואר בשלב 4 של הפרוטוקול. קבענו שכיחותם המטבוליט ידי שילוב באזור שיא יון בעצמה לכל המטבוליט נפתר chromatographically משתמש בחבילת תוכנה אנליטית (ראה רשימת חומרים). ביצענו תיקון עבור differences ב ביומסה ידי נרמול שכיחותם המטבוליט לריכוז פפטיד שיורית של כל דגימה. אנחנו עוד תיקן ערכים אלה תופעות יצוו פוטנציאל בין דגימות ידי חישוב ספירת היון הממוצע עבור כל מטבוליטים בתוך כל דגימה באמצעות מדגם מהסוג פרא כערך ההפניה. גישה זו אפשרה השוואות-מדגם שאר של שכיחותם המטבוליט פני תנאים. השוואות בין-המטבוליט בתוך מדגם נתון יכולות להיות מושגת באופן דומה על ידי המרת שכיחותם המטבוליט מנורמלת ראשון מספירות יון כדי טוחן כמויות בשיטה בנוסף סטנדרטיים.

השווינו את רמות ביניים מפתח בנתיב aspartate ב UAMS-1 ו מוטצית null codY- שלה. כפי שניתן לראות באיור 3, מוצרי קצה של מסלול זה (למשל, תראונין ו (ISO) -leucine) נפוצים יותר תאים מוטנטים -null cody, ואילו סימנים מקדימים (למשל,aspartate ו o -acetyl homoserine) הם יותר בשפע בתאי WT. הגברת הביטוי בשילוב של BrnQ permeases 36 ואת מסלול biosynthetic ILV מוביל סביר עליות ואיזולויסין ו לאוצין 30. למרות ההבדלים הם קטנים יחסית (<4-פי), LC-MS מבוסס לכמת יצוו תיקון לחשוף שינויים חזקים ומובהקים שעולים בקנה אחד עם שינויי תעתיק בתיווך Cody.

איור 1
איור 1: התנהגות צמיחה של S. aureus UAMS-1 ו מוטציה isogenic Cody -null ב TSB. כדי להאריך את זמן התאים בילו גידול מעריכים יציב, תרבויות היו גב מדולל צפיפות אופטית של 0.05 במדיום טרי אחרי תרבויות קדם השיגו OD 600 של ~ 1. דגימות לבדיקה המטבוליט LC-MS נאספומתרבויות ניסיוני צפיפות אופטית של ~ 0.5 (חיצים). הנתונים המוצגים הם נציג של שלושה משכפל ביולוגי.

איור 2
איור 2: סכמטי של מטבוליטים שנבחרו נגזר aspartate. גנים operons שמוצריה לזרז את הסינתזה של חומצות אמינו aspartate-המשפחה מסומנים באותיות נטויות; הגידול שפע תמליל ב מוטציה Cody -null לעומת סוג בר, כפי שנקבע על ידי ניתוח RNA-seq 29, הוא גם ציין. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelate).

איור 3
איור 3: שכיחותם של מטבוליטים במשפחה aspartate משתנים ב מוטציה Cody. יומן 2 שינויים -fold של מטבוליטים שנבחרוcodY- מוטצית null לעומת UAMS-1 (WT) מוצגת. השינוי נקבע על ידי חלוקת השפע הממוצע של שלוש משכפל ביולוגי של זן null codY- ידי שפע הממוצע של שלוש משכפל ביולוגי של זן WT. סטיית התקן בין ביולוגי משכפל עבור כל המטבוליט היה <35%. הקווים המקווקווים מציינים יומן 2 שינוי 1.5-פי, ההפסקה השתמשה בניסוי הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כל מטבוליטים המולקולות קטנות מחוברים זו לזו באמצעות מקורותיה המשותפים שלהם מסלולי מטבוליים מרכזיים. במהלך גידול מעריכי, תאי חיידקיים הם על מצב יציב ביולוגי מטבוליות, מתן תמונת מצב של המצב הפיזיולוגי בתנאים ספציפיים. Cody מפקחת הסתפקות מזין ידי היענות ILV ו GTP. כפי ILV ושחרר ברכות GTP, פעילות Cody מצטמצמת סיכוי בהדרגה, התאמת ביטוי גני היעד שלה להסתגל הגדלת מזין דלדול 30. זן Cody לקוי מתנהג כאילו ILV ו GTP מתרוקנים מהסביבה אלא רק מציג הבדל מאוד מתון יחסית התנהגות צמיחה לזן Cody-הבקיא (איור 1). לפיכך, ההשוואה של ברכות יציבות של מטבוליטים זנים אלה מספקת לנו הזדמנות ייחודית לחשוף את המידה שבה חילוף חומרים הוא מחדש כאשר מזינים הם נדירים. יצוין כי our ניסויים לחקור שכיחותם המטבוליט כאשר פעילות Cody מוגדלת (ILV ו GTP הנפוץ ביותר בשלב מעריכים). עם זאת, שאלות אחרות ניתן לפנות בשלבים אחרים של צמיחה. לדוגמא, בשלב מעריכים, חומצת tricarboxylic פעילות מחזור (TCA) היא נמוכה מאוד; בשלב פוסט-מעריכים, מחזור TCA מופעל 36. מספר פנוטיפים, כולל שכיחותם המטבוליט, הם תלויים הפעלה זו. בנוסף, מערכת חישת סף AGR הופכת לפעילה בתקופת המעבר בין גידול מעריכי לשלב נייח 37. איסוף דגימות בשלב פוסט-מעריכים או נייח עשויה להיות רלוונטי יותר עבור מחקרים הפונים לנושאים אלה. לא משנה מתי דגימות נקצרים, חשוב לאסוף, לשטוף, ולהעביר דגימות למאגר החילוץ במהירות האפשרית (כלומר, בתוך ים) כדי למזער את מחזור המטבוליט המתרחשת כאשר מצב יציב הוא מוטרד.

שיטת כרומטוגפיות המתואר כאן מתאימה במיוחד לניתוח חומצות אמינו קוטב הלא קוטביות ותרכובות פחמן במטבוליזם מרכזיות. עם זאת, שיטות בכיתה ספציפית נוספים שניתן להשתמש בהם כדי לכמת תרכובות ספציפיות של עניין לא נפתרה chromatographically בשיטה זו. לדוגמה, שינוי ה- pH של השלב הנייד כרומטוגפיות ידי החלפת חומצה פורמית עם חומצה אצטית כתוסף דווחה על מנת לאפשר את הרזולוציה של ואיזולויסין ו לאוצין 38. שינוי נוהל מיצוי יכול לאפשר התאוששות וכימות של מטבוליטים רָפִיף דומה כי הם רגישים שיטת החילוץ משמש כאן. לדוגמא, תרכובות כגון ציסטאין שמועדים היווצרות קשר דיסולפיד ניתן לשחזר הבאות העשויים derivatization עם ריאגנט של אלמן 39. מאגרי חילוץ Sparging עם גז חנקן יכולים לשמר NAD + ו- NADHיחסים, המאפשר הערכה של מדינת חמזור הסלולר 40. triphosphates nucleoside יכול לפרק בפתרונות בסיסיים או unbuffered; acidifying פתרון החילוץ יכול לשפר את ההתאוששות של מולקולות אלה 41.

בשנת תרבות חיידקים גדלה באופן אקספוננציאלי, הדלדול של חומרים מזינים אחד או יותר מוביל את המעבר בשלבים לאחר מעריכים ונייחים של צמיחה. שלבי גדילה אלה מאופיינים מדינות מטבוליות ברורות 42. תרבויות מבוססות Chemostat ליצור אידיאל מצב יציב מתמשך ביולוגי כמעט לביטוי גנים ומחקרים פיזיולוגיים. עם זאת, השיטה דורשת ציוד מיוחד, הוא תובעני מבחינה טכנית, ומחייבת כי מגבלה מזינה תוטל לשמור על אוכלוסייה יציבה של תאים תחת זרם. הדרישה האחרונה גורמת הפרעות תעתיק ופיסיולוגיות בשל גורמים אחרים מלבד המשתנה או מחדשgulator להיות מנותחת. כדי להבטיח כי תוצאות הבקבוק מבוסס שלנו מייצגות תאים גדלו באופן אקספוננציאלי על מצב יציב ולא של מעבר בין שני שלבים, אנו מעסיקים אסטרטגית דילול פעמים בחזרה עם בקבוק עקבי: יחס נפח (שינויים קלים ברמות חמצן יכול להוביל המטבוליזם שינה 36, 42). לאחר דילול ראשוני של תרבויות לילה, תאים אלה גדלים ל OD 600 של ~ 1.0, גב מדולל ל OD 600 של ~ 0.05, וקצרו כשהם מגיעים OD 600 של ~ 0.5. גם שיטה כזו מדללת מולקולות ציטופלסמית שמצטברות במהלך צמיחת הלילה, כולל RNAs יציב. ואכן, RNAIII, את המפעיל של מערכת חישת סף AGR, הוא RNA אחד כזה ומסדיר את הביטוי של חלק מאותם יעדי הגן כפי Cody 25, 43, 44. RNAIII מצטבר יכול להסוות Cody-DEPתקנת endent, שמוביל אומדן חסר של עוצמת דיכוי או גירוי על ידי Cody (שתרמה ו Brinsmade, תוצאות לא פורסמו).

מגבלה אחת של ניתוח זה היא בכך שהוא מספק הצצה מיידית של שכיחותם המטבוליט בתוך התא; לא ניתן להסיק מהתוצאות לגבי שינויי שטף דרך כל מסלול נתון. לדוגמא, שכיחותם של ליזין ומתיונין בין שני הזנים שנבדקו לא השתנה, למרות דיכוי-דה של אנזימי biosynthetic בזן עכברי null codY- (איורים 2 ו 3). מתח Cody -null עשוי למעשה להיות יצירה יותר ליזין ומתיונין, אבל הם יכולים להיות מומרים במהירות לתוך תרכובות אחרות; וכך, מולקולות אלה אינן מצטברות. באמצעות 13 C- או 15 מקורות פחמן או חנקן N-שכותרתו ייאפשרו לנו לעקוב שלדי פחמן וחנקן דרך צומת מטבוליות גדולים 45 <sup>, 46.

השתמשנו בשיטה המתוארת כדי להבהיר שינויים בריכות המטבוליט ב S. aureus, subtilis 29 ב, שחפת Mycobacterium 47, ו אנטרוקוקוס פאציום 48, אבל השיטה ניתן להחיל חיידקים אחרים גראם חיובי גראם שליליים, כולל אחרים פתוגנים אנושיים טיפחו בקלות במעבדה. ואכן, שילוב מידע metabolomic ו transcriptomic יכול לחשוף קשרים בלתי צפויים בין מטבוליזם ארסי, אשר עלול להוביל אסטרטגיות רומן לטיפול בזיהומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מסלול NIH כדי פרס העצמאות (להעניק GM 099,893) וקרנות ההפעלה הסגל כדי SRB, כמו גם גרנט פרויקט מחקר (להעניק GM 042,219). הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים לפרשנות, או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 121 מיקרוביולוגיה פיזיולוגית חיידקים metabolomics, קודים חומצות אמינו מטבוליטים ארסיות בפתוגנזה חילוף חומרים ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית
גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter