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Biochemistry

की Metabolite विश्लेषण के लिए एक अग्रानुक्रम तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

यहाँ हम तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से स्ताफ्य्लोकोच्चुस और उनके बाद विश्लेषण से चयापचयों की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

बैक्टीरियल रोगज़नक़ों विफल करने के प्रयास में, होस्ट अक्सर संक्रमण के स्थल पर पोषक तत्वों की उपलब्धता की सीमा। यह सीमा कुंजी चयापचयों जो करने के लिए नियामक कारकों का जवाब, सेलुलर चयापचय को एडजस्ट करने की प्रचुरता बदल सकते हैं। हाल के वर्षों में, प्रोटीन और शाही सेना के एक नंबर डाह जीन अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण नियामक के रूप में उभरा है। उदाहरण के लिए, कोड़ी प्रोटीन branched श्रृंखला एमिनो एसिड और जीटीपी के स्तर का जवाब और व्यापक रूप से कम जी + सी ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में संरक्षित है। स्ताफ्य्लोकोच्चुस में एक वैश्विक नियामक के रूप में, कोड़ी डाह और चयापचय जीन के दर्जनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। हम परिकल्पना एस ऑरियस कोड़ी, भाग में, पोषक तत्वों से सीमित की स्थिति संभावित मेजबान वातावरण में सामना करना पड़ा के लिए अनुकूल करने के प्रयास में अपने चयापचय राज्य में परिवर्तन करने का उपयोग करता है। यह पांडुलिपि एस ऑरियस से निकालने और विश्लेषण चयापचयों बड़े पैमाने पर कल्पना के साथ मिलकर तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर के लिए एक विधि का वर्णन करता हैtrometry, एक प्रोटोकॉल है जो इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए विकसित किया गया था। विधि को भी सर्वोत्तम प्रथाओं, इस तरह के निरंतर chemostat संस्कृतियों के उपयोग के बिना जैविक स्थिर राज्य और निरंतर वातन को बनाए रखने के रूप में है कि कठोरता और reproducibility सुनिश्चित होगा पर प्रकाश डाला गया। USA200 मेथिसिल्लिन अतिसंवेदनशील एस ऑरियस के सापेक्ष अलग UAMS -1 माता पिता का तनाव, isogenic कोड़ी उत्परिवर्ती aspartate (जैसे, threonine और isoleucine) से व्युत्पन्न एमिनो एसिड में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया और उनके पूर्ववर्ती में कम हो जाती है (जैसे, aspartate और हे -acetylhomoserine )। इन निष्कर्षों को शाही सेना seq विश्लेषण के साथ प्राप्त ट्रांस्क्रिप्शनल डेटा साथ मेल: कोड़ी अशक्त उत्परिवर्ती में 10 और 800 गुना के बीच विनियमित इन रास्ते में जीन थे। transcriptome और metabolome के वैश्विक विश्लेषण युग्मन प्रकट कर सकते हैं कि कैसे बैक्टीरिया अपने चयापचय में परिवर्तन जब पर्यावरण या पोषण तनाव के साथ सामना करना पड़ा, Phys में संभावित अंतर्दृष्टि प्रदानपोषक तत्व रिक्तीकरण के साथ जुड़े iological परिवर्तन संक्रमण के दौरान का अनुभव किया। इस तरह की खोजों उपन्यास विरोधी infectives और चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं।

Introduction

बैक्टीरियल रोगज़नक़ों मेजबान वातावरण में कई चुनौतियों का सामना करना होगा। प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा प्रत्यक्ष हमले के अलावा, मेजबान भी बैक्टीरियल अस्तित्व और प्रतिकृति, पैदा पोषण उन्मुक्ति 1, 2 के लिए आवश्यक पोषक तत्वों sequesters। इन प्रतिकूल वातावरण में जीवित रहने के लिए, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों डाह कारकों को तैनात। इन कारकों में से कुछ बैक्टीरिया प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने के लिए अनुमति देते हैं; अन्य कारकों जैसे कि hyaluronidase, thermonuclease, और lipase के रूप में पाचन एंजाइमों, है, जो उपभोक्ता ऊतक व्युत्पन्न घटक 3, 4, 5 से लापता पोषक तत्वों की भरपाई बैक्टीरिया सक्रिय कर सकते हैं स्रावित शामिल हैं। दरअसल, बैक्टीरिया नियामक प्रणाली है कि डाह 6 कारकों, 7 के उत्पादन के लिए सेल की शारीरिक स्थिति टाई विकसित किया है, ऊपर वर्ग = "xref"> 8, 9, 10।

सबूत की बढ़ती शरीर के चयापचय और डाह जोड़ने एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में कोड़ी के लिए अंक। पहले dipeptide permease (डीपीपी) जीन 11 की एक repressor के रूप में बेसिलस subtilis में की खोज की है, कोड़ी अब लगभग सभी कम जी + सी ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया 12, 13 द्वारा उत्पादित होने जाना जाता है और नियंत्रित करता है कार्बन में शामिल जीनों के दर्जनों और नाइट्रोजन चयापचय 14, 15, 16, 17, 18, 19। रोगजनक प्रजातियों में, कोड़ी भी सबसे महत्वपूर्ण विषैलापन जीन 20, 21 में से कुछ की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है,। एफई "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 कोड़ी लाइगैंडों के दो वर्गों द्वारा एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में सक्रिय है: branched श्रृंखला एमिनो एसिड (BCAAs; isoleucine, leucine, और वेलिन [ILV]) और जीटीपी । जब इन पोषक तत्वों प्रचुर मात्रा में हैं, कोड़ी represses (या कुछ मामलों में, को उत्तेजित करता है) प्रतिलेखन। के रूप में इन पोषक तत्वों सीमित हो जाते हैं, कोड़ी गतिविधि उत्तरोत्तर कम हो जाता है, एक का दर्जा दिया गया ट्रांस्क्रिप्शनल प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप है कि फिर से मार्गों विभिन्न चयापचय केंद्रीय चयापचय से जुड़े रास्ते के माध्यम से व्यापारियों 28, 29, 30।
अग्रानुक्रम तरल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-एमएस) के लिए युग्मित क्रोमैटोग्राफी एक शक्तिशाली तकनीक है कि सही ढंग से पहचान करने और छोटे अणु intracellular चयापचयों 31 यों कर सकते हैं। जब transc के साथ रखाriptome विश्लेषण (जैसे, आरएनए Seq), इस विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह अंतर्दृष्टि शारीरिक परिवर्तन है कि पर्यावरण या पोषण तनाव के कारण पैदा होने में प्रदान कर सकते हैं। यहाँ, हम LC-एमएस के माध्यम से स्ताफ्य्लोकोच्चुस कोशिकाओं और बाद में विश्लेषण से मेटाबोलाइट निकासी के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण पर एस ऑरियस शरीर क्रिया विज्ञान कोड़ी की pleiotropic प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

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Protocol

1. बफर समाधान की तैयारी

  1. (आसुत और विआयनीकृत) पानी ultrapure साथ 1x की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10x पीबीएस के एक शेयर समाधान कमजोर द्वारा, (पीएच 7.4 पीबीएस) फॉस्फेट बफर खारा तैयार करें।
  2. Acetonitrile के 2 एमएल, मेथनॉल के 2 एमएल, ultrapure एच 2 ओ के 1 एमएल, और फार्मिक एसिड के 19 μL (0.1 मिमी अंतिम एकाग्रता) के संयोजन के द्वारा शमन समाधान तैयार करें।
  3. LC-एमएस ultrapure पानी के लिए फार्मिक एसिड (0.2% [v / v] अंतिम एकाग्रता) जोड़कर एक विलायक तैयार करें।
  4. acetonitrile को फार्मिक एसिड (0.2% [v / v] अंतिम एकाग्रता) जोड़कर LC-एमएस विलायक बी तैयार करें।
    नोट: सभी समाधान उच्चतम शुद्धता अभिकर्मकों उपलब्ध (आम तौर पर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी ग्रेड) का उपयोग कर तैयार रहना चाहिए। समाधान प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया और बर्फ का उपयोग करने से पहले पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

2. स्थिर राज्य एस ऑरियस विकास की स्थापना

  1. स्ट्रीक एस aureuएक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से tryptic सोया अगर (TSA) पर अलगाव के लिए ब्याज की रों उपभेदों। 16-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) या प्रत्येक तनाव के एकल कालोनियों के साथ बाँझ कांच ऊष्मायन ट्यूबों में एक और उपयुक्त माध्यम की 4 एमएल टीका। इच्छुक सेते (~ 70 डिग्री कोण) 16-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिनट (आरपीएम) प्रति 60 चक्र में रोटेशन के साथ।
    नोट: रातों रात संस्कृतियों ऑक्सीजन ढ़ाल होने का खतरा जब मानक तरीकों का उपयोग कर, जो सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कदम 2.2 में वर्णित, भी शामिल है। इस प्रकार, हम एक बहु बैक कमजोर पड़ने रणनीति जैविक स्थिर अवस्था सुनिश्चित करने के लिए (देखें चरणों 2.4-3.2, नीचे) को रोजगार।
  3. 600 एनएम (ओवर ड्राफ्ट 600) पर कदम 2.2 से संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें। एक ऑप्टिकल संदर्भ (खाली) के रूप में बाँझ मध्यम का प्रयोग करें। अलग में, 250 एमएल डीलॉन्ग बोतल (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम) बाँझ टीएसबी माध्यम की 0.05 50 में एमएल के एक आयुध डिपो 600 करने के लिए इन कोशिकाओं पतला।
  4. Incuबाते 280 rpm पर मिलाते हुए के साथ एक जल स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों।
  5. हर 30 मिनट, 600 माप आयुध डिपो ले; के रूप में ऑप्टिकल घनत्व बढ़ाने के लिए, यह TSB के साथ संस्कृतियों को कमजोर करने, ताकि वे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक अवशोषण सीमा के भीतर रहने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  6. जब कदम 2.5 से संस्कृतियों ~ 0.8-1.0 के एक आयुध डिपो 600 प्राप्त, 0.01-0.05 के एक आयुध डिपो 600 के 37 डिग्री सेल्सियस टीएसबी 50 एमएल में उन्हें उपसंस्कृति और दोहराने 2.4 और 2.5 कदम दूर है।

3. नमूना संग्रह सेटअप

  1. एक उपयुक्त पोत में कुचल सूखी बर्फ के एक बिस्तर तैयार करें (जैसे, ग्लास डिश, बर्फ बाल्टी, या कूलर)।
  2. संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व वांछित फसल बिंदु दृष्टिकोण के रूप में, ≥5 मिनट के लिए एक 35 मिमी अनुपचारित पेट्री डिश और सूखी बर्फ पर पहले से शांत का हल बुझाने का 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: "वांछित फसल बिंदु" प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर अलग अलग होंगे। उदाहरण के लिए, अगर एक मीटर की जांच करने के लिए गए थेetabolites एरोबिक विकास के दौरान, इस राज्य का महत्वपूर्ण संकेतक एसीटेट उत्सर्जन और बाद के घातीय वृद्धि चरण 32, 33 के दौरान एसीटेट के फिर से आत्मसात शामिल हैं। आम तौर पर, इस बिंदु एक विशिष्ट विकास मंच (जैसे, घातीय चरण) के भीतर होना चाहिए। विशिष्ट आयुध डिपो 600 इस स्तर के साथ जुड़े मूल्यों अलग जीवाणु उपभेदों और विकास मीडिया के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  3. एक स्टेनलेस स्टील फिल्टर मिलाना (-20 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से ठंडा) एक रबर डाट में रखें और एक निर्वात एक घर वैक्यूम या वैक्यूम पंप से जुड़ी कुप्पी के ऊपर रखें।
  4. वैक्यूम लागू करें और शीर्ष पर एक मिश्रित सेलूलोज़ एस्टर झिल्ली (0.22 सुक्ष्ममापी छेद के आकार) जगह।
    ध्यान दें: यह एक व्यास मिलाना के बराबर के साथ एक फिल्टर का उपयोग करने के लिए और ठीक से यह सुनिश्चित करें कि नमूना फिल्टर के माध्यम से करने के बजाय किनारे पर तैयार की है इस फिल्टर केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बहुत ठंडा, बाँझ एच के साथ झिल्ली गीला 2 हे मदद मिल सकती हैझिल्ली स्थिति के साथ।

4. नमूना हार्वेस्ट

  1. एक आयुध डिपो के 600 ~ 0.4-0.5 में कुप्पी से संस्कृति के 13 एमएल दूर करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग करें और फिल्टर करने के लिए नमूना लागू करने के लिए।
  2. बाद पूरे नमूना फ़िल्टर किया गया है, तुरंत मध्यम जुड़े चयापचयों दूर धोने के लिए बहुत ठंडा पीबीएस के ≥5 एमएल के साथ फिल्टर धो।
  3. वैक्यूम डिस्कनेक्ट करें और मिलाना से फिल्टर को हटाने के लिए बाँझ चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें। फिल्टर (सेल नीचे की ओर) पूर्व ठंडा बुझाना समाधान में उल्टें।
    ध्यान दें: यह जल्दी से ऊपर चरणों को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, सेकंड के भीतर) और जैसे ही तरल कोशिकाओं का तेजी से शमन सुनिश्चित करने के लिए, चयापचय गतिविधि को गिरफ्तार हटा दिया गया है।
  4. ≥20 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर बुझाना समाधान में फिल्टर सेते हैं।
  5. बाँझ चिमटी का प्रयोग, पेट्री डिश में फिल्टर (सेल की ओर) को उलटने और टी के बंद कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए एक micropipette का उपयोगवह बुझाना समाधान में झिल्ली।
  6. बुझाना समाधान में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया और उसके बाद एक बाँझ 2 एमएल आघात-रोधी युक्त 0.1 मिमी सिलिका मोतियों की ~ 100 μL ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण। सूखी बर्फ पर या -80 डिग्री सेल्सियस पर इस संग्रह करें।

5. Metabolite निष्कर्षण

  1. गीला बर्फ पर पिघलना नमूने और चक्र के बीच सूखी बर्फ पर 2 मिनट ठंडा समय के साथ, 6000 rpm पर चार 30 रों फटने के साथ एक homogenizer में कोशिकाओं को बाधित।
  2. एक पूर्व ठंडा, अधिकतम गति से प्रशीतित microcentrifuge में 15 मिनट के लिए lysates स्पष्ट (यानी, ≤4 डिग्री सेल्सियस पर 18,213 XG)।
  3. एक साफ microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  4. एक micropipette का प्रयोग, चरण 6 में अवशिष्ट पेप्टाइड सामग्री की मात्रा के लिए एक microcentrifuge ट्यूब नमूने के एक छोटे से हिस्से के लिए स्थानांतरण; -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष की दुकान।
    नोट: सुरक्षित नमूने की मात्रा, भिन्न होता है बीसीए कदम 6.1 में इस्तेमाल किया परख के आधार पर। इसनमूना तत्काल विश्लेषण के लिए गीला बर्फ पर संग्रहीत या -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जाना चाहिए।

6. Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख

  1. के रूप में किट निर्माता द्वारा सिफारिश की, प्रत्येक नमूने के लिए अवशिष्ट पेप्टाइड एकाग्रता का निर्धारण करने के कदम 5.4 से नमूने का उपयोग कर एक बीसीए परख प्रदर्शन करते हैं।

7. LC-एमएस

  1. मिक्स LC-एमएस विलायक बी के 75 μL के साथ 75 एस की μL ऑरियस निकालने, कदम 1.4 में तैयार किया।
  2. भंवर 13,000 XG पर मिश्रण और 5 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए।
  3. सतह पर तैरनेवाला के 100 μL एक तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) शीशी में रखें और यह टोपी। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले के नमूने में फंस जाते हैं।
  4. LC-एमएस autosampler पर नियंत्रण रेखा शीशियों लोड और सॉफ्टवेयर में चल रही सूची को संपादित "ऑफ़लाइन Worklist संपादक।"
    1. को भरें "नमूना नाम" (जैसे, जंगली प्रकार -1), "नमूना स्थिति" (जैसे, पी 1-A1), "विधि" (उदाहरण के लिए, चींटी एकसीआईडी-नकारात्मक विधि), और "डेटा फ़ाइल" (जैसे, जंगली प्रकार -1) कॉलम। बटन "सहेजें Worklist" बटन क्लिक करें। "मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण कार्य केंद्र" सॉफ्टवेयर और इनपुट पहले से सहेजे गए worklist खोलें। निरंतर LC-एमएस माप शुरू करने के लिए "प्रारंभ Worklist रन" बटन क्लिक करें।
  5. एक स्तंभ पर नमूने को अलग करें, उड़ान (टीओएफ) स्पेक्ट्रोमीटर का एक समय के लिए स्तंभ लिंक, और जोड़े को नियंत्रण रेखा प्रणाली के साथ टीओएफ स्पेक्ट्रोमीटर। इस प्रकार एक मोबाइल चरण ढाल का उपयोग करें: 0-2 मिनट, 85% विलायक बी; 3-5 मिनट, 80% विलायक बी; 6-7 मिनट, 75% विलायक बी; 8-9 मिनट, 70% विलायक बी; 10-11.1 मिनट, 50% विलायक बी; 11.1-14 मिनट, 20% विलायक बी; और 14.1-24 मिनट, 5% विलायक बी; 85% विलायक बी में एक 10 मिनट के लिए फिर से संतुलन अवधि और 0.4 एमएल मिनट -1 के प्रवाह की दर के साथ समाप्त।
  6. एक isocratic पंप का उपयोग करना, एक साथ बड़े पैमाने पर अक्ष अंशांकन के लिए अनुमति देने के लिए रन के साथ एक संदर्भ बड़े पैमाने पर समाधान डालने।
    नोट: यह कदममानक टीओएफ स्पेक्ट्रोमीटर पुस्तिका पर आधारित है।
    1. एसिटिक एसिड D4 और hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) संदर्भ बड़े पैमाने पर समाधान के रूप में phosphazine वास्तविक समय अंशांकन प्रदर्शन करने के मिश्रण का प्रयोग करें। 2.5 एमएल मिनट के प्रवाह की दर के साथ isocratic पंप -1 अर्क के लिए प्रयोग करें।

8. आयन काउंट्स बैच सुधार

  1. (, जैसे, जंगली प्रकार दोहराने 1) बैच सुधार के लिए एक संदर्भ नमूना के रूप में काम करने के लिए किसी भी नमूने निर्धारित करें।
  2. नमूने के भीतर सभी चयापचयों के लिए आयन मायने रखता है की राशि की गणना। सभी नमूनों के लिए इस गणना को दोहराएँ।
  3. संदर्भ नमूने की कुल आयन गिनती द्वारा प्रत्येक नमूने की कुल आयन गिनती विभाजित एक अनुपात उत्पन्न करने के लिए।
  4. प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए एक बैच-सुधारा आयन गिनती प्राप्त करने के लिए नमूना / संदर्भ अनुपात से एक नमूना के भीतर प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए आयन गिनती विभाजित करें।

9. पेप्टाइड सामान्यीकरण

  1. डीचरण 6 में बीसीए परख के साथ निर्धारित प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए एक सामान्यीकृत मान उपज के लिए पेप्टाइड एकाग्रता से 8 चरण में प्राप्त प्रत्येक नमूने के लिए बैच-सुधारा आयन गिनती मूल्यों ivide।
    नोट: सामान्यीकृत, बैच बैच को सही कदम 9.1 में प्राप्त प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए आयन मायने रखता है सीधे उपभेदों के बीच तुलना और सांख्यिकीय विश्लेषण (जैसे, एक मान-व्हिटनी यू टेस्ट) के अधीन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक मेटाबोलाइट जाना जाता अपरिवर्तित या तो उपचार या आनुवंशिक पृष्ठभूमि से अपघटन मेटाबोलाइट की वजह से परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक नॉर्मलाइज़र के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है किया जाना है। एल norvaline या निष्कर्षण बफर में gluraric एसिड का एक ज्ञात राशि के शामिल किए जाने नमूना प्रसंस्करण 34 के दौरान नुकसान के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

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Representative Results

हम एक अमीर, जटिल माध्यम में इन विट्रो विकास के दौरान एस ऑरियस में intracellular मेटाबोलाइट पूल विश्लेषण किया है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम तुलना मेथिसिल्लिन अतिसंवेदनशील एस ऑरियस अस्थिमज्जा का प्रदाह के बीच मेटाबोलाइट प्रोफाइल UAMS -1 (जंगली प्रकार [WT]) और एक isogenic तनाव वैश्विक ट्रांस्क्रिप्शनल नियामक कोड़ी (Δ कोड़ी) 26 की कमी को अलग। स्थिर राज्य, WT और कोड़ी उपभेदों के घातीय संस्कृतियों, टीएसबी माध्यम में स्थापित किए गए थे प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित है। जंगली प्रकार और कोड़ी -null उत्परिवर्ती संस्कृतियों के विकास व्यवहार विकास उपज और दर (चित्रा 1) में केवल मामूली अंतर के साथ समान थे। शाही सेना Seq और माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, हम और दूसरों कि कई aspartate से प्राप्त अमीनो एसिड के biosynthesis में शामिल एंजाइमों के लिए कोडिंग जीन कोड़ी -null उत्परिवर्ती ग में डी-दमन किया गया पता चलाटीएसबी में इन विट्रो विकास (चित्रा 2) 25, 27, 30 के दौरान WT कोशिकाओं को ompared। इसके अलावा, brnQ1 और brnQ2, जो branched श्रृंखला एमिनो एसिड permeases के लिए कोड, codY- अशक्त उत्परिवर्ती 30, 35 में overexpressed कर रहे हैं।

हद स्थिर राज्य इस मार्ग अशक्त उत्परिवर्ती में बदल रहे हैं के साथ जुड़े चयापचयों के intracellular प्रचुरता, हम LC-MS-आधारित मेटाबोलाइट रूपरेखा जो करने के लिए निर्धारित करने के लिए। WT और codY- अशक्त उत्परिवर्ती कोशिकाओं जैविक स्थिर राज्य के लिए विकसित किया गया है और प्रोटोकॉल के चरण 4 में वर्णित के रूप में नमूना थे। हम एक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर प्रत्येक chromatographically संकल्प लिया मेटाबोलाइट के लिए तीव्रता आयन शिखर क्षेत्र को एकीकृत करके मेटाबोलाइट प्रचुरता निर्धारित (देखें सामग्री सूची)। हम diff के लिए सहीप्रत्येक नमूने के अवशिष्ट पेप्टाइड एकाग्रता के लिए मेटाबोलाइट प्रचुरता सामान्य से बायोमास में erences। हम आगे प्रत्येक नमूने के भीतर सभी चयापचयों के लिए औसत आयन गिनती की गणना के द्वारा और संदर्भ मूल्य के रूप में जंगली प्रकार नमूना का उपयोग करके नमूने के बीच संभावित बैच प्रभाव के लिए इन मूल्यों को ठीक कर दिया। यह दृष्टिकोण की स्थिति भर मेटाबोलाइट प्रचुरता के अंतर-नमूना तुलना सक्षम होना चाहिए। किसी दिए गए नमूना भीतर इंटर मेटाबोलाइट तुलना इसी तरह पहले आयन की गिनती से सामान्यीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता परिवर्तित मानक अलावा की पद्धति का उपयोग करके मात्रा दाढ़ को प्राप्त किया जा सकता।

हम UAMS -1 और उसके codY- अशक्त उत्परिवर्ती में aspartate मार्ग में महत्वपूर्ण मध्यवर्ती के स्तर की तुलना में है। के रूप में 3 चित्र में देखा, इस मार्ग के अंत उत्पादों (जैसे, threonine और (आईएसओ) -leucine), कोड़ी -null उत्परिवर्ती कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में हैं, जबकि पूर्ववर्ती (जैसे,aspartate और ओ -acetyl homoserine) WT कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में हैं। BrnQ के संयुक्त अपरेगुलेशन 36 permeases और ILV biosynthetic मार्ग की संभावना isoleucine और leucine 30 में बढ़ जाती है की ओर जाता है। हालांकि मतभेद अपेक्षाकृत छोटे (<4 गुना) कर रहे हैं, LC-MS-आधारित quantitation और बैच सुधार मजबूत और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन है कि कोड़ी द्वारा मध्यस्थता ट्रांस्क्रिप्शनल परिवर्तन के साथ संगत कर रहे हैं प्रकट करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: एस ऑरियस UAMS -1 का विकास व्यवहार और टीएसबी में एक isogenic कोड़ी -null उत्परिवर्ती। समय कोशिकाओं स्थिर राज्य घातीय वृद्धि में खर्च बढ़ाने के लिए, संस्कृतियों 0.05 की एक ऑप्टिकल घनत्व के ताजा माध्यम में बैक-पतला होने के बाद पूर्व संस्कृतियों एक आयुध डिपो के 600 1 ~ हासिल की। LC-एमएस मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र किए गए थे~ 0.5 (तीर) के एक ऑप्टिकल घनत्व में प्रयोगात्मक संस्कृतियों से। दिखाया गया डेटा तीन जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं।

चित्र 2
चित्र 2: aspartate से प्राप्त चयनित चयापचयों के योजनाबद्ध। जीन और operons जिसके उत्पाद aspartate-परिवार अमीनो एसिड इटैलिक में इंगित किया गया है के संश्लेषण को उत्प्रेरित; के रूप में शाही सेना seq विश्लेषण 29 द्वारा निर्धारित, जंगली प्रकार की तुलना में एक कोड़ी -null उत्परिवर्ती में प्रतिलेख बहुतायत में वृद्धि, यह भी कहा जाता है। DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelate)।

चित्र तीन
चित्र 3: aspartate परिवार में चयापचयों के प्रचुरता एक कोड़ी उत्परिवर्ती में बदल दिया जाता है। में चयनित चयापचयों के लॉग 2 गुना परिवर्तनcodY- अशक्त उत्परिवर्ती UAMS -1 (WT) की तुलना में दिखाए जाते हैं। परिवर्तन वट स्ट्रेन के तीन जैविक प्रतिकृति की औसत बहुतायत से codY- अशक्त तनाव के तीन जैविक प्रतिकृति की औसत बहुतायत विभाजित करके निर्धारित किया गया था। प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए जैविक प्रतिकृति के बीच मानक त्रुटि 35% था <। डैश रेखाएं एक लॉग 2 1.5 गुना परिवर्तन, कटऑफ इस प्रयोग में इस्तेमाल किया संकेत मिलता है।

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Discussion

सभी छोटे अणु चयापचयों केंद्रीय चयापचय मार्ग में उनकी आम मूल के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े हुए हैं। घातीय वृद्धि के दौरान, बैक्टीरियल कोशिकाओं विशिष्ट परिस्थितियों में शारीरिक स्थिति का एक स्नैपशॉट प्रदान जैविक और चयापचय स्थिर अवस्था में हैं,। कोड़ी ILV और जीटीपी का जवाब देने से पोषक तत्व प्रचुरता नज़र रखता है। ILV और जीटीपी पूल बूंद के रूप में, कोड़ी गतिविधि की संभावना उत्तरोत्तर कम हो जाता है, पोषक तत्व रिक्तीकरण 30 बढ़ाने के लिए अनुकूल करने के लिए अपने लक्ष्य जीनों की अभिव्यक्ति का समायोजन। एक कोड़ी की कमी तनाव बर्ताव करता है जैसे कि ILV और जीटीपी पर्यावरण से समाप्त हो रहे हैं, लेकिन केवल एक बहुत हल्के (चित्रा 1) कोड़ी-कुशल तनाव में वृद्धि व्यवहार सापेक्ष अंतर दर्शाती है। इस प्रकार, इन उपभेदों में चयापचयों के स्थिर राज्य पूल की तुलना हद तक जब पोषक तत्वों दुर्लभ हैं जो करने के लिए चयापचय पुन: कॉन्फ़िगर है प्रकट करने के लिए एक अनूठा अवसर के साथ हमें प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कहांआर प्रयोगों मेटाबोलाइट प्रचुरता की जांच जब कोड़ी गतिविधि (ILV और जीटीपी घातीय चरण में सबसे प्रचुर मात्रा में कर रहे हैं) अधिकतम है। हालांकि, अन्य प्रश्न विकास के अन्य चरणों में संबोधित किया जा सकता। उदाहरण के लिए, घातीय चरण में, tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र गतिविधि बहुत कम है; बाद घातीय चरण में, टीसीए चक्र 36 सक्रिय है। समलक्षणियों की एक संख्या, मेटाबोलाइट प्रचुरता सहित, इस सक्रियण पर निर्भर होते हैं। साथ ही, agr कोरम संवेदन प्रणाली स्थिर चरण 37 को घातीय वृद्धि से संक्रमण के दौरान सक्रिय हो जाता है। बाद घातीय या स्थिर चरण में नमूने एकत्रित इन विषयों को संबोधित कर के अध्ययन के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है। जब नमूने काटा जाता है के बावजूद, यह, इकट्ठा करने के लिए धोने, और जितनी जल्दी संभव हो निष्कर्षण बफर करने के लिए नमूने हस्तांतरण (यानी, रों अंदर), मेटाबोलाइट कारोबार होता है कि कम करने के लिए स्थिर राज्य परेशान है महत्वपूर्ण है।

chromatographic विधि यहाँ वर्णित विशेष रूप से ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय एमिनो एसिड और केंद्रीय कार्बन चयापचय यौगिकों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल है। हालांकि, अतिरिक्त वर्ग विशेष के तरीकों ब्याज chromatographically इस विधि से हल नहीं किया की विशिष्ट यौगिकों यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एसिटिक एसिड के साथ फार्मिक एसिड की जगह के रूप में एक additive isoleucine और leucine 38 का संकल्प सक्षम करने के लिए सूचित किया गया है द्वारा chromatographic मोबाइल चरण के पीएच फेरबदल। निष्कर्षण प्रक्रिया में संशोधन करना इसी तरह वसूली और अस्थिर चयापचयों कि यहां इस्तेमाल किया निष्कर्षण विधि के प्रति संवेदनशील हैं की मात्रा सक्षम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कि डाइसल्फ़ाइड बांड गठन की संभावना है इस तरह के सिस्टीन जैसे यौगिकों संभावित Ellman के अभिकर्मक 39 के साथ derivatization निम्नलिखित बरामद किया जा सकता। नाइट्रोजन गैस के साथ Sparging निष्कर्षण बफ़र्स रक्षा कर सकते हैं NAD + और NADHअनुपात, सेलुलर रेडोक्स राज्य 40 के एक आकलन के लिए अनुमति देता है। न्यूक्लीओसाइड triphosphates बुनियादी या unbuffered समाधान में विघटित कर सकते हैं; निष्कर्षण समाधान अम्लीय बना इन अणुओं 41 की वसूली में सुधार कर सकते हैं।

एक तेजी से बढ़ रही है बैक्टीरियल संस्कृति में, एक या अधिक पोषक तत्वों की कमी से विकास के बाद घातीय और स्थिर चरणों के लिए संक्रमण की ओर जाता है। ये विकास चरणों अलग चयापचय राज्यों 42 की विशेषता है। Chemostat आधारित संस्कृतियों जीन अभिव्यक्ति और शारीरिक अध्ययन के लिए लगभग निरंतर जैविक स्थिर अवस्था आदर्श उत्पन्न करते हैं। हालांकि, विधि, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है तकनीकी रूप से मांग है, और जरूरी है कि एक पोषक तत्व सीमा प्रवाह के तहत कोशिकाओं का एक स्थिर आबादी बनाए रखने के लिए लगाया जा। उत्तरार्द्ध आवश्यकता चर या फिर अलावा अन्य कारकों की वजह से ट्रांस्क्रिप्शनल और शारीरिक विचलन का कारण बनता हैgulator विश्लेषण किया जा रहा। मात्रा के अनुपात (ऑक्सीजन का स्तर बढ़ सकता है में मामूली परिवर्तन: यह सुनिश्चित करें कि हमारे कुप्पी के आधार पर परिणामों को स्थिर अवस्था में और दो चरणों के बीच एक संक्रमण की नहीं तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं, हम एक सुसंगत कुप्पी के साथ एक डबल वापस कमजोर पड़ने रणनीति को रोजगार बदल चयापचय 36, 42)। रात भर संस्कृतियों की एक प्रारंभिक कमजोर पड़ने के बाद, इन कोशिकाओं ने आयुध डिपो के 600 ~ 1.0 की वृद्धि हुई है, एक आयुध डिपो के 600 ~ 0.05 करने के लिए बैक-पतला, और काटा जब वे 0.5 की ~ एक आयुध डिपो 600 तक पहुँचते हैं। इस तरह की एक विधि को भी cytoplasmic अणुओं है कि स्थिर RNAs सहित रातोंरात विकास, के दौरान जमा dilutes। दरअसल, RNAIII, agr कोरम संवेदन प्रणाली के प्रेरक, ऐसे ही एक शाही सेना है और कोड़ी 25, 43, 44 के रूप में ही जीन लक्ष्यों में से कुछ की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता। संचित RNAIII कोड़ी-DEP ​​मुखौटा कर सकते हैंendent विनियमन, कोड़ी (शर्मा और Brinsmade, अप्रकाशित परिणाम) द्वारा दमन या उत्तेजना की ताकत का एक बहुत मूल्यवान समझना के लिए अग्रणी।

इस विश्लेषण की एक सीमा है कि यह कोशिका के भीतर मेटाबोलाइट प्रचुरता की एक तात्कालिक झलक प्रदान है, कोई निष्कर्ष किसी भी मार्ग के माध्यम से प्रवाह में परिवर्तन के बारे में परिणामों से खींचा जा सकता है। उदाहरण के लिए, लाइसिन और जांच की परिवर्तन नहीं किया दो उपभेदों के बीच मेथिओनिन की प्रचुरता, codY- अशक्त तनाव में biosynthetic एंजाइमों की de-दमन के बावजूद (आंकड़े 2 और 3)। कोड़ी -null तनाव वास्तव में अधिक लाइसिन और मेथिओनिन पैदा हो सकता है, लेकिन वे तेजी से अन्य यौगिकों में परिवर्तित किया जा सकता है; इस प्रकार, इन अणुओं अर्जित नहीं करेंगे। 13 सी या 15 का उपयोग करते हुए एन लेबल कार्बन या नाइट्रोजन स्रोतों हमें प्रमुख चयापचय जंक्शनों 45 <के माध्यम से कार्बन और नाइट्रोजन कंकाल का पालन करने की अनुमति होगीsup> 46।

हम एस ऑरियस में मेटाबोलाइट पूल में परिवर्तन स्पष्ट करना वर्णित विधि, बी subtilis 29, माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग 47, और एन्तेरोकोच्चुस faecium 48 का इस्तेमाल किया है, लेकिन विधि अन्य सहित अन्य ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए लागू किया जा सकता है, मानव रोगजनकों आसानी से प्रयोगशाला में खेती की। दरअसल, metabolomic और transcriptomic जानकारी को एकीकृत चयापचय और डाह के बीच अप्रत्याशित कनेक्शन है, जो उपन्यास रणनीतियों के लिए नेतृत्व संक्रमण के इलाज के सकता है प्रकट कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में एक एनआईएच मार्ग स्वतंत्रता पुरस्कार के लिए (जीएम 099,893 अनुदान) और संकाय स्टार्टअप धन एसआरबी को, और साथ ही एक अनुसंधान परियोजना अनुदान (जीएम 042,219 अनुदान) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रहण और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने के लिए निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

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Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

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