Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Her beskriver vi en protokol til ekstraktion af metabolitter fra Staphylococcus aureus og deres efterfølgende analyse via væskekromatografi og massespektrometri.

Abstract

I et forsøg på at forpurre bakterielle patogener, værter ofte begrænse tilgængeligheden af ​​næringsstoffer i stedet for infektion. Denne begrænsning kan ændre mængderne af centrale metabolitter, som regulatoriske faktorer reagerer, justering cellulær metabolisme. I de senere år har en række proteiner og RNA opstået som vigtige regulatorer af virulens genekspression. For eksempel Cody proteinet reagerer på niveauer af forgrenede aminosyrer og GTP og er bredt konserveret i lav G + C grampositive bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, Cody kontrollerer ekspressionen af snesevis af virulens og metaboliske gener. Vi hypotesen, at S. aureus anvender Cody delvis at ændre sin metabolisk tilstand i et forsøg på at tilpasse sig til næringsstof-begrænsende betingelser potentielt stødt i værtsmiljøet. Dette manuskript beskriver en fremgangsmåde til ekstraktion og analyse af metabolitter fra S. aureus under anvendelse af væskekromatografi koblet med massespektrumtrometry, en protokol, der blev udviklet for at teste denne hypotese. Fremgangsmåden fremhæver også god praksis som kan sikre stringens og reproducerbarhed, såsom opretholdelse af biologisk stabil tilstand og konstant beluftning uden brug af kontinuerlige kemostat kulturer. I forhold til de USA200 methicillin-modtagelige S. aureus isolere UAMS-1 parentale stamme, den isogene Cody mutanten udviste signifikante stigninger i aminosyrer afledt fra aspartat (fx threonin og isoleucin) og fald i deres forstadier (for eksempel aspartat og O -acetylhomoserine ). Disse fund korrelerer godt med transkriptionelle data opnået med RNA-seq analyse: gener i disse veje opreguleret mellem 10- og 800-fold i Cody null mutant. Kobling globale analyser af transkriptom og metabolomet kan afsløre, hvordan bakterier ændre deres metabolisme når de står med miljø- eller ernæringsmæssig stress, der giver potentiel indsigt i fysiological ændringer forbundet med næringsstof udtynding oplevet under infektion. Sådanne opdagelser kan bane vejen for udviklingen af ​​hidtil ukendte anti-infektiøse og terapeutika.

Introduction

Bakteriepatogener skal kæmpe med mange udfordringer inden værten miljø. Ud over direkte angreb af immunceller, værten sekvestrerer også næringsstoffer afgørende for bakteriel overlevelse og replikation, frembringelse ernæringsmæssige immunitet 1, 2. For at overleve disse fjendtlige miljøer, bakterielle patogener implementere virulensfaktorer. Nogle af disse faktorer tillader bakterierne at unddrage sig den immunrespons; Andre faktorer omfatter udskilles fordøjelsesenzymer, såsom hyaluronidase, thermonuclease, og lipase, som kan gøre det muligt for bakterierne at genopbygge manglende næringsstoffer ved at indtage vævsafledte bestanddele 3, 4, 5. Faktisk har bakterier udviklet reguleringssystemer, der binder den fysiologiske tilstand af cellen til produktion af virulensfaktorer 6, 7, op class = "xref"> 8, 9, 10.

En voksende dokumentation peger på Cody som et kritisk regulator forbinder metabolisme og virulens. Selvom først opdaget i Bacillus subtilis som en repressor af dipeptidet permease (dpp) gen 11 er Cody nu vides at blive produceret af næsten alle de lave G + C Gram-positive bakterier 12, 13 og regulerer snesevis af gener involveret i carbon og nitrogenmetabolisme 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogene arter, Cody styrer også udtryk for nogle af de vigtigste virulensgener 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveres som en DNA-bindende protein ved to klasser af ligander: forgrenet aminosyre (BCAA, isoleucin, leucin og valin [ILV]) og GTP . Når disse næringsstoffer er rigelige, Cody undertrykker (eller i nogle tilfælde stimulerer transskription). Da disse næringsstoffer bliver begrænset, Cody aktivitet nedsættes gradvis, hvilket resulterer i en gradueret transkriptionel respons, som re-dirigeres forstadier gennem forskellige metaboliske veje er forbundet til det centrale stofskifte 28, 29, 30.
Tandem væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) er en kraftfuld teknik, der nøjagtigt kan identificere og kvantificere små molekyler intracellulære metabolitter 31. Når parret med transcriptome analyse (fx RNA-Seq), denne analytiske arbejdsgang kan give indsigt i de fysiologiske forandringer, der sker som reaktion på miljømæssig eller ernæringsmæssig stress. Her præsenteres en fremgangsmåde til metabolit ekstraktion fra Staphylococcus aureus-celler og efterfølgende analyse via LCMS. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at påvise de pleiotrope virkninger af Cody på S. aureus fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af Buffer Solutions

  1. Forberede phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) ved fortynding af en stamopløsning af 10x PBS til en slutkoncentration på 1 x med ultrarent (destilleret og deioniseret) vand.
  2. Forberede quenching opløsning ved at kombinere 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrarent H2O, og 19 pi (0,1 mM slutkoncentration) myresyre.
  3. Forberede LC-MS opløsningsmiddel A ved tilsætning af myresyre (0,2% [v / v] slutkoncentration) til ultrarent vand.
  4. Forberede LC-MS opløsningsmiddel B ved tilsætning af myresyre (0,2% [v / v] slutkoncentration) til acetonitril.
    BEMÆRK: Alle opløsninger skal fremstilles under anvendelse af højeste renhed reagenser tilgængelige (generelt HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI klasse). Bør fremstilles frisk før hvert forsøg og opbevares på is før anvendelse.

2. Etablering af Steady state S. aureus Vækst

  1. Streak S. aureus stammer af interesse for isolation på tryptisk sojaagar (TSA) fra en frossen glycerolstamopløsning. Der inkuberes ved 37 ° C i 16-24 timer.
  2. Pode 4 ml tryptisk bouillon (TSB) eller et andet egnet medium i sterile glas inkuberingsrørene med enkelte kolonier af hver stamme. Inkuber hældende (~ 70 ° vinkel) med rotation ved 60 omdrejninger pr minut (rpm) ved 37 ° C i 16-20 timer.
    BEMÆRK: Overnatskulturer er tilbøjelige til ilt gradienter ved brug af standardmetoder, herunder dem beskrevet i trin 2.2, som påvirker cellulær fysiologi. Således beskæftiger vi en multipel back-fortynding strategi for at sikre biologisk stabil tilstand (se trin 2,4-3,2, nedenfor).
  3. Bruge et spektrofotometer til at måle den optiske tæthed af kulturerne fra trin 2.2 ved 600 nm (OD 600). Bruge sterilt medium som optisk reference (tom). Fortynd disse celler til en OD600 på 0,05 i 50 ml sterilt TSB medium (forvarmet til 37 ° C) i separate, 250 mL DeLong-kolber.
  4. INCUpyr kulturerne ved 37 ° C i et vandbad under omrystning ved 280 rpm.
  5. Hver 30 min, tage OD 600 målinger; som de optiske densiteter øges, kan det blive nødvendigt at fortynde kulturerne med TSB så de forbliver inden for det lineære absorbans spektrophotometerets.
  6. Når kulturer fra trin 2.5 opnå en OD600 på ~ 0,8-1,0, videredyrke dem i 50 ml 37 ° C TSB til en OD600 på 0,01-0,05 og gentage trin 2.4 og 2.5.

3. Prøvetagning opsætning

  1. Forberede et leje af knust tøris i et passende kar (for eksempel glas skål, ice bucket, eller køligere).
  2. Som de optiske densiteter af kulturerne nærmer det ønskede høst punkt, tilsættes 1 ml quenching opløsning til en 35 mm ubehandlet petriskål og pre-cool på tøris i ≥5 min.
    BEMÆRK: "ønskede høst point" vil variere afhængigt af eksperimentelle mål. For eksempel, hvis man skulle undersøge metabolites under aerob vækst, vigtige indikatorer for denne tilstand indbefatter acetat udskillelse og re-assimilation af acetatet under den post-eksponentielle vækstfase 32, 33. Generelt bør dette punkt være inden for en bestemt vækststadium (fx eksponentiel fase). De specifikke OD 600 værdier forbundet med dette trin kan variere mellem forskellige bakteriestammer og vækstmedier.
  3. Placer en rustfri stål filterfritte (forkølet til -20 ° C) i en gummiprop og placere den oven på en vakuumkolbe forbundet til en husvakuum eller vakuumpumpe.
  4. Påfør vakuum og placere en blandet celluloseester-membran (0,22 um porestørrelse) oven.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge et filter med en diameter svarende til den for fritten og til korrekt centrere dette filter for at sikre, at prøven trækkes gennem filteret i stedet over kanten. Befugtning af membranen med iskoldt, sterilt H2O kan hjælpemed positionering af membranen.

4. Prøve Harvest

  1. Ved en OD 600 på ~ 0,4-0,5, anvende en serologisk pipette til fjernelse af 13 ml af kulturen fra kolben og at påføre prøven til filteret.
  2. Efter at hele prøven er blevet filtreret vaskes straks filteret med ≥5 ml iskoldt PBS for at vaske væk mellemstore associerede metabolitter.
  3. Afbryd vakuum og anvender et par af sterile pincetter at fjerne filteret fra fritten. Vend filteret (celle nedad) ind i forkølet quench opløsning.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre ovenstående trin hurtigt (dvs. inden for sekunder), og så snart væsken er blevet fjernet for at sikre en hurtig bratkøling af cellerne standsning metabolisk aktivitet.
  4. Inkubere filteret i quench opløsning på tøris i ≥20 min.
  5. Anvendelse af steril pincet vendes filteret (celle opad) i petriskålen og bruge en mikropipette til skylning af cellerne off af than membran ind i quench opløsning.
  6. Resuspenderes cellerne i quench-opløsning og derefter overføre cellesuspensionen til en steril 2 ml slagfast rør indeholdende ~ 100 pi 0,1 mm silicaperler. Gemme denne på tøris eller ved -80 ° C.

5. Metabolit Extraction

  1. Tø prøver på våd is og forstyrre cellerne i en homogenisator med fire 30 s bursts ved 6.000 rpm, med 2 min afkølingsperioder på tøris mellem cyklusserne.
  2. Klarlægge lysaterne i 15 min i en forud kølet, nedkølet mikrocentrifuge ved maksimal hastighed (dvs. 18.213 xg ved ≤4 ° C).
  3. Supernatanten overføres til et rent mikrocentrifugerør.
  4. Med en mikropipette overføre en lille del af prøven til et mikrocentrifugerør til kvantificering af resterende peptidindhold i trin 6; gemme resten ved -80 ° C.
    BEMÆRK: Volumenet af reserverede prøve varierer afhængigt af BCA-analyse anvendes i trin 6.1. Det herprøve skal opbevares på våd is til umiddelbar analyse eller nedfrosset ved -80 ° C.

6. bicinchoninsyre (BCA) assay

  1. Udføre en BCA-analyse som anbefalet af kit fabrikanten, under anvendelse af prøver fra trin 5.4 for at bestemme den resterende peptid koncentration for hver prøve.

7. LC-MS

  1. Bland 75 pi af S. aureus ekstrakt med 75 pi LC-MS opløsningsmiddel B, fremstillet i trin 1.4.
  2. Vortex at blande og centrifugering ved 13.000 xg i 5 min.
  3. Placer 100 pi supernatant i et væskekromatografi (LC) hætteglas og cap det. Sikre, at ingen luftbobler er fanget i prøven.
  4. Læg LC hætteglas på LC-MS autosampler og redigere kørende listen i softwaren "Offline arbejdsliste Editor."
    1. Udfylde "Sample Name" (fx vildtype-1), "Sample Position" (fx P1-A1), "Method" (fx myresyre Acid-Negativ Metode), og "Data File" (f.eks vildtype-1) kolonner. Klik på knappen knappen "Gem arbejdsliste". Åbn "massespektrometri dataopsamling Workstation" software og input den tidligere gemte arbejdsliste. Klik på knappen "Start arbejdsliste Kør" for at starte den kontinuerlige LC-MS-måling.
  5. Adskille prøverne på en søjle, linke kolonnen til en flyvetid (TOF) spektrometer, og koble TOF spektrometer med LC-systemet. Anvende en mobil fase-gradient som følger: 0-2 min, 85% opløsningsmiddel B; 3-5 min, 80% opløsningsmiddel B; 6-7 min, 75% opløsningsmiddel B; 8-9 min, 70% opløsningsmiddel B; 10-11,1 min, 50% opløsningsmiddel B; 11,1-14 min, 20% opløsningsmiddel B; og 14,1 til 24 min, 5% opløsningsmiddel B; enden med en 10 min reækvilibrering periode på 85% opløsningsmiddel B og en strømningshastighed på 0,4 ml min-1.
  6. Ved anvendelse af en isokratisk pumpe, indgyde en referencemasse opløsning med kørslen for at muliggøre samtidig masseaksen kalibrering.
    BEMÆRK: Dette triner baseret på et standard TOF spektrometer manual.
    1. Bruge blanding af eddikesyre D4 og hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluorpropoxy) Phosphazinbase som reference masse opløsning til at udføre real-time kalibrering. Bruge isokratisk pumpe med strømmen på 2,5 ml min-1 for infusionen.

8. Batch Korrektion af Ion greverne

  1. Betegner nogen prøve at tjene som en referenceprøve til batch korrektion (fx vildtype, replikere 1).
  2. Beregn summen af ​​ion tællinger for alle metabolitter i referenceprøven. Gentag denne beregning for alle prøver.
  3. Dividere det samlede ion optælling af hver prøve med det samlede ion optælling af referenceprøven at generere et forhold.
  4. Opdele ion tæller for hver metabolit i en prøve af prøven / referenceforhold til opnåelse af en batch-korrigeret ion tæller for hver metabolit.

9. Peptid Normalisering

  1. Divide de batch-korrigerede ion tælleværdier for hver prøve opnået i trin 8 af peptidet koncentrationen bestemt med BCA-analyse i trin 6 for at give en normaliseret værdi for hvert metabolit.
    BEMÆRK: De normaliserede, batch-batch korrigeret ion tællinger for hver metabolit opnået i trin 9.1 kan sammenlignes direkte mellem stammer og underkastet statistisk analyse (fx en Mann-Whitney U-test). Alternativt til en metabolit kendt uændret enten ved behandlingen eller genetisk baggrund, kan anvendes som en normalizer at detektere ændringer som følge af metabolit sønderdeling. Inkluderingen af en kendt mængde L-norvalin eller gluraric syre i udvinding buffer kan anvendes til at korrigere for tab under prøvebehandling 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har analyseret intracellulære metabolit pools i S. aureus under in vitro vækst i et rigt, komplekst medium. Som bevis for princippet, sammenlignede vi metabolitprofiler mellem methicillinmodtagelig S. aureus osteomyelitis isolere UAMS-1 (vildtype [WT]) og en isogen stamme, der mangler den globale transkriptionel regulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state blev eksponentielle kulturer af WT og Cody stammer etableret i TSB-medium, som beskrevet i trin 2 i protokollen. Væksten adfærd vildtype- og Cody-null mutant kulturer var ens, med kun milde forskelle i vækst udbytte og hastighed (figur 1). Anvendelse af RNA-Seq og microarray teknologi, vi og andre viste, at flere gener kodende for enzymer involveret i biosyntesen af aminosyrer afledt fra aspartat blev de-represseret i Cody-null mutant-compared til WT-celler under in vitro vækst i TSB (figur 2) 25, 27, 30. Desuden brnQ1 og brnQ2, som koder for forgrenet aminosyre permeaser, overudtrykkes i codY- nulmutant 30, 35.

At bestemme i hvilket omfang steady state intracellulære mængderne af metabolitter, der er forbundet med denne pathway ændres i nulmutant, udførte vi LC-MS-baserede metabolit profilering. WT og codY- nulmutant-celler blev dyrket til biologisk stabil tilstand og blev udtaget som beskrevet i trin 4 i protokollen. Vi bestemt metabolit overflod ved at integrere toparealet ion intensitet for hver kromatografisk løst metabolit ved hjælp af et analytisk softwarepakke (se Materialer List). Vi korrigeret for diffreferencebasis i biomasse ved at normalisere metabolit mængderne til den resterende peptid i hver prøve. Vi yderligere korrigeret disse værdier for potentielle batch virkninger mellem prøver ved at beregne den gennemsnitlige ion tæller for alle metabolitter inden hver prøve og ved at anvende vildtype-prøve som referenceværdien. Denne tilgang aktiveret inter-sample sammenligninger af metabolit forekomster tværs betingelser. Inter-metabolit sammenligninger inden en given prøve kan tilsvarende opnås ved først at omdanne normaliserede metabolit mængderne fra ion tæller til molære mængder ved hjælp af fremgangsmåden ifølge standard tilsætning.

Vi har sammenlignet niveauerne af vigtige mellemprodukter i aspartat vej hos UAMS-1 og dets codY- null mutant. Som det ses i figur 3, slutprodukterne dette forløb (for eksempel threonin og (iso) -leucin) er mere rigelige i Cody-null mutantceller, medens forstadier (for eksempelaspartat og o acetyl homoserin) er mere rigelige i WT-celler. Den kombinerede opregulering af BrnQ permeaser 36 og ILV biosyntesevejen sandsynligvis fører til stigninger i isoleucin og leucin 30. Selvom forskellene er relativt lille (<4 gange), LC-MS-baserede kvantificering og batch korrektion afslører robuste og statistisk signifikante ændringer der er i overensstemmelse med transkriptionelle ændringer medieret af Cody.

figur 1
Figur 1: Vækst opførsel af S. aureus UAMS-1 og en isogen Cody-null mutant i TSB. At forlænge tiden cellerne tilbragt i steady-state eksponentiel vækst blev kulturer back-fortyndet til en optisk densitet på 0,05 i frisk medium efter forkulturer opnået en OD600 på ~ 1. Prøver til LC-MS metabolitanalyse blev opsamletfra eksperimentelle kulturer ved en optisk densitet på ~ 0,5 (pile). De viste data er repræsentative for tre biologiske gentagelser.

Figur 2
Figur 2: Skematisk af udvalgte metabolitter afledt fra aspartat. Gener og operoner hvis produkter katalyserer syntesen af ​​aspartat-familie aminosyrer er angivet i kursiv; stigningen i transkriptoverflod i en Cody-null mutant sammenlignet med vildtype, som bestemt ved RNA-seq analyse 29, bemærkes også. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelat).

Figur 3
Figur 3: mængderne af metabolitter i aspartatfamilien ændres i en Cody mutant. De log 2-fold ændringer af udvalgte metabolitter icodY- null mutant sammenlignet med UAMS-1 (WT) er vist. Ændringen blev bestemt ved at dividere den gennemsnitlige overflod af tre biologiske replikater af den codY- null stamme ved den gennemsnitlige overflod af tre biologiske replikater af WT-stammen. Standardfejlen mellem biologiske replikater for hver metabolit var <35%. De stiplede linier angiver en log 2 1,5 gange ændring, cutoff anvendt i dette forsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle små molekyler metabolitter forbundet med hinanden via deres fælles oprindelse i de centrale metaboliske veje. Under eksponentiel vækst, bakterieceller er i biologisk og metabolisk stabil tilstand, tilvejebringelse af et øjebliksbillede af den fysiologiske tilstand under specifikke betingelser. Cody overvåger næringsstof tilstrækkelighed ved at reagere på ILV og GTP. Som ILV og GTP pools dråbe, er Cody aktivitet sandsynligvis nedsættes gradvis, indstilling af ekspression af dens målgener til at tilpasse sig stigende næringsstof udtømning 30. En Cody-manglende stamme opfører sig som om ILV og GTP er udtømt fra miljøet, men kun udviser en meget mild forskel i vækst adfærd i forhold til Cody-dygtige stamme (figur 1). Således sammenligningen af ​​steady-state puljer af metabolitter i disse stammer giver os en unik mulighed for at afsløre i hvilket omfang metabolisme omkonfigureres når næringsstoffer er knappe. Det skal bemærkes, at our eksperimenter undersøge metabolit mængderne når Cody aktivitet er maksimeret (ILV og GTP er mest udbredte i eksponentiel fase). Dog kan andre spørgsmål behandles i andre faser af vækst. For eksempel i eksponentiel fase, tricarboxylsyre (TCA) cyklussen aktivitet er meget lav; i post-eksponentielle fase, TCA-cyklen aktiveret 36. En række fænotyper, herunder metabolit mængderne, er afhængige af denne aktivering. Derudover agr quorum sensing systemet bliver aktiv under overgangen fra eksponentiel vækst til stationær fase 37. Indsamling prøver i post-eksponentielle eller stationær fase kan være mere relevante for undersøgelser vedrørende disse emner. Uanset hvornår prøverne høstes, er det vigtigt at indsamle, vask, og overføre prøverne til ekstraktionspufferen så hurtigt som muligt (dvs. inden s) for at minimere metabolitten omsætning, som opstår, når steady state er perturberede.

Den kromatografiske metode beskrevet her er særligt egnet til analyse af polære og ikke-polære aminosyrer og centrale carbon metabolisme forbindelser. Imidlertid kan yderligere klassespecifikke metoder anvendes til at kvantificere specifikke forbindelser af interesse ikke kromatografisk løses ved denne metode. For eksempel ændring af pH af det chromatografiske mobile fase ved at erstatte myresyre med eddikesyre som tilsætningsstof er blevet rapporteret at muliggøre løsningen af isoleucin og leucin 38. Modificering ekstraktionsproceduren kan tilsvarende aktivere genvinding og kvantificering af labile metabolitter der er følsomme for den ekstraktionsmetode anvendes her. For eksempel kan forbindelser såsom cystein der er tilbøjelige til dannelse af disulfidbinding potentielt udvindes efter derivatisering med Ellmans reagens 39. Gennembobling ekstraktionsbuffere med nitrogengas kan bevare NAD + og NADHforhold, der giver mulighed for en vurdering af den cellulære redoxtilstanden 40. Nucleosidtriphosphater kan nedbrydes i basiske eller upufrede opløsninger; syrning ekstraktionsopløsningen kan forbedre genopretning af disse molekyler 41.

I en eksponentielt voksende bakteriekultur, udtømning af et eller flere næringsstoffer fører til overgangen til den post-eksponentielle og stationære vækstfaser. Disse vækstfaser er karakteriseret ved distinkte metaboliske tilstande 42. Kemostat-baserede kulturer generere en næsten kontinuerlig biologisk stabil tilstand ideel til genekspression og fysiologiske studier. Imidlertid er fremgangsmåden kræver specialiseret udstyr, er teknisk krævende, og nødvendiggør, at en næringsstofsbegrænsning pålægges at opretholde en stabil population af celler under flow. Sidstnævnte krav forårsager transkriptions- og fysiologiske forstyrrelser som følge af andre end den variable eller re faktorergulator der analyseres. At sikre, at vores kolbe-baserede resultater er repræsentative for celler, der vokser eksponentielt ved stabil tilstand og ikke af en overgang mellem to faser, vi anvender en dobbelt-back fortynding strategi med en konsekvent kolbe: volumen-forholdet (små ændringer i iltindholdet kan føre til ændret metabolisme 36, 42). Efter en indledende fortynding af overnatskulturer, er disse celler dyrket til en OD600 på ~ 1,0, back-fortyndet til en OD600 på ~ 0,05 og høstet, når de når en OD600 på ~ 0,5. En sådan fremgangsmåde fortynder også cytoplasmiske molekyler som samler sig under vækst natten over, herunder stabile RNA'er. Faktisk RNAIII er effektoren af agr quorum sensing system er et sådant RNA og regulerer ekspressionen af nogle af de samme genmål som Cody 25, 43, 44. Akkumuleret RNAIII kan maskere CODY-dependent regulering, hvilket fører til en undervurdering af styrken af ​​undertrykkelse eller stimulering med Cody (Sharma og Brinsmade, upublicerede resultater).

En begrænsning ved denne analyse er, at det giver en øjeblikkelig glimt af metabolit overflod i cellen; nogen konklusioner kan drages fra resultaterne vedrørende ændringer i flux gennem en given pathway. For eksempel mængderne af lysin og methionin mellem de to undersøgte ændrede ikke stammer trods de-repression af biosyntetiske enzymer i codY- null-stammen (figur 2 og 3). Cody-null-stamme kan faktisk være generere mere lysin og methionin, men de kan hurtigt omdannes til andre forbindelser; således har disse molekyler ikke ophobes. Ved at anvende 13 C- eller 15N-mærkede carbon- eller nitrogenkilder ville tillade os at følge carbon- og nitrogenkilder skeletter gennem store metaboliske kryds 45 <sup>, 46.

Vi har anvendt den beskrevne fremgangsmåde til at belyse ændringer i metabolit pools i S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47, og Enterococcus faecium 48, men fremgangsmåden kan anvendes på andre grampositive og gramnegative bakterier, herunder andre humane patogener let dyrket i laboratoriet. Faktisk kan integrere metabolomiske og transkriptom oplysninger afslører uventede sammenhænge mellem metabolisme og virulens, som kunne føre til nye strategier til behandling af infektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret delvist af en NIH Pathway til Independence Award (give GM 099.893) og fakultet startup midler til SRB samt et forskningsprojekt Grant (give GM 042.219). De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og fortolkning, eller beslutningen om at indsende arbejde til offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

Biokemi mikrobiologi bakteriel fysiologi metabolomics, Cody aminosyrer metabolitter virulens patogenese metabolisme massespektrometri væskekromatografi
En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter