Summary
Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.
Abstract
קולטני G-Protein-Coupled (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני טרנסממברנים, הממלאים תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה הסלולרית הרגילה ומהווים יעד פרמקולוגי חשוב לאינדיקציות מרובות, כולל כאבים, ויסות לחץ דם והטיפול במחלות פסיכיאטריות. עם ליגנד מחייב, GPCRs מזרז את ההפעלה של חלבונים G תאיים על ידי גירוי שילוב של trianosphate guanosine (GTP). G- חלבונים מופעלים מכן לעורר נתיבי איתות המעורר תגובות הסלולר. ניתן לפקח על איתות GPCR על-ידי מדידת שילוב של רדיופלאד ולא-הידרוליזה של GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), לתוך חלבונים G. שלא כמו שיטות אחרות המעריכות תהליכי איתות נוספים במורד הזרם, [ 35 S] מחייב GTPγS מודד אירוע פרוקסימלי בסימון GPCR, וחשוב מכך, ניתן להבחין בין agonisטס, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה וספציפית לחקר איתות GPCR תוך שימוש בהכנות ממברנות גולמיות של GPCR ארכיטיפי, הקולטן מסוג אופיואיד (MOR1). למרות גישות חלופיות לתאים ורקמות מופרדים קיימים, רבים הם עלות אוסרני, מייגע, ו / או דורשים ציוד מעבדה לא סטנדרטית. השיטה הנוכחית מספקת הליך פשוט המעשיר קרום גולמי תפקודי. לאחר בידוד MOR1, תכונות פרמקולוגיות שונות של אגוניסט, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -נקפאלין (DAMGO), ואנטגוניסט, naloxone, נקבעו.
Introduction
G-RPRs (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני שטח התא האחראים על מגוון מדהים של תהליכים פיזיולוגיים, כולל שיכוך כאבים, ריפוי והתנהגות 1 . GPCRs לפעול על ידי חישה אותות חיצוניים ספציפיים ולאחר מכן מגרה איתות תאיים. לכן הם מציינים צומת מפתח בין הסביבות החיצוניות והפנימיות של התא. בשל התפקיד הקריטי GPCRs לשחק בביולוגיה, הם הפכו מטרות מרכזיות הן במחקר בסיסי גילוי סמים 2 , 3 .
בניגוד למשפחות קולטן אחרות המחברות ליגנים נפרדים, GPCRs יכול לקשור סוגים שונים מאוד של מולקולות. בעוד אחד GPCR עשוי אינטראקציה עם פפטידים, אחר עשוי לחוש פוטונים, מולקולות קטנות, או יונים 1 , 4 . בעוד ligands שלהם הם מגוונים, GPCRs מאוחדים האדריכל הכולל שלהםUre ו פונקציה. GPCRs בודדים מורכבים של שבעה חלבונים טרנסממברניים α-הסליל עם מסופי אמינו תאיים מסופי carboxyl תאיים 5 , 6 . GPCRs מצמידים אל חלבונים G תאיים-קומפלקסים חלבונים הטרוטרימריים המורכבים α, β, ו γ יחידות משנה, אשר מתווך מסלולים איתות שונים 7 . G α יחידת משנה הוא חלבון נוקליאוטיד גוואנין מחייב כי הוא לא פעיל כאשר קשורה diphosphate guanosine (תוצר) ופעילה כאשר קשורה כדי triphosphate guanosine (GTP) 8 , 9 . כאשר GPCRs לאגד ligands שלהם, הם עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר G α לנתק מ G βγ , ובכך מאפשר G α להחליף התמ"ג עבור GTP 7 . הקולטן עצמו הוא phosphorylated במסוף carboxyl שלה על ידי serine / threon שוניםIne קינאזות 10 , 11 ו מופנם להפחתת קולטן איתות 12 , 13 , 14 . בינתיים, מופעל מונומר G α ו G βγ dimer להמשיך להפעיל נתיבי איתות שונים 7 . ישנם מספר איזופורמים של כל יחידת משנה של חלבונים, וכל איזופורם מכוון למסלולים במורד הזרם ובמערכות שליחים משניות. האיזופורמים העיקריים של G α כוללים G, G q , G / i , ו- G 12-13 . בדרך כלל, GPCRs בודדים מקשרים עם איזופורם G α מסוים , ובכך מקשרים גירוי חיצוני לתגובה תאית ספציפית 1 .
אפיון אינטראקציה GPCR-ligand הוא קריטי להבנת הביולוגיה של הקולטן. כמו התמ"ג / חילופי GTP הוא אחד הראשונים ערבNts כי בעקבות ליגנד מחייב, ניטור GTP מחייב יכול למדוד הפעלה GPCR או עיכוב. Assaying יותר אירועים במורד GPCR איתות הוא לעתים קרובות לא כמותי או stoichiometric, לא יכול להבחין אגוניסטים מלאים מחלקיקים, והוא יכול לדרוש ריאגנטים יקר. יתר על כן, הגדלת GTP מחייב חלבונים G α הוא אירוע כמעט אוניברסלי לאחר ההפעלה GPCR, כלומר מדידה GTP מחייב הוא assay ישים נרחב לניטור הפעילות של GPCRs ביותר. מדידת GTP מחייב היא גישה פשוטה ומהירה לפקח איתות GPCR בתאים overexpressing קולטן של עניין או רקמות הילידים. בפרוטוקול הנוכחי פרטים assay פונקציונלי GTP מחייב באמצעות GPCR ארכיטיפי, קולטן μ אופיואידים (MOR1), כדי לקבוע כמותית את הפעילות של אגוניסט אנטגוניסט על GPCR איתות.
פרוטוקול זה מתאר תחילה כיצד לבודד ממברנות גסות של תאים overexpressing MOR1. הערה thaלא פרוטוקול זה אינו מוגבל מערכות overexpression והוא יכול להיות מיושם על מקורות רבים של הממברנה, כולל רקמה מקומית או תכשירים המבטאים קולטנים מרובים חלבונים G 15 . לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד למדוד את הכריכה של אנלוגי GTP רדיואקטיבי לממברנות אלה בתגובה לריכוזים שונים של [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] - אנקפאלין (DAMGO) או נלוקסון, אגוניסט ואנטגוניסט MOR1, בהתאמה. האנלוגי של ה- GTP, [ 35 S] ganosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), הוא לא hydrolyzable. תכונה זו היא קריטית כי G α יחידות משנה התערוכה פעילות GTPase מהותי 7 יבטלו את הפוספט גמא שכותרתו על רדיואקטיבי GTP hydrolyzable. ממברנות נלכדים מכן על גבי מסנני סיבי זכוכית ושטף, לאחר מכן את gTP radiolabeled הוא לכמת על ידי ספירת הנוזל scintillation. הפרמטרים הפרמקולוגיים מרובים ניתן לגזור characterizE אינטראקציה קולטן ליגנד, כולל תגובה חצי מקסימלית (EC 50 ) ואת מקדם היל (n) עבור אגוניסטים ואת ריכוז מעכב מקסימלי חצי (IC 50 ) ו שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (K ב ) עבור אנטגוניסטים 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביטוי של רקומביננטי HA-MOR1 בתאים תרבותיים
הערה: בצע את כל פרוטוקולי תרבות התא בתא המנוע סטרילי זרימה למינרית.
- לעקר את תא התרבות למינרית זרימה למינרית עם אתנול 70% ולשמור על טכניקה סטרילית בכל תרבות התא.
- הכנת תאים כליים עובריים 293 (HEK293) תרבית תאים בינוני, שלם Dulbecco's שונה Eagle בינוני (DMEM): DMEM, pH 7.4, בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 10% בסרום שור עוברית (FBS ).
- צלחת 2.5 x 10 6 תאים HEK293 על גבי 10 ס"מ צלחת רקמה תרבות 10 מ"ל של DMEM מלאה ו דגירה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עד 70-80% confluency הוא הגיע (O / N).
הערה: כדי לאסוף מספיק חלבון לניסוי מלא GTP מחייב, צלחת לפחות 3 x 10 ס"מ צלחות של תאים. - Transfect התאים עם HA-MOR1 באמצעות מגיב transfection של בחירה על ידי ביצוע "; לדגור על 36-48 ח.
הערה: האדם MOR-1 cDNA (NCBI הפניה רצף: NM_000914.4) היה מתנה נדיבה של Gavril Pasternak ו היה משובטים לתוך pCMV-HA.
2. פיצול תאים אוסף ממברנה
- הכן את המאגרים תמוגה הבאה:
- מאגר 1: 10 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 7.4; 1 mM אתילן glycol-bis (β-aminoethyl אתר) -N, N, N ', N- tetraacetic חומצה (EGTA); סוכרוז 10%; קוקטייל מעכב פרוטאז; ו 1 mith dithiothreitol (DTT). מוסיפים את DTT טרי ביום הבידוד ממברנה.
- מאגר 2: 10 מ"מ HEPES, pH 7.4; 1 מ"מ EGTA; 1 מ"מ MgCl 2 ; ו 1 מ"מ DTT. מוסיפים את DTT טרי ביום הבידוד ממברנה.
- הסר את התאים transfected מן החממה (שלב 1.4), לשאוב את המדיום, ולשטוף את התאים עם 5 מ"ל של קר כקרח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). לשאוב את PBS ונוזל עודף מהצלחת.
- הוסף 600 μL של הצפת 1 לתאים. באמצעות מגרד תא, לעקור את התאים מן משטח צלחת פיפטה ההשעיה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.6 מ"ל.
- מיד הצמד להקפיא את הצינור microcentrifuge בחנקן נוזלי. לאחר דגימות קפואים, להפשיר את lysates על קרח או למקם אותם ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
- חזור על שלבים 2.3 ו -2.4 עם כל צלחות של תאים.
- לאחר lysates יש מופשר, להשתמש יחיד הדופק microogenizer צינור מיקרו כדי לשבור את התאים. הדופק homogenizer 3-5 פעמים במשך 10 שניות, הצבת צינור בחזרה על קרח במשך 30 שניות בין הפולסים.
- איסוף 20 μL כמו שבר התא כולו.
- צנטריפוגה המדגם הנותר במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C. לאסוף את supernatant במקום צינור חדש microcentrifuge 1.6 מ"ל על הקרח.
- Resuspend גלולה μL 100 של מאגר 1 ו rehomogenize עם העלי. דופק את ההומוגניזר 3-5 פעמים במשך 5 שניות, הצבת הצינור בחזרה על הקרח במשך 30 שניות בין הפולסים.
- צנטריפוגה המדגם בפעם השנייה במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C. שלב את supernatant עם supernatant משלב 2.7.
הערה: יתרת גלולה מכיל חלבונים גרעיניים וממברנה.
- צנטריפוגה המדגם בפעם השנייה במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C. שלב את supernatant עם supernatant משלב 2.7.
- צנטריפוגה supernatants בשילוב במשך 20 דקות ב XG 11,000 ו 4 ° C. להפריד את supernatant (החלק cytosolic) לתוך צינור חדש microcentrifuge 1.6 מ"ל.
- Resuspend גלולה μL 200 של המאגר 2. homogenize את גלולה על ידי triturating אותו 3-5 פעמים. צנטריפוגה המדגם במשך 20 דקות ב 21,100 xg ו 4 ° C. לשאוב את supernatant. Resuspend גלולה המכילה את שבר הממברנה הגולמי μL 50 של מאגר 2.
- מיד להמשיך את הניסויים GTPγS מחייב (סעיף 3) או הצמד להקפיא חנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס.
3. [ 35 S] GTPγS מחייב הערה: השתמש בפרוטוקול בטיחות רדיואקטיבי סטנדרטי בעת טיפול ב- [ 35 S] GTPγS וכאשר מניבים ניסויים מחייבים של [ 35 S] GTPγS. ללבוש כפפות מגן מעיל מעבדה בכל עת. בדוק את חומר האריזה עבור דליפות או סדקים. להשליך פסולת ריאגנטים עודפים על פי פרוטוקולים מוסדיים.
- הכן לא מחייב מחייב מאגר (IBB) על ידי ערבוב 50 מ"מ HEPES, pH 7.4; 5 מ"מ MgCl2; 100 מ"מ NaCl; ו 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים מזוקקים.
- דילול המניות [ 35 S] GTPγS ל 50 ננומטר ב 10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.6, ו 10 מ"מ DTT. הפוך 500 aliquots μL ולאחסן אותם -80 מעלות צלזיוס. השתמש רק aliquot טרי מופנם מיד לפני תחילת הניסוי. להפשיר את aliquots על הקרח.
- הכן nonpradio שכותרתו GTPγS על ידי המסת 1 מ"ג של אבקת GTPγS ב 177.62 μL של מים טהורים לריכוז מלאי של 10 מ"מ. הפוך 10-aliquots μL ולאחסן אותם-20 ° C.
- הכן חיץ מחייב שלם (CBB) על ידי השלמת IBB לכלול ריכוז סופי של 1 מ"מ DTT, 0.1% (wt / vol) אלבומין בסרום שור (BSA), 10 מיקרומטר התמ"ג, ו 0.1 nM [ 35 S] GTPγS.
הערה: ה- CBB מכיל כעת את ה- GTP של radiolabeled. נקוט אמצעי זהירות מתאימים תוך כדי עבודה עם פתרונות רדיואקטיביים. - להפשיר את שבר הממברנה משלב 2.11 על הקרח.
- לכמת את ריכוז החלבון של חלק הממברנה באמצעות assay חלבון Bradford באמצעות ספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר.
- הכן סדרה דילול של סטנדרטים BSA חלבון עם מאגר 2, בריכוז הסופי של 0, 250, 500, 750, 1,500, 2,500, ו - 5000 מיקרוגרם / מ"ל.
- הוסף 2 μL של כל תקן או קרום ל 1 מ"ל של מגיב Bradford ב קובט. מערבבים היטב על ידי vortexing.
- התאם את ספקטרופוטומטר לאורך גל של 595 ננומטר ריק באמצעות קובט עם 0 מיקרוגרם / מ"ל חלבון.
- המתן 5 דקות ו- rEad כל אחד הסטנדרטים ואת כל הדגימות באורך גל 595 ננומטר.
- מגרש את ספיגת הסטנדרטים לעומת הריכוז. באמצעות חוק באר למברט (ε = εcl, שם ε = מקדם הכחדה, l = אורך קובט, ו- c = ריכוז), לחשב את הריכוז של דגימות הממברנה.
- לדלל את שברים הממברנה לריכוז של 100 מיקרוגרם חלבון / מ"ל ב IBB.
הערה: צלחת אחת 10 ס"מ של HEK293 תאים בדרך כלל התשואות בין 1 & 3 מ"ג חלבון / מ"ל. - הכן את התנאים הניסוייים הבאים צינורות הפרט microcentrifuge 1.6 מ"ל: סדרת דילול ליגנד, מצב הפעילות הבסיסית כדי למדוד מחייב GTP הבסיסית, ואת תנאי מחייב לא ספציפית למדוד מחייבים GTP לא ספציפי.
- עבור סדרת דילול ליגנד, להכין סדרה דילול של ליגנד עניין בנפח סופי של 100 μL של CBB. הכן את סדרת ליגנד ב 2x הרצוי הסופי concentratiOns. שטח ריכוז ליגנד כדי לכסות כראוי מגוון של תגובות.
- כדי לבדוק את ההשפעה של DAMGO על GTP באמצעות MOR1, להכין דילולים DAMGO של 2 מ"מ, 200 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 200 ננומטר, 20 ננומטר, 2 ננומטר, 200 pM, 20 pM, ו 2 pM ב CBB נפח: 100 μL).
הערה: לדוגמה, אם ליגנד עניין יש ערך EC 50 צפוי של 10 מיקרומטר, להכין דילולים ליגנד של 200 ננומטר, 2 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, ו 2 מ"מ. אלה חמישה תנאים לכסות מגוון רחב של ריכוזים והם 2x את הריכוז הרצוי assay.
- כדי לבדוק את ההשפעה של DAMGO על GTP באמצעות MOR1, להכין דילולים DAMGO של 2 מ"מ, 200 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 200 ננומטר, 20 ננומטר, 2 ננומטר, 200 pM, 20 pM, ו 2 pM ב CBB נפח: 100 μL).
- עבור מחייב הבסיס, להכין צינור עם 100 μL של CBB בלבד.
- עבור מחייב ספציפי, להכין צינור עם 99 μL של CBB בתוספת 1 μL של 2 mM nonradio שכותרתו GTPγS.
- עבור סדרת דילול ליגנד, להכין סדרה דילול של ליגנד עניין בנפח סופי של 100 μL של CBB. הכן את סדרת ליגנד ב 2x הרצוי הסופי concentratiOns. שטח ריכוז ליגנד כדי לכסות כראוי מגוון של תגובות.
- הוסף 100 μL של פתרון ממברנה בדילול (שלב 3.7) על כל תנאי הניסוי.
- דגירה את הקרומים עם הניסוי השוניםתנאים ental ב 1.6 צינורות microcentrifuge מ"ל במשך 30 דקות על 25 מעלות צלזיוס thermomixer או על שייקר מסלולית.
4. סינון ממברנה
- הכן חיץ לשטוף על ידי שילוב של 50 מ"מ טריס HCl, pH 7.4; 5 מ"מ MgCl 2 ; ו 50 מ"מ NaCl במים מזוקקים.
- Presoak סיבי זכוכית מסננים במים במשך 10 דקות.
הערה: מסננים יש גודל הנקבוביות של 1 מיקרומטר, קוטר של 2.1 ס"מ, ועובי של 675 מיקרומטר. - הסר את דגימות מן thermomixer או שייקר מסלולית (שלב 3.10). בקצרה הדופק ספין דגימות עבור 5 ים לאסוף כל מדגם בתחתית הצינור.
- הסר את המכסה של מנגנון סינון ואקום. הנח את מסננים presoaked על יציאות ואקום של המנגנון. Re- לאבטח את המכסה המנגנון כדי ליצור חותמת ואקום. הפעל את הוואקום.
- פיפטה 195 μL של כל 200 מצב ניסיוני μL על גבי מסננים כדי למזער את השגיאה מן ספיחה על הקירות של הצינור ו / או מ pipetטינג.
- שטפו את המסננים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח.
5. ספירת נוזלים נוזלית
- מקום 5 מ"ל scintillation ספירת בקבוקונים במעמד ספירה. הוסף 5 מ"ל של נוזל נצנץ לכל בקבוקון.
- כבה את הוואקום (שלב 4.4). הסר את המכסה של מנגנון סינון ואקום. באמצעות פינצטה, להרים את המסננים מן יציאות ואקום של מנגנון סינון ולשחרר כל מסנן לתוך בקבוק 5 מ"ל scintillation הפרט.
- הכנת בקבוקון אחד עם μL 195 של CBB כדי לקבוע את האות המקסימלי.
- מכסה כל בקבוקון מאובטח. דגירה את בקבוקונים על שייקר מסלולית ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הפעל את הדלפק נצנץ. תכננו את מונה הדגימה למדידה של פליטת איזוטופ S 35 למשך 5 דקות לכל מדגם באמצעות תוכנית scintillation המקובלת.
- לחץ על "התחל" כדי לספור.
- כאשר הספירה נעשה, להשליך את הבקבוק נספרפסולת מסוכנת.
6. ניתוח נתונים
- הזן את הנתונים לתוך נתונים סטטיסטיים וניתוח תוכנה.
- הפחת את הלא ספציפית מחייב מכל אחת המדידות האחרות כדי לקבוע את מחייב ספציפי.
הערה: מידת החיבור לא ספציפי נקבעת על ידי המדגם מודגרות עם gTPγS non-radiolabeled (שלב 3.8.3). - פתח את הנתונים הסטטיסטיים וניתוח התוכנה ובחר ערך נתונים של XY.
- הזן את הנתונים המחייבים הספציפיים מתוך הניסויים המחוברים ל- [ 35 S] GTPγS לטבלת נתונים בתוכנת הסטטיסטיקה והניתוח. הזן את ריכוז אגוניסט, כמו ריכוזי טוחנת, בעמודה "X". הזן את הספירות 35 S המשויכות כערכים "Y".
- הפחת את הלא ספציפית מחייב מכל אחת המדידות האחרות כדי לקבוע את מחייב ספציפי.
- לשנות את הנתונים.
- המר את ערכי ה- X ללוגריתם המתאים על ידי לחיצה על "ניתוח". בחר "המרה" מן המובנה iN מנתח.
- בתוך תיבת הדו שיח "המרה", בחר "המרה X ערכים באמצעות" ובחר את הפונקציה "X = log (X)". בחר ליצור תרשים חדש של התוצאות.
- לחץ על "אישור".
- מנרמל את ערכי Y.
- עם התוצאות המוצגות המוצגות, לחץ על "ניתוח". בחר "מנרמל" מ המובנית מנתח.
- בתיבת הדו-שיח "נרמל", בחר בלחצן הבחירה כדי להגדיר 0% כ"ערך הקטן ביותר בכל קבוצת נתונים "ו- 100% כ"ערך הגדול ביותר בכל קבוצת נתונים". בחר את התיבה כדי להציג את התוצאות כאחוזים. בחר את התיבה כדי ליצור תרשים חדש של התוצאות.
- לחץ על "אישור".
- להתאים עקומות רגרסיה לא ליניארית לנתונים זממו. בצע ניתוח רגרסיה לא לינארית.
- עם התוצאות מנורמל מוצג, לחץ על "ניתוח". מן המובנה מנתח, בחר "רגרסיה לא לינארית (התאמה עקומת)."
- אם חוקר אגוניסט, בחר "התחבר (אגוניסט) לעומת תגובה מנורמל - משתנה משתנה" מתיבת הדו שיח.
- אם חוקרים אנטגוניסט, "בחר יומן (אנטגוניסט) לעומת תגובה מנורמל - משתנה משתנה" מתיבת הדו שיח.
- לחץ על "אישור".
- עיין בתרשים ובתוצאות כדי לוודא שההתאמה והנתונים נמצאים בהסכמה סבירה. ודא כי רגרסיה תואמת את התבנית הכללית של נתונים זממו וכי שאריות הם לא כל כך גדול שהם להבהיר את עקומת המינון התגובה שטוח.
הערה: התוכנה תסכם את תוצאות הרגרסיה הלא לינארית ותפרט את הריכוז שמקבל את התגובה החצי-מקסימלית (EC 50 ), מקדם היל (n) ואת הריכוז המעכב למחצית המקסימלית (IC 50 ). - נגזרות אגוניסט / אנטגוניסט פרמטר עוצמה.
- נגזר את אגוניסט שווהElibrium דיסוציאציה קבועים (K ב ) מכל אחד מהניסויים הבאים 16 , 17 , 18
- להעריך את השינוי במינון התגובה של אגוניסט בתחרות עם ריכוז קבוע של היריב. כאן, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / אנטגוניסט Kb ), כאשר EC 50 ' הוא EC-shift ימינה 50 .
- הערכת [ 35 S] GTPγS מחייב עם ריכוזים שונים של היריב בתחרות עם ריכוז קבוע של אגוניסט. הנה, K b = IC 50 / (2 + [אגוניסט] / אגוניסט EC 50 ) n 1 / n - 1, כאשר n הוא מקדם היל של אגוניסט.
- נגזר את אגוניסט שווהElibrium דיסוציאציה קבועים (K ב ) מכל אחד מהניסויים הבאים 16 , 17 , 18
- בהתאם לשונות של הנתונים, לחזור על הניסוי (שלבים 3.8-5.6) עבור כל ליגנד כ 3-5 פעמים וממוצע את התוצאות באמצעות סטטיסטיקה וניתוח softwהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיצול תאים ניתן להשתמש כדי לבודד ולהעשיר הקשורים חלבונים הקשורים חלבונים cytosolic ו גרעיני. איור 1 הוא כתם המערבי המדגים את התוכן של שלושת השברים העיקריים שניתן לאסוף במהלך תהליך החלוקה התת-תאית. באופן ספציפי, איור 1 מראה כי חלוקה נקייה מפריד חלבונים ממברנה ( כלומר Na + / K + ATPase, חלבון דיסולפיד איזומראז (PDI), ו HA-MOR1) מ היסטון H2B ו glyceraldehyde 3-פוספט dehydrogenase (GAPDH), חלבונים גרעיניים, ו cytosolic חלבונים, בהתאמה. בנוסף, איור 1 מדגים את העשרה של חלבונים (נתיב 1 לעומת נתיב 4) בשברים התת-תאיים שלהם בהתאמה של שבירה. כתם Ponceau נציג מדגים טוען חלבון שווה בכל חלק. חשוב לציין כי פרקטיקה זופרוטוקול onation אינו מבחין בין ממברנות סלולריות שונות. PDI הוא מקומי בדרך כלל כדי reticulum endoplasmic (ER), ואילו Na + / K + ATPase הוא בעיקר על קרום פלזמה. עם זאת, שני החלבונים נמצאים חלק הסופי קרום הגולמי ( איור 1 , מסלול 4). בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מפריד בחוזקה חלבונים גרעיניים מן השבר cytosolic ו הסופי הממברנה ( איור 1 , נתיבים 2-4), החלק מועשר חלבונים גרעיניים מכיל כמה חלבונים ממברנה ( איור 1 , נתיב 2), אולי מן ER.
ניתן להפיק פרמטרים פרמקולוגיים מרובים כדי לאפיין אינטראקציה של GPCR-ligand באמצעות ניסויים המחייבים GTP ( טבלה 1 ). לדוגמה, התגובה חצי מקסימלית (EC 50 ) ואת מקדם היל (n) של אגוניסט ניתן לגזור על ידי ניטור GTP מחייב בבתגובה למינונים שונים של אגוניסט. איור 3A ממחיש מינון תגובה GTP ל- MOR1 לאחר טיפול DAMGO. כאשר הנתונים מתאימים לרגרסיה לא ליניארית של ארבעה פרמטרים, ההתאמה מתארת אינטראקציה עם קולטן-ליגנד עם EC 50 של 185 ± 23 ננומטר ומקדם היל של 0.46 ± 0.06. עקומת ה- GTP- רדוד רדודה לאחר הטיפול DAMGO מציע שיתוף פעולה שלילי בין DAMGO ו MOR1. שיטה זו יכולה גם לזהות ולתאר את הפרמקולוגיה של אנטגוניסט. כמו איור 3A ו- B ממחישה, naloxone הוא אנטגוניסט MOR1. העוצמה אגוניסט (K ב ) של naloxone, 97 ± 20 ננומטר, נקבע על ידי שינוי הריכוז של naloxone בתחרות עם ריכוז קבוע של DAMGO ( איור 3 א ). Naloxone הציג מקדם היל של 0.88 ± 0.06, דבר המצביע על קשר עצמאי בין naloxone ו- MOR1. אם acTion של ליגנד אינו ידוע, assay זה יכול להפלות בין אגוניסט, אנטגוניסט, אגוניסט הפוכה. אם ליגנד הוא אגוניסט, לא תהיה עלייה GTP מחייב, כמו באיור 3A , בעקבות יישום DAMGO. אם הליגנד הוא אגוניסט הפוכה, יהיה מחסור מופחת של GTP ביחס לכריכה בסיסית. אם הליגנד הוא אנטגוניסט, לא תהיה השפעה על הטיפול עם ליגנד לבד. אם מיושמים יחד עם אגוניסט, אנטגוניסט היה לעכב את היכולת של אגוניסט כדי לעורר GTP מחייב. איור 3 א ממחיש את פעילות היריב של naloxone נגד אגוניסט DAMGO.
איור 1: הפיצול הסלולרי מפריד בין ממברנה הקשורים, חלבונים גרעיניים, ו cytosolic. ( למעלה ) ליין 1 מייצג אתחלבון נוכח בתא כולו. נתיב 2 מכיל חלבונים גרעיניים וקשורים הקשורים במפרקים המופרדים במהלך שלבי הצנטריפוגה הראשונים. ליין 3 הוא חלק cytosolic מופרדים לאחר 20 דקות של צנטריפוגה ב 11,000 x גרם. ליין 4 מכיל שבר קרום גולמי מתאים לניסויים מחייבים של [ 35 S] GTPγS. ( תחתית ) כתם פונצ'ו של קרום מערבי מדגים טעינת חלבון עבור כל שבר סלולרי. נוגדנים הבאים היו בשימוש עבור immunoblotting: עכבר anti-Na + / K + -ATPase (1: 1000), עכבר נגד GAPDH (1: 5,000), עכבר נגד H2B (1: 2,500), ארנב נגד PDI (1 : 1,000), חולדה נגד HA (1: 2000). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תרשים זרימה מתאר את הפיצול ו [ 35 S] GTPγS מחייב נוהל. ראשית, transfect התאים להביע את GPCR של עניין. לאחר 48 שעות, הקציר לשבור את התאים לבודד את הקולטן (אדום) הקשורים G- חלבונים (ירוק = G α , סגול = G β , וכתום = G γ ). כדי לבצע ניסויים מחייב GTP, להוסיף [ 35 S] GTPγS ו דגירה של ממברנות עם ליגנד של עניין. כדי למדוד את פעילות החלבון, לקשור את הממברנות למסנן כדי לשטוף כל רדיוכימיים מאוגדים ולאחר מכן לכמת את [ 35 S] GTPγS מחויב על ידי ספירת הנוזל scintillation. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אגוניזם אNd אנטגוניזם על קולטנים μ-opioid שהוגדרו על ידי [ 35 S] GTPγS מחייב. ( A ) [ 35 S] GTPγS מינון התגובה עקומת כדי DAMGO לבד (כחול) או naloxone בתחרות עם 2.5 מיקרומטר DAMGO (ירוק). [ 35 S] GTPγS מחייב מנורמל לגירוי מקסימלי בכל ניסוי והובעה כאחוז. הנקודות המוצגות הן ממוצע של קביעות בשלושה עותקים, והן מתבטאות כממוצע SEM ( B ) אנטגוניזם של DAMGO מגורה [ 35 S] GTPγS מחייב ידי naloxone. [ 35 S] GTPγS מחייב היה לכמת לאחר תוספת של naloxone לבד (100 מיקרומטר), DAMGO לבד (10 מיקרומטר), או DAMGO (10 מיקרומטר) בתחרות עם naloxone (100 מיקרומטר). התוצאות מתבטאות כמו ממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ עליוRe כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ליגנד | EC 50 או IC 50 (nM) | N ח | K b (nM) |
| דמגו | 185 ± 23 | 0.46 ± 0.06 | |
| נלוקסון | 420 ± 87 | 0.88 ± 0.06 | 97 ± 20 |
טבלה 1: פרמטרים פרמקולוגיים של פעילות DAMGO ו- Naloxone במולקולות μ-opioid. התגובה למחצה מקסימלית (EC 50 ) ומקדם הגבעה (n) עבור DAMGO נגזרו מחייב [ 35 S] GTPγS בתגובה למינונים שונים של DAMGO. ריכוז מעכב מקסימלי למחצה(IC 50 ) ו שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (K ב ) עבור naloxone נקבעו מהשפעת התחרות בין naloxone ו 2.5 מיקרומטר DAMGO על [ 35 S] GTPγS מחייב. התוצאות מתבטאות כמו ממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות נפרדות אך משלימות: גישה פשוטה לתאים ורקמות מפוצלות לתאים רחבים אך ברורים ואמצעי לחקור את אותות GPCR על ידי מדידת [ 35 S] GTPγS מחייב.
חלוקה תאית יעילה יש מגוון רחב של יישומים, החל מיצוי והעשרה של חלבונים, כדי להעריך את לוקליזציה תת מחלקה של חלבונים, לחקר פרמקולוגיה קולטן. למרות גישות חלופיות לתאים ורקמות מופרדים, הפרוטוקול המוצג כאן הוא יחסית זול יותר, מהיר יותר, ופשוט יותר. שלא כמו שיטות מבוססות יותר, עם זאת, שיטה זו אינה מסוגלת לנקות באופן ברור חלבונים הקשורים קרום פלזמה מחלקים קרום אחרים, כגון אנדוסומים או ER. כמו כן יש לציין כי בעוד פרוטוקול לעיל משתמש במערכת overexpression חולף לייצר קרום התא המכיל את GPCR שלריבית, פרוטוקול זה תואם מערכות overexpression יציבה, כמו גם עם רקמה חיה או אנושית 19 .
הכנת המדגם הוא קריטי כדי למקסם את התשואה חלק טוהר. זה חשוב במיוחד כדי להבטיח homogenization מלאה כדי למזער את זמני המעבר בין הצעדים צנטריפוגה. באמצעות גלולה homogenizer / העלי לחלוטין לשבש את קרום התא מגדיל באופן משמעותי את התשואה קרום הגולמי בשבר התא הסופי. אם התשואה קרום נמוך מדי, את שתי הפתרונות הפשוטים ביותר יהיה להגביר את התרבות התא הראשונית ו / או homogenize תא גלולה עוד כמה פעמים. אם שברים בודדים להראות רמה גבוהה של טומאה, להפחית את זמני המעבר בין צנטריפוגה והפרדה. אל תאפשר דגימות לשבת בעקבות צנטריפוגה, כמו חלבונים עשויים לפזר לתוך המדגם ולהקטין טוהר חלק.
מבוסס על סינון [ 35 S] GTPγS מחייב הוא שיטה מהירה וכמותית למדוד את ההפעלה של חלבונים G באמצעות קולטן הקשורים. מדידת GTP מחייבת מאפשר מדידה כמותית יותר של פעילות GPCR מאשר בדרך כלל אפשרי כאשר ניטור תהליכי downstream. עם זאת, ישנן שתי מגבלות קריטיות על השיטה המתוארת כאן. והכי חשוב, סינון מבוסס [ 35 S] GTPγS quantitation אינו ריאלי באותה מידה עם כל G α isoforms 20 , 21 . באופן כללי, שיטה זו מוגבלת ל- G i / o -cplpled GPCRs כמו MOR1 22 . G - ו - G - קולטנים מצולמים נוטים להיות פחות רגישים. זה כנראה בגלל השילוב של השפע הנמוך של G s / G Q ו איטית יחסית שלהם נוקליאוטידים שער החליפין, מה שהופך אותו קשה להבחין אמיתי [ 35 S] GTPγS מחייב מעל הרקע. הגבלה זו כבר התייחס אל שימוש ב- G- חלבון נוגדנים ללכוד טכניקות 20 . קבוצות מסוימות מצאו כי ביטול התוצר מהתגובה משפר את יחס אות לרעש עבור קולטנים מצולמים של G - G או G - 23 . המגבלה השנייה היא רגישות הממברנה לאגוניסטים lipophilic או פעילי שטח. [ 35 S] מבחני GTPγS דורשים קולטן תפקודי קולטן G- קומפלקסים, והוספת של מולקולות lipophilic למערכת התגובה עשוי לשבש את המבנה של הממברנות או אלה מתחמי. אם זה חשש פוטנציאלי, זה עשוי להיות יתרון לבדוק אם מגיב של עניין משבש [ 35 S] GTPγS מחייב במערכת כבר מאופיינת היטב, כגון בגירוי MAM1 בתיווך DAMGO. תנאים אחרים לשקול אופטימיזציה כוללים את מחייב pH חיץ, הריכוזים של MG 2 + ו NaCl, ריכוז החלבון, ואת זמן הדגירה 23 ,Ef "> 24.
פרוטוקול זה התמקד GPCR מאופיין היטב, MOR1, וכן מאופיין היטב סמים, DAMGO (אגוניסט) ו naloxone (אנטגוניסט), הפועלים על MOR1. עם זאת, אחד היתרונות של טכניקה זו היא כי ניתן להשתמש בו כדי לאפיין ligands ידוע כמו אגוניסטים, אנטגוניסטים, או אגוניסטים הפוכה, תלוי איך ליגנד מודולציה GTP מחייב. בעת תכנון ניסויים, חשוב להשתמש בטווח של ריכוזים של ליגנד של עניין להיות מודעים לטווח של תוצאות: אגוניסטים יגרום לעלייה GTP מחייב על בסיס, אגוניסטים הפוכה יגרום ירידה GTP מחייב לעומת הבסיס, ואת היריבים יהיה מעט ללא השפעה כאשר הוסיף בבידוד על ההתחברות GTP הבסיסית.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר טכניקה לביצוע חלוקה תת-תאית, איסוף תכשירים מממברנה גולמיים, ובדיקת פעילות GPCR על-ידי מדידת [ 35 S] Gכבלי TPγS. טכניקות אלה יכולים להיות מותאמים בקלות למגוון של תרבות תאים ורקמות מודלים ללמוד את הפרמקולוגיה של אחת המשפחות החשובות ביותר של קולטנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DA-000266 ואת תוכנית מדען רפואי T32 מענק (קורות חיים, NWZ, ו- PCS). המחברים היו רוצים גם להודות somersault18: 24 (somersault1824.com) עבור הספרייה המדעית & איורים רפואיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
