Summary
Guanosintrifosfat (GTP) -bindning är en av de tidigaste händelserna vid aktivering av G-proteinkopplad receptor (GPCR). Detta protokoll beskriver hur man farmakologiskt karakteriserar specifika GPCR-ligand-interaktioner genom att övervaka bindningen av den radiomärkta GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS), i Svar på en ligand av intresse.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är en stor familj av transmembranreceptorer som spelar kritiska roller i normal cellulär fysiologi och utgör ett viktigt farmakologiskt mål för flera indikationer, inklusive analgesi, blodtrycksreglering och behandling av psykisk sjukdom. Vid ligandbindning katalyserar GPCR: er aktiveringen av intracellulära G-proteiner genom att stimulera införlivandet av guanosintrifosfat (GTP). Aktiverade G-proteiner stimulerar sedan signaleringsvägar som framkallar cellulära reaktioner. GPCR-signalering kan övervakas genom att mäta inkorporeringen av en radiomärkt och icke-hydrolyserbar form av GTP, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS) i G-proteiner. Till skillnad från andra metoder som bedömer mer nedströms signaleringsprocesser, mäter [35S] GTPγS-bindning en proximal händelse vid GPCR-signalering och, viktigare, kan skilja agonisTs, antagonister och inversa agonister. Det föreliggande protokollet beskriver en känslig och specifik metod för att studera GPCR-signalering med användning av råmembranpreparat av en archetypal GPCR, μ-opioidreceptorn (MOR1). Även om alternativa metoder för fraktionering av celler och vävnader finns, är många kostnadseffektiva, tråkiga och / eller kräver icke-standard laboratorieutrustning. Föreliggande metod ger en enkel procedur som berikar funktionella råmembran. Efter isolering av MOR1 bestämdes olika farmakologiska egenskaper hos dess agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) och antagonist, naloxon.
Introduction
G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) är en stor familj av cell-ytreceptorer som är ansvariga för en anmärkningsvärd mängd fysiologiska processer, inklusive analgesi, olfaction och beteende 1 . GPCRs agerar genom att avkänna specifika externa signaler och därefter stimulera intracellulär signalering. De markerar därför en nyckelkorsning mellan en extern och intern miljö. På grund av den viktiga rollen som GPCR spelar i biologi, har de blivit stora mål för både grundforskning och läkemedelsupptäckt 2 , 3 .
Till skillnad från andra receptorfamiljer som binder diskreta ligander kan GPCRs binda mycket olika typer av molekyler. Medan en GPCR kan interagera med peptider kan en annan känna av fotoner, små molekyler eller joner 1 , 4 . Medan deras ligander är olika, är GPCRs förenade i sin övergripande arkitektUre och funktion. Individuella GPCRs består av sju a-spiralformiga transmembranproteiner med extracellulära aminoterminaler och intracellulära karboxylterminaler 5 , 6 . GPCRs är kopplade till intracellulära G-proteiner-heterotrimera proteinkomplex som är sammansatta av a-, p- och y-underenheter-som medierar diverse signalvägar 7 . G a -subenheten är ett guaninukleotidbindande protein som är inaktivt när det är bunden till guanosindifosfat (BNP) och aktivt när det är bunden till guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . När GPCR: er binder sina ligander genomgår de en konformationsförändring som tillåter G a att dissociera från G ^ , så att G a kan utbyta BNP för GTP 7 . Receptorn i sig fosforyleras vid sin karboxylterminal av olika serin / treonIni-kinaser 10 , 11 och internaliserades för att dämpa receptorsignalering 12 , 13 , 14 . Under tiden fortsätter den aktiverade G a - monomeren och G- β- dimeren för att aktivera separata signalvägar 7 . Det finns flera isoformer av varje G-protein-subenhet, och varje isoform riktar sig till specifika nedströmsvägar och sekundära budbärarsystem. De huvudsakliga G a- isoformerna inkluderar G s , G q , G i / o och G 12-13 . Typiskt associerar individuella GPCRs med en särskild G a- isoform, varigenom en extern stimulans kopplas till ett specifikt cellulärt svar 1 .
Att karakterisera en GPCR-ligandinteraktion är kritisk för att förstå receptorens biologi. Som BNP / GTP-utbyte är en av de tidigaste kvällarnaNts som följer ligandbindning, övervakning av GTP-bindning kan mäta GPCR-aktivering eller inhibering. Att analysera mer nedströms händelser i GPCR-signaleringen är ofta inte lika kvantitativ eller stökiometrisk, får inte särskilja fullständiga agonister från partiella sådana och kan kräva dyra reagenser. Dessutom är ökad GTP-bindning till G a -proteiner en nästan universell händelse efter GPCR-aktivering, vilket innebär att mätning av GTP-bindning är en brett tillämplig analys för att övervaka aktiviteten hos de flesta GPCR. Mätning av GTP-bindning är ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för att övervaka GPCR-signalering i celler som överuttrycker receptor av intresse eller i nativ vävnad. Föreliggande protokoll beskriver en funktionell GTP-bindningsanalys med användning av en archetypal GPCR, μ-opioidreceptorn (MOR1) för att kvantitativt bestämma aktiviteten hos en agonist och antagonist vid GPCR-signalering.
Detta protokoll beskriver först hur man isolerar råmembran från celler som överuttrycker MOR1. Notera det härT detta protokoll är inte begränsat till överexpressionssystem och kan appliceras på många källor av membran, inklusive nativ vävnad eller preparat som uttrycker multipla receptorer och G-proteiner 15 . Protokollet beskriver sedan hur man mäter bindningen av en radioaktiv GTP-analog till dessa membraner som svar på varierande koncentrationer av [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) eller naloxon, en MOR1-agonist och antagonist, respektive. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS) är icke hydrolyserbar. Denna egenskap är kritisk eftersom G a- subenheter uppvisar inneboende GTPasaktivitet 7 och skulle eliminera det märkta gammafosfatet på en hydrolyserbar GTP-radiokemisk. Membranerna fångas sedan på glasfiberfiltren och tvättas, varpå den radiomärkta GTP kvantifieras genom vätskescintillationsräkning. Multipla farmakologiska parametrar kan härledas till karakteriseringE-receptor-ligandinteraktionen, innefattande det halvmaximala svaret (EC50) och Hill-koefficienten (nH) för agonister och den halva maximal inhiberande koncentrationen (IC50) och jämviktsdissociationskonstanten (Kb) för antagonister 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uttryck av rekombinant HA-MOR1 i odlade celler
OBS: Följ alla cellkulturprotokoll i ett sterilt laminärt flödeskåp.
- Sterilisera cellkulturens laminära flödeshuvud med 70% etanol och upprätthålla steril teknik genom cellkulturen.
- Preparera humant embryonala njurceller 293 (HEK293) cellodlingsmedium, komplett Dulbecco-modifierat örnmedium (DMEM): DMEM, pH 7,4, kompletterat med 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin och 10% fetalt bovint serum (FBS ).
- Platt 2,5 x 10 6 HEK293-celler på en 10 cm vävnadsodlingsplatta i 10 ml fullständig DMEM och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 tills 70-80% konfluens uppnås (O / N).
OBS! För att samla tillräckligt med protein för ett komplett GTP-bindande experiment, plåta minst 3 x 10 cm plattor av celler. - Transfektera cellerna med HA-MOR1 med användning av ett lämpligt transfektionsreagens och genom att följa tillverkarens "S riktlinjer. Inkubera i 36-48 h.
OBS: Human MOR-1-cDNA (NCBI-referenssekvens: NM_000914.4) var en generös present från Gavril Pasternak och klonades i pCMV-HA.
2. Cellfraktionering och membransamling
- Förbered följande lysbuffertar:
- Buffert 1: 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), pH 7,4; 1 mM etylenglykol-bis (P-aminoetyleter) -N, N, N ', N'-tetraättiksyra (EGTA); 10% sackaros; Proteasinhibitor cocktail; Och 1 mM ditiotreitol (DTT). Lägg till DTT-färskt på dagen för membranisolering.
- Buffert 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; Och 1 mM DTT. Lägg till DTT-färskt på dagen för membranisolering.
- Ta bort de transfekterade cellerna från inkubatorn (steg 1.4), aspirera mediet och skölj cellerna med 5 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Aspirera PBS och överskottsvätska fråntallriken.
- Tillsätt 600 μl buffert 1 till cellerna. Använd en cellskrapa, lossa cellerna från plattytan och pipettera cellens suspension i ett 1,6 ml mikrocentrifugrör.
- Snabbfrys mikrocentrifugröret i flytande kväve omedelbart. När proven är frysta, tina lysaten på is eller placera dem vid -80 ° C för långtidsförvaring.
- Upprepa steg 2.3 och 2.4 med alla plattor av celler.
- När lysaten har tinas, använd en enpuls mikro-rörhomogenisator för att bryta upp cellerna. Pulsa homogenisatorn 3-5 gånger i 10 s, placera röret tillbaka på is under 30 s mellan pulser.
- Samla 20 μL som helcellsfraktion.
- Centrifugera det återstående provet i 10 minuter vid 1000 xg och 4 ° C. Samla supernatanten och placera i ett nytt 1,6 ml mikrocentrifugrör på is.
- Resuspendera pelleten i 100 pi buffert 1 och rehomogenisera med en pestle. Pulsa homoGenizer 3-5 gånger i 5 s, placera röret tillbaka på is i 30 s mellan pulser.
- Centrifugera provet en andra gång i 10 minuter vid 1000 xg och 4 ° C. Kombinera supernatanten med supernatanten från steg 2.7.
OBS: Den återstående pelleten innehåller kärn- och membranproteiner.
- Centrifugera provet en andra gång i 10 minuter vid 1000 xg och 4 ° C. Kombinera supernatanten med supernatanten från steg 2.7.
- Centrifugera de kombinerade supernatanterna under 20 minuter vid 11 000 xg och 4 ° C. Separera supernatanten (den cytosoliska fraktionen) till ett nytt 1,6 ml mikrocentrifugrör.
- Resuspendera pelleten i 200 pl buffert 2. Homogenisera pelleten genom att triturera den 3-5 gånger. Centrifugera provet i 20 min vid 21 100 xg och 4 ° C. Aspirera supernatanten. Resuspendera pelleten innehållande den råa membranfraktionen i 50 | il buffert 2.
- Gå genast till GTPγS-bindningsexperimenten (avsnitt 3) eller snäppfrys i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.
3. [35S] GTPyS-bindning ANMÄRKNING: Använd standard radiokemisk säkerhetsprotokoll vid hantering av [ 35 S] GTPγS och vid framställning av [35S] GTPγS bindningsförsök. Använd skyddshandskar och en lab coat alltid. Kontrollera förpackningsmaterialet för läckage eller sprickor. Kassera avfall och överskott av reagens enligt institutionella protokoll.
- Beredda ofullständig bindningsbuffert (IBB) genom att blanda 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; Och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i destillerat vatten.
- Späd lager [ 35 S] GTPγS till 50 nM i 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 och 10 mM DTT. Gör 500 μl alikvoter och förvara dem vid -80 ° C. Använd endast en ny tinad alikvot omedelbart innan experimentet påbörjas. Tina alikvoterna på is.
- Förbered icke-radiomärkt GTPγS genom att lösa 1 mg GTPyS-pulver i 177,62 μl rent vatten för en stamkoncentration av 10 mM. Gör 10 μl alikvoter och lagra dem på-20 ° C.
- Förbered fullständig bindningsbuffert (CBB) genom att komplettera IBB för att inkludera en slutlig koncentration av 1 mM DTT, 0,1% (vikt / vol) bovint serumalbumin (BSA), 10 | im BN och 0,1 nM [35S] GTPyS.
OBS! CBB innehåller nu radiomärkt GTP. Vidta lämpliga säkerhetsåtgärder vid arbete med radioaktiva lösningar. - Tina membranfraktionen från steg 2.11 på is.
- Kvantifiera proteinkoncentrationen av membranfraktionen via en Bradford-proteinanalys med användning av en spektrofotometer vid 595 nm.
- Bered en utspädningsserie av BSA-proteinstandarder med buffert 2 vid slutliga koncentrationer av O, 250, 500, 750, 1500, 2500 och 5000 μg / ml.
- Tillsätt 2 μl av varje standard eller membran till 1 ml Bradford reagens i en kyvett. Blanda noggrant genom virvelbildning.
- Justera spektrofotometern till en våglängd av 595 nm och blank med användning av kyvetten med 0 | ig / ml protein.
- Vänta 5 min och rEad var och en av standarderna och var och en av proverna vid en 595 nm våglängd.
- Plot absorbans av standarderna kontra koncentrationen. Med hjälp av Beer-Lambert Law (A = εcl, där ε = extinktionskoefficient, l = kyvettens längd och c = koncentration), beräkna koncentrationen av membranproverna.
- Späd membranfraktionerna till en koncentration av 100 μg protein / ml i IBB.
OBS! En 10 cm maträtt av HEK293-celler ger normalt mellan 1 och 3 mg protein / ml. - Förbered följande experimentella förhållanden i individuella 1,6 ml mikrocentrifugrör: en ligandutspädningsserie, ett basalt aktivitetsförhållande för att mäta basal GTP-bindning och ett icke-specifikt bindningsförhållande för att mäta ospecifik GTP-bindning.
- För ligandutspädningsserien, bereda en utspädningsserie av liganden av intresse i en slutlig volym av 100 | il CBB. Förbered ligandserien vid 2x önskad slutkoncentrationons. Rymma ligandkoncentrationerna för att täcka ett antal svar på ett adekvat sätt.
- För att analysera effekten av DAMGO på GTP-bindning via MOR1, bereda DAMGO-spädningar av 2 mM, 200 | iM, 20 | iM, 2 | iM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM och 2 pM i CBB Volym: 100 | il).
OBS! Om exempelvis liganden av intresse har ett förväntat EC50-värde av 10 | jM, förbereda ligandutspädningar av 200 nM, 2 | iM, 20 | iM, 200 | iM och 2 mM. Dessa fem betingelser täcker ett brett spektrum av koncentrationer och är 2x den koncentration som är önskvärd för analysen.
- För att analysera effekten av DAMGO på GTP-bindning via MOR1, bereda DAMGO-spädningar av 2 mM, 200 | iM, 20 | iM, 2 | iM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM och 2 pM i CBB Volym: 100 | il).
- För basal bindning, beredda ett rör med endast 100 μl CBB.
- För icke-specifik bindning, förbered ett rör med 99 pl CBB kompletterat med 1 jil 2 mM icke-radiomärkt GTPyS.
- För ligandutspädningsserien, bereda en utspädningsserie av liganden av intresse i en slutlig volym av 100 | il CBB. Förbered ligandserien vid 2x önskad slutkoncentrationons. Rymma ligandkoncentrationerna för att täcka ett antal svar på ett adekvat sätt.
- Tillsätt 100 μl av den utspädda membranlösningen (steg 3.7) till varje försöksförhållande.
- Inkubera membranen med de olika experimentenEntalbetingelser i 1,6 ml mikrocentrifugrör i 30 minuter vid 25 ° C i en termomixer eller på en orbitalskakare.
4. Membranfiltrering
- Förbered tvättbuffert genom att kombinera 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2; Och 50 mM NaCl i destillerat vatten.
- Förbered glasfiberfiltren i vatten i 10 minuter.
OBS: Filter har en porstorlek på 1 μm, en diameter av 2,1 cm och en tjocklek av 675 μm. - Ta bort proverna från termomixeren eller kretslocket (steg 3.10). Puls-centrifugera provet i 5 sekunder för att samla varje prov i botten av röret.
- Ta bort locket i vakuumfiltreringsapparaten. Lägg de förbehandlade filtren på apparatens vakuumportar. Sätt tillbaka locket för att bilda en vakuumtätning. Sätt på vakuumet.
- Pipettera 195 μl av varje 200 μL experimentellt tillstånd på filter för att minimera felet från adsorption till rörets väggar och / eller pipettting.
- Tvätta filtren tre gånger med 1 ml iskall tvättbuffert.
5. Vätskescintillationstelling
- Placera 5 ml scintillationsräkningsflaskor i en räknehylla. Tillsätt 5 ml scintillationsvätska till varje flaska.
- Stäng av vakuumet (steg 4.4). Ta bort locket i vakuumfiltreringsapparaten. Använd pincett, plocka upp filtret från filtreringsapparatens vakuumportar och släpp varje filter i en individuell 5 ml scintillationsflaska.
- Förbered en injektionsflaska med 195 μL CBB för att bestämma maximal signal.
- Lossa varje injektionsflaska säkert. Inkubera flaskorna på en orbitalskakare vid 25 ° C under 10 minuter.
- Slå på scintillationsräknaren. Programmera scintillationsräknaren för att mäta 35 S isotoputsläpp i 5 min per prov med hjälp av det standardiserade associerade scintillationsprogrammet.
- Tryck på "Start" för att räkna.
- När räkningen är klar, kassera den räknade ampullenS som farligt avfall.
6. Dataanalys
- Ange data i statistik och analysprogram.
- Subtrahera den icke-specifika bindningen från var och en av de andra mätningarna för bestämning av den specifika bindningen.
OBS: Graden av icke-specifik bindning bestäms av provet inkuberat med icke-radiomärkt GTPyS (steg 3.8.3). - Öppna statistiken och analysprogrammet och välj en XY dataset post.
- Ange specifika bindningsdata från [35S] GTPγS-bindningsexperimenten i en datatabell i statistiken och analysprogrammet. Ange agonistkoncentrationerna, som molära koncentrationer, i "X" -kolonnen. Ange de associerade 35 S-räkningarna som "Y" -värden.
- Subtrahera den icke-specifika bindningen från var och en av de andra mätningarna för bestämning av den specifika bindningen.
- Transformera data.
- Konvertera X-värdena till respektive logaritm genom att klicka på "Analysera". Välj "Transform" från den inbyggdaN analyser.
- I dialogrutan "Transformera" välj "Transform X values using" och välj funktionen "X = log (X)." Välj att skapa ett nytt diagram över resultaten.
- Klicka på "OK".
- Normalisera Y-värdena.
- Med de transformerade resultaten som visas klickar du på "Analysera". Välj "Normalisera" från de inbyggda analyserna.
- I dialogrutan Normalisera väljer du alternativknappen för att definiera 0% som "minsta värde i varje dataset" och 100% som "största värdet i varje dataset". Markera rutan för att presentera resultaten som procentandelar. Markera rutan för att skapa ett nytt diagram över resultaten.
- Klicka på "OK".
- Anpassa en icke-linjär regressionskurva till de plottade data. Utför en icke-linjär regressionsanalys.
- Med de normaliserade resultaten som visas klickar du på "Analysera". Från de inbyggda analyserna, Välj "Nonlinear regression (curve fit)."
- Om du undersöker en agonist, välj "log (agonist) vs normaliserad respons - variabel lutning" från dialogrutan.
- Om du undersöker en antagonist, välj logg (antagonist) vs. normaliserad respons - variabel lutning "från dialogrutan.
- Klicka på "OK".
- Granska grafen och resultaten för att se till att passformen och dataen är i rimlig överenskommelse. Se till att regressionen matchar det generella mönstret för de plottade data och att resterna inte är så stora att de gör dosresponsskurvan platt.
OBS! Programvaran kommer att sammanfatta resultaten av den icke-linjära regressionen och specificera koncentrationen som framkallar det halva maximala svaret (EC 50 ), Hill-koefficienten (n H ) och den halva maximal hämmande koncentrationen (IC 50 ). - Derivär agonist / antagonistparameterstyrka.
- Avleda agonisten equIlibriumdissociationskonstanter (Kb) från något av följande experiment 16 , 17 , 18
- Bedöm skiftet i dosresponsen hos en agonist i konkurrens med en fast koncentration av antagonisten. Här är EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / antagonist Kb ), där EC 50 ' är den högerförskjutna EC 50 .
- Bedöm [35S] GTPγS-bindning med varierande koncentrationer av antagonist i konkurrens med en fast agonistkoncentration. Här är Kb = IC50 / (2 + ([agonist] / agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, där n är agonistens Hillkoefficient.
- Avleda agonisten equIlibriumdissociationskonstanter (Kb) från något av följande experiment 16 , 17 , 18
- Beroende på dataens variabilitet, upprepa experimentet (steg 3.8-5.6) för varje ligand ca 3-5 gånger och genomsnitts resultaten med hjälp av en statistik och analys mjukvaraär.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellfraktionering kan användas för att isolera och berika membranassocierade proteiner från cytosoliska och nukleära proteiner. Figur 1 är en Western blot som visar innehållet i de tre primära fraktionerna som kan samlas under den subcellulära fraktioneringsprocessen. Specifikt visar figur 1 att fraktionering separerar ren membranproteiner ( dvs Na + / K + ATPas, proteindisulfidisomeras (PDI) och HA-MOR1) från histon H2B och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), kärnproteiner och cytosoliska proteiner, respektive. Dessutom visar figur 1 anrikningen av proteiner (bana 1 jämfört med bana 4) i deras respektive subcellulära fraktioner som ett resultat av fraktionering. En representativ Ponceau-fläck demonstrerar lika proteinbelastning i varje fraktion. Det är viktigt att notera att denna fractiOnation-protokollet skiljer inte mellan olika cellmembran. PDI är i allmänhet lokaliserat till endoplasmatisk retikulum (ER), medan Na + / K + ATPas övervägande är vid plasmamembranet. Båda proteinerna är emellertid närvarande i den slutliga råmembranfraktionen ( Figur 1 , fält 4). Dessutom, medan detta protokoll separerar kraftigt kärnproteiner från den cytosoliska och slutliga membranfraktionen ( Figur 1 , banor 2-4), innehåller fraktionen som är berikad för kärnproteiner några membranproteiner ( Figur 1 , bana 2), eventuellt från ER.
Multipla farmakologiska parametrar kan härledas för att karakterisera en GPCR-ligandinteraktion via GTP-bindande experiment ( Tabell 1 ). Exempelvis kan det halvmaksima svaret (EC50) och Hill-koefficienten (nH) hos en agonist härledas genom övervakning av GTP-bindning iSvar på varierande doser av agonisten. Figur 3A visar dosresponsiv GTP-bindning till MOR1 efter DAMGO-behandling. När data är lämplig för en icke-parametrisk regression av fyra parametrar beskriver passformen en receptor-ligand-interaktion med en EC 50 på 185 ± 23 nM och en Hill-koefficient på 0,46 ± 0,06. Den grunda GTP-bindningskurvan observerad efter DAMGO-behandling tyder på negativ kooperativitet mellan DAMGO och MOR1. Denna metod kan också identifiera och beskriva en antagonists farmakologi. Som figur 3A och B illustrerar är naloxon en MORl-antagonist. Agoniststyrkan (Kb) av naloxon, 97 ± 20 nM, bestämdes genom variation av koncentrationen av naloxon i konkurrens med en fast koncentration av DAMGO ( Figur 3A ). Naloxon uppvisade en Hill-koefficient på 0,88 ± 0,06, vilket tyder på oberoende bindning mellan naloxon och MOR1. Om acTion av en ligand är okänd, kan denna analys diskriminera mellan en agonist, antagonist och invers agonist. Om liganden är en agonist, skulle det finnas en ökning av GTP-bindning, som i Figur 3A , efter DAMGO-applikation. Om liganden är en invers agonist, skulle det vara minskad bindning av GTP relativt basalbindning. Om liganden är en antagonist, skulle det inte vara någon effekt vid behandling med ligand ensam. Om det appliceras samtidigt med en agonist, skulle en antagonist hämma agonistens förmåga att stimulera GTP-bindning. Figur 3A illustrerar antagonistaktiviteten hos naloxon mot agonisten DAMGO.
Figur 1: Cellfraktioner separerar membranassocierade, kärn- och cytosoliska proteiner. ( Top ) Lane 1 representerarProtein närvarande i hela cellen. Bana 2 innehåller kärn- och membranassocierade proteiner separerade under de första centrifugeringsstegen. Bana 3 är den cytosoliska fraktionen separerad efter 20 min centrifugering vid 11 000 x g. Bana 4 innehåller en råmembranfraktion lämplig för [35S] GTPyS-bindande experiment. ( Botten ) Ponceau-fläck av ett västmembran demonstrerar proteinbelastning för varje cellulär fraktion. Följande antikroppar användes för immunoblottning: mus anti-Na + / K + -ATPas (1: 1000), mus anti-GAPDH (1: 5 000), mus anti-H2B (1: 2.500), kanin-anti-PDI : 1000) och råtta anti-HA (1: 2000). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödesschema som beskriver fraktionen och [35S] GTPyS-bindningsförfarandet. Först transfektera cellerna för att uttrycka GPCR av intresse. Efter 48 timmar, skörda och fraktionera cellerna för att isolera receptorn (röd) och associerade G-proteiner (grön = G a , lila = G β och orange = G γ ). För att utföra GTP-bindande experiment, tillsätt [35S] GTPγS och inkubera membranen med den intressanta liganden. För att mäta G-proteinaktivitet, binde membranen till ett filter för att tvätta bort eventuellt obundet radiokemiskt och kvantifiera sedan den bundna [ 35 S] GTPyS genom vätskescintillationstelling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Agonism aNd-antagonism vid μ-opioidreceptorer Definierad genom [35S] GTPyS-bindning. ( A ) [ 35 S] GTPγS dosresponsskurva till DAMGO ensam (blå) eller naloxon i tävling med 2,5 μM DAMGO (grön). [35S] GTPyS-bindning normaliserades till maximal stimulering i varje experiment och uttrycktes i procent. Poängen som visas är medelvärdet av trefaldiga bestämningar och uttrycks som medelvärdet ± SEM ( B ) -antagonism hos DAMGO-stimulerade [35S] GTPγS Bindande med naloxon. [35S] GTPyS Bindning kvantifierades efter tillsatsen av enbart naloxon (100 | iM), DAMGO ensam (10 | im) eller DAMGO (10 | im) i konkurrens med naloxon (100 | iM). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM av tre oberoende experiment. Vänligen klicka på hanOm du vill se en större version av den här siffran.
| ligand | EC 50 eller IC 50 (nM) | N H | Kb (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| naloxon | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tabell 1: Farmakologiska parametrar av DAMGO och naloxonaktivitet vid μ-opioidreceptorer. Halvmaximalt svar (EC50) och Hill-koefficienten (nH) för DAMGO härleddes från [35S] GTPγS-bindning som svar på varierande doser av DAMGO. Den halva maximal hämmande koncentrationen(IC50) och jämviktsdissociationskonstant (Kb) för naloxon bestämdes från effekten av konkurrens mellan naloxon och 2,5 uM DAMGO på [35S] GTPγS-bindning. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM av tre oberoende experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande protokoll beskriver två separata men komplementära metoder: ett enkelt tillvägagångssätt för fraktionering av celler och vävnader i breda men separata fack och ett medel för att undersöka GPCR-signalering genom att mäta [35S] GTPγS-bindning.
Effektiv cellfraktionering har ett brett användningsområde, allt från extraktion och berikning av proteiner till bedömningen av subcellulär lokalisering av proteiner till studier av receptorfarmakologi. Även om alternativa metoder för fraktionering av celler och vävnader finns, är protokollet som presenteras här relativt billigare, snabbare och enklare. Till skillnad från mer etablerade metoder kan emellertid denna metod inte rena separera plasmamembranassocierade proteiner från andra membranfack, såsom endosomer eller ER. Det måste också noteras att medan ovanstående protokoll använder ett transientt överexpressionssystem för att alstra cellmembran innehållande GPCR avIntresse, detta protokoll är kompatibelt med stabila överexpressionssystem, såväl som med djur eller mänsklig vävnad 19 .
Provberedning är kritisk för att maximera fraktionsutbyte och renhet. Det är särskilt viktigt att säkerställa fullständig homogenisering och minimera övergångstiderna mellan centrifugeringsstegen. Användning av en pelletshomogenisator / pestel för att fullständigt störa cellmembranet ökar väsentligen det råa membranutbytet i den slutliga cellfraktionen. Om membranutbytet är för lågt skulle de två enklaste lösningarna vara att skala upp den ursprungliga cellkulturen och / eller att homogenisera cellpelleten några gånger. Om enskilda fraktioner uppvisar en hög grad av föroreningar, minska övergångstiderna mellan centrifugering och separation. Låt inte proverna sitta efter centrifugering, eftersom proteiner kan diffundera i provet och minska fraktionens renhet.
Filtreringsbaserad [35S] GTPyS-bindning är en snabb och kvantitativ metod för mätning av aktiveringen av G-proteiner med användning av den associerade receptorn. Mätning av GTP-bindning medger en mer kvantitativ mätning av GPCR-aktivitet än vad som är generellt möjligt vid övervakning av nedströms processer. Det finns emellertid två kritiska begränsningar för metoden som beskrivs här. Viktigast är filtreringsbaserad [35S] GTPγS-kvantisering inte lika genomförbar med alla G a- isoformer 20 , 21 . I allmänhet är denna metod begränsad till G i / o- kopplade GPCR-enheter som MOR1 22 . G s- och G q- kopplade receptorer tenderar att vara mindre känsliga. Detta beror troligen på kombinationen av den lägre överflödet av G s / G q och deras relativt långsammare nukleotidväxel, vilket gör det svårt att skilja verklig [ 35 S] GTPyS-bindning ovanför bakgrunden. Denna begränsning har behandlats els Ewhere med användning av G-protein antikropp fångst tekniker 20 . Vissa grupper har funnit att eliminering av BNP från reaktionen förbättrar signal-brusförhållandet för G s- eller G q- kopplade receptorer 23 . Den andra begränsningen är membrankänsligheten för lipofila agonister eller ytaktiva ämnen. [35S] GTPyS-analyser kräver funktionella receptor-G-proteinkomplex, och tillsatsen av lipofila molekyler till reaktionssystemet kan störa strukturen hos membranerna eller dessa komplex. Om detta är en potentiell oro kan det vara fördelaktigt att testa om det aktuella reagenset stör [35S] GTPγS-bindning i ett redan väl karakteriserat system, såsom i DAMGO-medierad MOR1-stimulering. Andra betingelser för att överväga optimering innefattar bindningsbuffertens pH, koncentrationerna av Mg2 + och NaCl, proteinkoncentrationen och inkubationstiden 23 ,Ef "> 24.
Detta protokoll fokuserade på en väl karakteriserad GPCR, MOR1, och välkända läkemedel, DAMGO (agonist) och naloxon (antagonist), som verkar på MOR1. En av fördelarna med denna teknik är emellertid att den kan användas för att karakterisera okända ligander som agonister, antagonister eller inversa agonister, beroende på hur liganden modulerar GTP-bindning. Vid utformning av experiment är det kritiskt att använda en rad koncentrationer av liganden av intresse och vara uppmärksam på intervallet av resultat: agonister kommer att orsaka en ökning av GTP-bindningen över baslinjen, inversa agonister kommer att orsaka en minskning av GTP-bindningen jämfört med Baslinjen, och antagonister har liten eller ingen effekt när de isoleras isoleras på baslinjen GTP-bindning.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en teknik för utförande av subcellulär fraktionering, uppsamling av råmembranpreparat och undersökning av GPCR-aktivering genom mätning av [35S] GTPγS-bindning. Dessa tekniker kan lätt anpassas till en mängd olika cellodlingar och vävnadsmodeller för att studera farmakologin hos en av de viktigaste familjerna av receptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health grant DA-000266 och Medicinsk Vetenskapsutbildningsprogram T32-bidrag (CV, NWZ och PCS). Författarna skulle också vilja erkänna somersault18: 24 (somersault1824.com) för biblioteket för vetenskap och medicinska illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
