Summary
A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.
Abstract
Os receptores acoplados a proteína G (GPCRs) são uma grande família de receptores transmembranares que desempenham papéis críticos na fisiologia celular normal e constituem um alvo farmacológico importante para múltiplas indicações, incluindo analgesia, regulação da pressão arterial e tratamento de doenças psiquiátricas. Após a ligação do ligando, os GPCR catalisam a ativação de proteínas G intracelulares estimulando a incorporação de trifosfato de guanosina (GTP). As proteínas G ativadas estimulam as vias de sinalização que suscitam respostas celulares. A sinalização de GPCR pode ser monitorizada medindo a incorporação de uma proteína radiomarcada e não hidrolisável de GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em proteínas G. Ao contrário de outros métodos que avaliam mais processos de sinalização a jusante, a ligação de [ 35 S] GTPγS mede um evento proximal na sinalização de GPCR e, importante, pode distinguir agonisTs, antagonistas e agonistas inversos. O presente protocolo descreve um método sensível e específico para estudar a sinalização GPCR usando preparações de membrana em bruto de um GPCR arquetípico, o receptor μ-opióide (MOR1). Embora existam abordagens alternativas para células e tecidos fracionados, muitos são custos proibitivos, tediosos e / ou requerem equipamentos de laboratório não-padrão. O presente método fornece um procedimento simples que enriquece as membranas brutas funcionais. Após o isolamento de MOR1, foram determinadas várias propriedades farmacológicas de seu agonista, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) e antagonista, naloxone.
Introduction
Os receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) são uma grande família de receptores de superfície celular responsáveis por uma série notável de processos fisiológicos, incluindo analgesia, olfação e comportamento 1 . Os GPCRs atuam detectando sinais externos específicos e subsequentemente estimulando a sinalização intracelular. Eles, portanto, marcam uma junção de chave entre os ambientes externos e internos de uma célula. Devido ao papel crítico que os GPCRs desempenham na biologia, eles se tornaram os principais alvos tanto da pesquisa básica como da descoberta de drogas 2 , 3 .
Ao contrário de outras famílias de receptores que se ligam a ligandos discretos, os GPCRs podem ligar tipos diferentes de moléculas. Enquanto um GPCR pode interagir com péptidos, outro pode sentir fótons, pequenas moléculas ou íons 1 , 4 . Enquanto seus ligandos são diversos, os GPCRs são unificados em seu arquiteto geralUre e função. GPCRs individuais são constituídos por sete proteínas transmembranares α-helicoidais com terminais amino extracelulares e terminais carboxílicos intracelulares 5 , 6 . Os GPCRs são acoplados a proteínas intracelulares - complexos de proteínas heterotriméricas compostos por subunidades α, β e γ - que medeiam diversas vias de sinalização 7 . A subunidade G α é uma proteína de ligação a nucleótidos de guanina que é inativa quando vinculada ao difosfato de guanosina (PIB) e ativa quando vinculada ao trifosfato de guanosina (GTP) 8 , 9 . Quando os GPCRs ligam seus ligandos, eles sofrem uma mudança conformacional que permite que G α se dissocie de G βγ , permitindo que G α troque PIB por GTP 7 . O próprio receptor é fosforilado no seu terminal carboxílico por várias serina / tremonIne quinases 10 , 11 e internalizadas para atenuar a sinalização do receptor 12 , 13 , 14 . Enquanto isso, o monómero G α ativado e o dímero G βγ passam a ativar vias de sinalização distintas 7 . Existem várias isoformas de cada subunidade de proteína G, e cada isoforma tem como alvo vias a jusante particulares e sistemas de mensageiro secundário. As principais isoformas de G α incluem G s , G q , G i / o e G 12-13 . Normalmente, os GPCR individuais se associam a uma isoforma particular de G α , ligando assim um estímulo externo a uma resposta celular específica 1 .
A caracterização de uma interação GPCR-ligando é fundamental para a compreensão da biologia do receptor. Como a troca GDP / GTP é uma das primeiras vésperasO que segue a ligação do ligando, o monitoramento da ligação GTP pode medir a ativação ou a inibição do GPCR. O ensaio de eventos mais a jusante na sinalização de GPCR geralmente não é quantitativo ou estequiométrico, pode não distinguir os agonistas completos de parciais e pode exigir reagentes caros. Além disso, o aumento da ligação GTP às proteínas G α é um evento quase universal após a ativação do GPCR, o que significa que a medição da ligação GTP é um ensaio amplamente aplicável para o monitoramento da atividade da maioria dos GPCRs. Medir a ligação GTP é uma abordagem simples e rápida para monitorar a sinalização GPCR em células que sobreexpressam o receptor de interesse ou no tecido nativo. O presente protocolo detalha um ensaio funcional de ligação de GTP usando um GPCR arquetípico, o receptor de opióides μ (MOR1), para determinar quantitativamente a atividade de um agonista e antagonista na sinalização GPCR.
Este protocolo descreve primeiro como isolar as membranas brutas das células que sobre-expressam o MOR1. Observe queEste protocolo não se limita aos sistemas de sobreexpressão e pode ser aplicado a muitas fontes de membrana, incluindo tecido nativo ou preparações que expressam múltiplos receptores e proteínas G 15 . O protocolo então detalha como medir a ligação de um análogo GTP radioativo a essas membranas em resposta a concentrações variáveis de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) ou naloxone, um agonista e antagonista MOR1, respectivamente. O análogo GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS) não é hidrolisável. Esta propriedade é crítica porque as subunidades de G α exibem atividade de GTPase intrínseca 7 e eliminariam o fosfato de gama marcado em um radioquímico GTP hidrolisável. As membranas são então presas em filtros de fibra de vidro e lavadas, após o que a GTP radiomarcada é quantificada por contagem de cintilação líquida. Múltiplos parâmetros farmacológicos podem ser derivados para caracterizarE a interação receptor-ligando, incluindo a resposta semi-máxima (EC 50 ) e coeficiente de Hill (n H ) para agonistas e a concentração inibidora semi-máxima (IC50) e constante de dissociação de equilíbrio (Kb) para antagonistas 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Expressão de HA-MOR1 recombinante em células cultivadas
NOTA: Siga todos os protocolos de cultura celular em uma capa de fluxo laminar estéril.
- Esterilize o capô de fluxo laminar da cultura celular com etanol a 70% e mantenha a técnica estéril em toda a cultura celular.
- Preparar o meio de cultura de células do rim embrionário humano com células de rimem 293 (HEK293), completar o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): DMEM, pH 7,4, suplementado com L-glutamina 2 mM, 1% de penicilina / estreptomicina e 10% de soro bovino fetal (FBS ).
- Placa 2,5 x 10 6 células HEK293 em uma placa de cultura de tecido de 10 cm em 10 mL de DMEM completo e incube a 37 ° C e 5% de CO 2 até chegar a 70-80% de confluência (O / N).
NOTA: Para coletar proteína suficiente para uma experiência completa de ligação ao GTP, aplique pelo menos placas de 3 x 10 cm de células. - Transfecte as células com HA-MOR1 usando um reagente de transfecção de escolha e seguindo o fabricante 'Diretrizes s. Incube por 36-48 h.
NOTA: ADNc MOR-1 humano (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) foi um generoso presente de Gavril Pasternak e foi clonado em pCMV-HA.
2. Coleta de células e coleta de membrana
- Prepare os seguintes buffers de lise:
- Tampão 1: ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico 10 mM (HEPES), pH 7,4; 1 mM de etilenoglicol-bis (β-aminoetil éter) -N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA); 10% de sacarose; Coquetel inibidor de protease; E ditiotreitol 1 mM (DTT). Adicione o DTT fresco no dia do isolamento da membrana.
- Tampão 2: HEPES 10 mM, pH 7,4; EGTA 1 mM; MgCl2 1 mM; E DTT 1 mM. Adicione o DTT fresco no dia do isolamento da membrana.
- Remova as células transfectadas da incubadora (etapa 1.4), aspirar o meio e enxaguar as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. Aspirar o PBS e o excesso de líquido deo prato.
- Adicione 600 μL de tampão 1 às células. Usando um raspador de células, destrale as células da superfície da placa e pipette a suspensão celular em um tubo de microcentrífuga de 1,6 mL.
- Emita imediatamente o tubo de microcentrífuga em nitrogênio líquido. Uma vez que as amostras estão congeladas, descongelar os lisados em gelo ou colocá-los a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Repita as etapas 2.3 e 2.4 com todas as placas de células.
- Uma vez que os lisados tenham descongelado, use um homogeneizador de micro-tubo de pulso único para abrir as células. Pulse o homogeneizador 3-5 vezes por 10 s, colocando o tubo de volta no gelo durante 30 segundos entre os pulsos.
- Coletar 20 μL como fração de células inteiras.
- Centrifugar a amostra restante por 10 min a 1000 xg e 4 ° C. Recolher o sobrenadante e colocar em um novo tubo de microcentrífuga de 1,6 mL em gelo.
- Ressuspender o sedimento em 100 μL de tampão 1 e rehomogenizar com um pilão. Pulse o homoGenizer 3-5 vezes por 5 s, colocando o tubo de volta no gelo durante 30 s entre pulsos.
- Centrifugue a amostra uma segunda vez por 10 min a 1000 xg e 4 ° C. Combine o sobrenadante com o sobrenadante do passo 2.7.
NOTA: O pellet restante contém proteínas nucleares e de membrana.
- Centrifugue a amostra uma segunda vez por 10 min a 1000 xg e 4 ° C. Combine o sobrenadante com o sobrenadante do passo 2.7.
- Centrifugar os sobrenadantes combinados durante 20 min a 11 000 xg e 4 ° C. Separe o sobrenadante (a fração citosólica) num novo tubo de microcentrífuga de 1,6 mL.
- Ressuspender o sedimento em 200 μL de tampão 2. Homogeneizar o sedimento triturando 3-5 vezes. Centrifugue a amostra por 20 min a 21.100 xg e 4 ° C. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o grânulo contendo a fração de membrana bruta em 50 μL de tampão 2.
- Proceda imediatamente às experiências de ligação GTPγS (seção 3) ou congelamento instantâneo em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C.
3. Encadernação [ 35 S] GTPγS NOTA: Use o protocolo de segurança radioquímico padrão ao manusear [ 35 S] GTPγS e ao realizar experiências de ligação [ 35 S] GTPγS. Use sempre luvas de proteção e um bata de laboratório. Verifique o material de embalagem quanto a vazamentos ou fissuras. Descarte os resíduos e os reagentes em excesso de acordo com os protocolos institucionais.
- Preparar o tampão de ligação incompleto (IBB) por mistura de HEPES 50 mM, pH 7,4; MgCl2 5 mM; NaCl 100 mM; E 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) em água destilada.
- Diluir estoque [35S] GTPγS a 50 nM em 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 10 mM DTT. Faça alíquotas de 500 μL e guarde-as a -80 ° C. Use apenas uma alíquota recém-descongelada imediatamente antes de iniciar a experiência. Descongelar as alíquotas no gelo.
- Preparar GTPγS não radiomarcado dissolvendo 1 mg de pó de GTPγS em 177,62 μL de água pura para uma concentração de estoque de 10 mM. Faça alíquotas de 10 μL e guarde-as em-20 ° C.
- Prepare o tampão de ligação completo (CBB), completando o IBB para incluir uma concentração final de DTT 1 mM, albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% (peso / volume), 10 μM de GDP e 0,1 μM [35S] GTPγS.
NOTA: O CBB agora contém GTP radiomarcado. Tome as precauções de segurança apropriadas enquanto trabalha com soluções radioativas. - Destilar a fração de membrana do passo 2.11 no gelo.
- Quantificar a concentração de proteína da fração de membrana através de um teste de proteína Bradford usando um espectrofotômetro a 595 nm.
- Prepare uma série de diluição de padrões de proteína BSA com tampão 2, em concentrações finais de 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 e 5.000 μg / mL.
- Adicione 2 μL de cada padrão ou membrana a 1 mL de reagente de Bradford em uma cuvete. Misture completamente por vortexing.
- Ajuste o espectrofotômetro para um comprimento de onda de 595 nm e em branco usando a cuvete com proteína 0 μg / mL.
- Aguarde 5 min e rCada um dos padrões e cada uma das amostras com um comprimento de onda de 595 nm.
- Traçar a absorvência dos padrões em relação à concentração. Usando a Lei Beer-Lambert (A = εcl, onde ε = coeficiente de extinção, l = comprimento da cuvete e c = concentração), calcule a concentração das amostras de membrana.
- Diluir as frações da membrana até uma concentração de 100 μg de proteína / mL em IBB.
NOTA: Um prato de 10 cm de células HEK293 normalmente produz entre 1 e 3 mg de proteína / mL. - Prepare as seguintes condições experimentais em tubos individuais de microcentrífuga de 1,6 mL: uma série de diluição de ligando, uma condição de atividade basal para medir a ligação GTP basal e uma condição de ligação não específica para medir a ligação GTP não específica.
- Para a série de diluição do ligando, prepare uma série de diluição do ligando de interesse em um volume final de 100 μL de CBB. Prepare a série de ligandos em 2x a concentração final desejadaOns. Espalhar as concentrações do ligando para cobrir adequadamente uma gama de respostas.
- Para ensaiar o efeito de DAMGO na ligação GTP através de MOR1, preparar diluições DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM e 2 pM em CBB (final Volume: 100 μL).
NOTA: Por exemplo, se o ligando de interesse tiver um valor EC 50 esperado de 10 μM, prepare diluições de ligandos de 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM e 2 mM. Estas cinco condições cobrem uma ampla gama de concentrações e são 2x a concentração desejada para o ensaio.
- Para ensaiar o efeito de DAMGO na ligação GTP através de MOR1, preparar diluições DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM e 2 pM em CBB (final Volume: 100 μL).
- Para a ligação basal, prepare um tubo com 100 μL de CBB apenas.
- Para a ligação não específica, prepare um tubo com 99 μL de CBB suplementado com 1 μL de GTPγS não marcado com radiação 2 mM.
- Para a série de diluição do ligando, prepare uma série de diluição do ligando de interesse em um volume final de 100 μL de CBB. Prepare a série de ligandos em 2x a concentração final desejadaOns. Espalhar as concentrações do ligando para cobrir adequadamente uma gama de respostas.
- Adicione 100 μL da solução de membrana diluída (etapa 3.7) a cada condição experimental.
- Incubar as membranas com os vários experimentosCondições entalais em tubos de microcentrífuga de 1,6 mL por 30 min a 25 ° C num termomixer ou em um agitador orbital.
4. Filtração de membrana
- Prepare o tampão de lavagem combinando 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4; MgCl2 5 mM; E NaCl 50 mM em água destilada.
- Presoak os filtros de fibra de vidro em água por 10 min.
NOTA: Os filtros têm um tamanho de poro de 1 μm, um diâmetro de 2,1 cm e uma espessura de 675 μm. - Remova as amostras do termomixer ou agitador orbital (passo 3.10). Em breve, pulso-gire as amostras por 5 s para coletar cada amostra no fundo do tubo.
- Remova a tampa do aparelho de filtração de vácuo. Coloque os filtros pré-cozidos nas portas de vácuo do aparelho. Volte a fixar a tampa do aparelho para formar uma vedação a vácuo. Ligue o vácuo.
- Pipetar 195 μL de cada 200 μL de condição experimental em filtros para minimizar o erro de adsorção nas paredes do tubo e / ou da pipetaTing.
- Lave os filtros três vezes com 1 mL de tampão de lavagem gelado.
5. Contagem de cintilação líquida
- Coloque frascos de contagem de cintilação de 5 mL em uma cremalheira de contagem. Adicione 5 mL de fluido de cintilação a cada frasco para injectáveis.
- Desligue o vácuo (passo 4.4). Remova a tampa do aparelho de filtração de vácuo. Usando pinças, retire os filtros das portas de vácuo do aparelho de filtração e solte cada filtro em um frasco de cintilação individual de 5 mL.
- Prepare um frasco com 195 μL de CBB para determinar o sinal máximo.
- Tire cada frasco de forma segura. Incubar os frascos em um agitador orbital a 25 ° C durante 10 min.
- Ligue o contador de cintilação. Programe o contador de cintilação para medir a emissão de isótopos 35 S por 5 min por amostra usando o programa de cintilação associado padrão.
- Pressione "Iniciar" para contar.
- Quando a contagem estiver concluída, elimine o frasco contadoS como um lixo perigoso.
6. Análise de dados
- Insira os dados em estatísticas e software de análise.
- Subtrair a ligação não específica de cada uma das outras medidas para determinar a ligação específica.
NOTA: O grau de ligação não específica é determinado pela amostra incubada com GTPγS não radiomarcado (passo 3.8.3). - Abra o software de estatísticas e análise e selecione uma entrada de conjunto de dados XY.
- Insira os dados de ligação específicos dos experimentos de ligação [ 35 S] GTPγS em uma tabela de dados no programa de estatísticas e análise. Digite as concentrações de agonista, como concentrações molares, na coluna "X". Insira as contagens 35 S associadas como valores "Y".
- Subtrair a ligação não específica de cada uma das outras medidas para determinar a ligação específica.
- Transforme os dados.
- Converta os valores de X em seu respectivo logaritmo clicando em "Analisar". Selecione "Transformar" do built-iN analisa.
- Dentro da caixa de diálogo "Transformar", selecione "Transformar valores X usando" e selecione a função "X = log (X)". Escolha criar um novo gráfico dos resultados.
- Clique em "OK".
- Normalize os valores de Y.
- Com os resultados transformados exibidos, clique em "Analisar". Selecione "Normalize" das análises embutidas.
- Dentro da caixa de diálogo "Normalizar", selecione o botão de opção para definir 0% como o "menor valor em cada conjunto de dados" e 100% como o "maior valor em cada conjunto de dados". Selecione a caixa para apresentar os resultados como porcentagens. Selecione a caixa para criar um novo gráfico dos resultados.
- Clique em "OK".
- Ajustar uma curva de regressão não linear aos dados plotados. Execute uma análise de regressão não linear.
- Com os resultados normalizados exibidos, clique em "Analisar". Das análises embutidas, Selecione "Regressão não linear (ajuste de curva)".
- Se investigar um agonista, selecione "log (agonista) versus resposta normalizada - inclinação variável" na caixa de diálogo.
- Se investigar um antagonista, "selecione log (antagonista) versus resposta normalizada - inclinação variável" na caixa de diálogo.
- Clique em "OK".
- Revise o gráfico e os resultados para garantir que o ajuste e os dados estejam de acordo razoável. Certifique-se de que a regressão corresponde ao padrão geral dos dados plotados e que os resíduos não são tão grandes que tornam a curva dose-resposta plana.
NOTA: O software irá resumir os resultados da regressão não linear e detalha a concentração que desencadeia a resposta semi-máxima (EC 50 ), coeficiente de Hill (n H ) e concentração inibitória semi-máxima (IC50). - Derivar a potência do parâmetro agonista / antagonista.
- Derive o agonista equConstantes de dissociação de ilibrio (Kb) de qualquer das seguintes experiências 16 , 17 , 18
- Avalie a mudança na dose-resposta de um agonista em competição com uma concentração fixa de antagonista. Aqui, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonista] / antagonista Kb ), onde EC 50 ' é a EC 50 deslocada.
- Avalie a ligação [35S] GTPγS com diferentes concentrações de antagonistas em competição com uma concentração fixa de agonista. Aqui, Kb = IC50 / (2 + ([agonista] / agonista EC 50 ) n ) 1 / n - 1, onde n é o coeficiente Hill do agonista.
- Derive o agonista equConstantes de dissociação de ilibrio (Kb) de qualquer das seguintes experiências 16 , 17 , 18
- Dependendo da variabilidade dos dados, repita o experimento (etapas 3.8-5.6) para cada ligando aproximadamente 3-5 vezes e em média os resultados usando um softw de estatísticas e análisesestamos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O fraccionamento celular pode ser utilizado para isolar e enriquecer proteínas associadas à membrana a partir de proteínas citosolares e nucleares. A Figura 1 é uma mancha de Western que demonstra os conteúdos das três fracções primárias que podem ser recolhidas durante o processo de fraccionamento subcelular. Especificamente, a Figura 1 mostra que o fraccionamento separa de forma limpa as proteínas da membrana ( ou seja, Na + / K + ATPase, proteína dissulfureto isomerase (PDI) e HA-MOR1) da histona H2B e da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteínas nucleares e proteínas citosólicas, respectivamente. Além disso, a Figura 1 demonstra o enriquecimento de proteínas (pista 1 em comparação com a pista 4) em suas respectivas frações subcelulares como resultado do fraccionamento. Uma mancha representativa de Ponceau demonstra carga igual de proteína em cada fração. É importante notar que esta fraçãoO protocolo de onação não distingue entre diferentes membranas celulares. O PDI é geralmente localizado no retículo endoplasmático (ER), enquanto que Na + / K + ATPase é predominantemente na membrana plasmática. No entanto, ambas as proteínas estão presentes na fração final da membrana bruta ( Figura 1 , pista 4). Além disso, enquanto este protocolo separa vigorosamente as proteínas nucleares da fração de membrana citosólica e final ( Figura 1 , pistas 2-4), a fração enriquecida para proteínas nucleares contém algumas proteínas de membrana ( Figura 1 , pista 2), possivelmente da ER.
Múltiplos parâmetros farmacológicos podem ser derivados para caracterizar uma interação GPCR-ligando através de experiências de ligação a GTP ( Tabela 1 ). Por exemplo, a resposta semi-máxima (EC 50 ) e o coeficiente Hill (n H ) de um agonista podem ser obtidos monitorando a ligação GTP emResposta a doses variáveis do agonista. A Figura 3A demonstra a ligação de GTP com resposta de dose ao MOR1 após o tratamento com DAMGO. Quando os dados são adequados a uma regressão não linear de quatro parâmetros, o ajuste descreve uma interação receptor-ligando com uma CE 50 de 185 ± 23 nM e um coeficiente de Hill de 0,46 ± 0,06. A curva de ligação de GTP pouco profunda observada após o tratamento com DAMGO sugere cooperatividade negativa entre DAMGO e MOR1. Este método também pode identificar e descrever a farmacologia de um antagonista. Como a Figura 3A e B ilustra, a naloxona é um antagonista MOR1. A potência agonista (K b ) de naloxona, 97 ± 20 nM, foi determinada variando a concentração de naloxona em competição com uma concentração fixa de DAMGO ( Figura 3A ). A naloxona exibiu um coeficiente de Hill de 0,88 ± 0,06, sugerindo ligação independente entre naloxona e MOR1. Se o acA indicação de um ligando é desconhecida, este ensaio pode discriminar entre um agonista, antagonista e agonista inverso. Se o ligando for um agonista, haveria um aumento da ligação GTP, como na Figura 3A , após a aplicação DAMGO. Se o ligando for um agonista inverso, haveria ligação diminuída de GTP em relação à ligação basal. Se o ligando for um antagonista, não haveria efeito sobre o tratamento com o ligando sozinho. Se aplicado de forma concomitante com um agonista, um antagonista inibiria a capacidade do agonista para estimular a ligação GTP. A Figura 3A ilustra a actividade antagonista de naloxona contra o agonista DAMGO.
Figura 1: Fracionamento de células separa proteínas associadas à membrana, nucleares e citossólidas. ( Top ) A pista 1 representa oProteína presente em toda a célula. A pista 2 contém proteínas nucleares e associadas à membrana separadas durante as primeiras etapas de centrifugação. A pista 3 é a fração citosólica separada após 20 min de centrifugação a 11 000 x g. A pista 4 contém uma fração de membrana em bruto adequada para experiências de ligação de [ 35 S] GTPγS. ( Parte inferior ) A mancha de Ponceau de uma membrana ocidental demonstra carga de proteínas por cada fração celular. Os seguintes anticorpos foram utilizados para imunotransferência: anti-Na + / K + -ATPase de rato (1: 1.000), anti-GAPDH de rato (1: 5.000), anti-H2B de rato (1: 2.500), anti-PDI de coelho (1 : 1.000) e anti-HA de rato (1: 2.000). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxograma que descreve o procedimento de fração e [ 35 S] GTPγS-binding. Primeiro transfira as células para expressar o GPCR de interesse. Após 48 h, colher e fracionar as células para isolar o receptor (vermelho) e as proteínas G associadas (verde = G α , roxo = G β e laranja = G γ ). Para realizar experimentos de ligação ao GTP, adicionar [35S] GTPγS e incubar as membranas com o ligando de interesse. Para medir a atividade da proteína G, unir as membranas a um filtro para lavar qualquer radioquímico não ligado e depois quantificar o [ 35 S] GTPγS ligado por contagem de cintilação líquida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Agonismo aNd Antagonismo em μ-opióides Receptores Definido por [ 35 S] ligação GTPγS. ( A ) [ 35 S] GTPγS curva dose-resposta para DAMGO sozinho (azul) ou naloxona em competição com 2,5 μM DAMGO (verde). [ 35 S] A ligação de GTPγS foi normalizada para a estimulação máxima em cada experiência e foi expressa como uma porcentagem. Os pontos apresentados são a média das determinações em triplicado e são expressos como média ± SEM ( B ) Antagonismo de [ 35 S] GTPγS estimulado por DAMGO Ligação por naloxona. [ 35 S] GTPγS A ligação foi quantificada após a adição de naloxona isolada (100 μM), DAMGO sozinha (10 μM) ou DAMGO (10 μM) em competição com naloxona (100 μM). Os resultados são expressos como a média ± SEM de três experimentos independentes. Por favor clique elePara ver uma versão maior dessa figura.
| Ligando | EC 50 ou IC 50 (nM) | N H | K b (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| Naloxona | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tabela 1: Parâmetros Farmacológicos da Actividade DAMGO e Naloxona em receptores μ-opióides. A resposta semi-máxima (EC 50 ) eo coeficiente de Hill (n H ) para DAMGO foram derivados da ligação de [ 35 S] GTPγS em resposta a doses variáveis de DAMGO. A concentração inibitória semi-máxima(IC 50 ) e a constante de dissociação de equilíbrio (Kb) para a naloxona foram determinadas a partir do efeito da competição entre naloxona e DAMGO 2,5 μM na ligação [ 35 S] GTPγS. Os resultados são expressos como a média ± SEM de três experimentos independentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O presente protocolo descreve dois métodos separados, mas complementares: uma abordagem simples para fracionar células e tecidos em compartimentos amplos mas distintos e um meio para investigar a sinalização de GPCR medindo a ligação de [ 35 S] GTPγS.
O fracionamento celular eficiente possui uma ampla gama de aplicações, que vão desde a extração e enriquecimento de proteínas até a avaliação da localização subcelular de proteínas, ao estudo da farmacologia de receptores. Embora existam abordagens alternativas para células e tecidos fracionados, o protocolo aqui apresentado é comparativamente mais barato, mais rápido e mais simples. Ao contrário de métodos mais estabelecidos, no entanto, esse método é incapaz de separar separadamente as proteínas associadas à membrana plasmática de outros compartimentos membranosos, como endossomas ou ER. Também deve ser observado que, enquanto o protocolo acima usa um sistema de sobreexpressão transitória para gerar membranas celulares contendo o GPCR deInteresse, este protocolo é compatível com sistemas estáveis de sobreexpressão, bem como com tecido animal ou humano 19 .
A preparação da amostra é fundamental para maximizar o rendimento e a pureza da fração. É particularmente importante garantir uma homogeneização completa e minimizar os tempos de transição entre as etapas de centrifugação. O uso de um homogeneizador de pellets / pilão para perturbar completamente a membrana celular aumenta significativamente a produção de membrana em bruto na fração celular final. Se o rendimento da membrana for muito baixo, as duas soluções mais simples seriam aumentar a cultura celular inicial e / ou homogeneizar o sedimento celular algumas vezes mais. Se as frações individuais mostrem um alto grau de impureza, reduza os tempos de transição entre a centrifugação e a separação. Não permita que as amostras se sentem após a centrifugação, uma vez que as proteínas podem difundir na amostra e reduzir a pureza da fração.
Filtração baseada [ 35 S] GTPγA ligação S é um método rápido e quantitativo para medir a ativação das proteínas G usando o receptor associado. Medir a ligação GTP permite uma medida mais quantitativa da atividade GPCR do que geralmente é possível ao monitorar os processos a jusante. No entanto, existem duas limitações críticas ao método descrito aqui. Mais importante ainda, a quantificação baseada em filtração [ 35 S] GTPγS não é igualmente viável com todas as isoformas de G α 20 , 21 . Em geral, esse método é restrito a GCR i-o- GPs curvados como MOR1 22 . Os receptores curvados G s - e G q tendem a ser menos sensíveis. Isto é provavelmente devido à combinação da menor abundância de G s / G q e sua taxa de câmbio de nucleotídeos relativamente mais lenta, dificultando a distinção da ligação de [ 35 S] GTPγS acima do fundo. Esta limitação foi abordada E usando técnicas de captura de anticorpos de proteína G 20 . Alguns grupos descobriram que a eliminação do PIB da reação melhora a relação sinal-ruído para receptores curvados G s ou G q 23 . A segunda limitação é a sensibilidade da membrana a agonistas lipofílicos ou surfactantes. [ 35 S] Os ensaios GTPγS requerem complexos funcionais do receptor-proteína G, e a adição de moléculas lipofílicas ao sistema de reação pode interromper a estrutura das membranas ou desses complexos. Se esta é uma preocupação potencial, pode ser vantajoso testar se o reagente de interesse interrompe a ligação de [ 35 S] GTPγS num sistema já bem caracterizado, como na estimulação MOR1 mediada por DAMGO. Outras condições para considerar a otimização incluem o pH do tampão de ligação, as concentrações de Mg 2+ e NaCl, a concentração de proteína e o tempo de incubação 23 ,Ef "> 24.
Este protocolo centrou-se em um GPCR bem caracterizado, o MOR1 e medicamentos bem caracterizados, DAMGO (agonista) e naloxona (antagonista), que atuam sobre MOR1. No entanto, uma das vantagens desta técnica é que ela pode ser usada para caracterizar ligandos desconhecidos como agonistas, antagonistas ou agonistas inversos, dependendo de como o ligando modula a ligação GTP. Ao projetar experiências, é fundamental usar uma gama de concentrações do ligando de interesse e ter em mente a gama de resultados: os agonistas irão causar um aumento da ligação de GTP sobre a linha de base, os agonistas inversos causarão uma diminuição na ligação de GTP em comparação com A linha de base e os antagonistas terão pouco ou nenhum efeito quando adicionados isoladamente na ligação GTP basal.
Em resumo, este protocolo descreve uma técnica para realizar o fraccionamento subcelular, a coleta de preparações de membrana bruta e a investigação da ativação de GPCR medindo [ 35 S] GLigação TPγS. Essas técnicas podem ser facilmente adaptadas a uma variedade de modelos de células e tecidos para estudar a farmacologia de uma das famílias de receptores mais importantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela bolsa DA-000266 dos Institutos Nacionais de Saúde e pela concessão T32 do Programa de Treinamento Médico Científico (CV, NWZ e PCS). Os autores também gostariam de reconhecer o somersault18: 24 (somersault1824.com) para a Biblioteca de Ciência e Ilustrações Médicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
