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Immunology and Infection

प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55570
Automatic Translation
1, 1
1WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity

Summary

हम विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक प्ररूपी प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख के उपयोग का वर्णन।

Abstract

neuraminidase (एनए) अवरोधकों उपचार और इन्फ्लूएंजा के प्रोफिलैक्सिस है कि वर्तमान में घूम उपभेदों के खिलाफ प्रभावी रहे हैं के लिए मंजूरी दे दी विषाणु-विरोधी का ही वर्ग के हैं। मौसमी इन्फ्लूएंजा के उपचार में उनके उपयोग के अलावा, एनए अवरोधकों एक महामारी की स्थिति में उपयोग के लिए देशों के एक नंबर से खरीदकर भंडार की है। यह विषाणु-विरोधी के इस वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस घूम की संवेदनशीलता नजर रखने के लिए जरूरी है। वहाँ assays कि एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन किया जा सकता है के विभिन्न प्रकार के होते हैं, लेकिन एंजाइम अवरोध या तो एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट या एक chemiluminescent सब्सट्रेट का उपयोग कर assays सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और सिफारिश की है। यह प्रोटोकॉल एक प्रतिदीप्ति आधारित परख के उपयोग एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस संवेदनशीलता का आकलन करने के वर्णन करता है। Munana (4-Methylumbelliferyl) -α-डी एन -acetylneuraminic एसिड (- परख एनए एंजाइम 2 'cleaving पर आधारित है) फ्लोरोसेंट उत्पाद 4-methylumbelliferone (4-एमयू) जारी करने के लिए सब्सट्रेट। इसलिए, एन ना अवरोध करनेवाला इन्फ्लूएंजा वायरस एनए पर की निरोधात्मक प्रभाव एनए अवरोध करनेवाला है कि एनए गतिविधि के 50% कम करने के लिए आवश्यक है की एकाग्रता, एक आईसी 50 मूल्य के रूप में दिया के आधार पर निर्धारित किया जाता है।

Introduction

Haemagglutinin (एचए) और neuraminidase (एनए) दो इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस के प्रमुख सतह ग्लाइकोप्रोटीन हैं। हा, कोशिका की सतह ग्लाइकोप्रोटीन या glycolipids की सियालिक एसिड-गैलेक्टोज को बांधता है, जबकि एनए कोशिका की सतह 1 पर गैलेक्टोज से सियालिक एसिड cleaving द्वारा वायरस विज्ञप्ति। एनए अवरोधकों इन्फ्लूएंजा विषाणु-विरोधी है कि तर्क से एनए एंजाइमी सक्रिय साइट को कसकर बाध्य करने के लिए, जिससे जारी है और वायरस संतान के प्रसार को रोकने डिजाइन किए गए थे के एक वर्ग के हैं। Oseltamivir और zanamivir दो एनए अवरोधकों कि उपचार और इन्फ्लूएंजा के प्रोफिलैक्सिस के लिए दुनिया भर के कई देशों में अनुमोदित किया गया है कर रहे हैं। हाल के वर्षों में दो अतिरिक्त एनए निरोधक, peramivir और laninamivir, देशों की एक सीमित संख्या में उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है। एनए अवरोधकों के लिए संवेदनशीलता और म्यूटेशन कि प्रतिरोध प्रदान की पहचान के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस के स्क्रीनिंग का निर्धारण करने और प्रभावी ढंग से निगरानी करने में महत्वपूर्ण हैंविषाणु-विरोधी के इस वर्ग की eness।

पिछले 16 वर्षों में, प्रतिदीप्ति आधारित एनए निषेध परख संदर्भ और अनुसंधान इन्फ्लुएंजा, मेलबोर्न (मेलबोर्न WHOCCRRI) पर लिए केंद्र सहयोग इन्फ्लूएंजा वायरस घूम बीच एंटीवायरल संवेदनशीलता की बदलती प्रवृत्ति नजर रखने के लिए डब्ल्यूएचओ पर नियमित रूप से प्रदर्शन किया गया है। सालाना, 2,000 से अधिक इन्फ्लूएंजा वायरस एंटीवायरल संवेदनशीलता के लिए परीक्षण कर रहे हैं। सबसे इन्फ्लूएंजा के मौसम में,> वायरस के 98%, सभी चार एनए अवरोधकों 2, 3, 4 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, हालांकि 2007-2008 उत्तरी गोलार्द्ध इन्फ्लूएंजा के मौसम के दौरान, वहाँ पूर्व मौसमी एक (H1N1) वायरस की संख्या में भारी उछाल था कि oseltamivir 5 संवेदनशीलता कम हो चुका था। वायरस के इस समूह है, जो लागू नहीं एमिनो एसिड प्रतिस्थापन H275Y निहित, 2008 के अंत तक दुनिया के बाकी हिस्सों में फैल गया, oseltamivir inappropri बनानेइस वायरस के इलाज के लिए विश्व स्तर पर खा लिया। वर्तमान में इन्फ्लूएंजा बी, इन्फ्लूएंजा ए (H3N2), और इन्फ्लूएंजा ए घूम के विशाल बहुमत (H1N1) pdm09 उपभेदों oseltamivir लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, हालांकि एनए एमिनो एसिड प्रतिस्थापन H275Y कि oseltamivir कम प्रदान युक्त (H1N1) pdm09 वेरिएंट के समुदाय समूहों और peramivir संवेदनशीलता, दुनिया 6, 7 के विभिन्न भागों में सूचना दी गई है।

पर्याप्त रूप से उच्च वायरस अनुमापांक के लिए की जरूरत की वजह से, चिकित्सकीय नमूने (पशु नाक धोने सहित) या तो सेल संस्कृति में passaged या एंटीवायरल संवेदनशीलता परीक्षण करने से पहले चिकन अंडे embryonated किया जाना चाहिए। एनए निषेध परख इस आलेख में वर्णित तीन वर्गों में विभाजित किया जा सकता है:

फ्लोरोसेंट उत्पाद 4-methylumbelliferone (4-एमयू) एक विशेष fluorometer पर के लिए रैखिक सीमा का निर्धारण
fluorometers के बीच निहित मतभेद के कारण, टीवह फ्लोरोसेंट अंतिम उत्पाद, 4-एमयू, और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई (RFU) के लिए रैखिक रेंज की स्थापना की जानी चाहिए। एक बार 4-एमयू के लिए रैखिक रेंज स्थापित है, इष्टतम लक्ष्य संकेत चयन किया जाता है, जो इन्फ्लूएंजा वायरस की एकाग्रता एनए गतिविधि परख में निकाला जाता है करने के लिए। एक बार एक विशेष fluorometer के लिए पूरी की, इस बार-बार किए जाने की जरूरत नहीं होनी चाहिए।

वायरस के एनए गतिविधि का निर्धारण
(4-Methylumbelliferyl) -α-डी एन -acetylneuraminic एसिड (Munana) सब्सट्रेट क्रमानुसार वायरस पतला करने के लिए - एनए गतिविधि परख एक सरल परख कि 2 'के अलावा शामिल है। फ्लोरोसेंट अंतिम उत्पाद 4-एमयू की राशि NA द्वारा Munana की दरार से उत्पन्न एक fluorometer का उपयोग मापा जाता है। एनए निषेध परख में उपयोग करने के लिए उचित वायरस कमजोर पड़ने वायरस कमजोर पड़ने के खिलाफ प्रतिदीप्ति इकाइयों की साजिश रचने के द्वारा चुना जाता है। उत्पादित sigmoidal वक्र से, रैखिक खंड के मध्य बिंदु के अनुरूप होना चाहिएfluorometer का 4-एमयू रैखिक रेंज खंड 1 में निर्धारित और खंड 3 में इस्तेमाल किया जाएगा वायरस के उचित एकाग्रता को सूचित करेंगे।

एनए अवरोधकों एनए निषेध परख का उपयोग करने का आकलन वायरस संवेदनशीलता
एक विशेष एनए अवरोध करने के लिए वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए, धारा 2 में निर्धारित कमजोर पड़ने पर वायरस एनए अवरोध करनेवाला सांद्रता का एक सीमा के साथ इनक्यूबेट कर रहे हैं। Munana साथ बाद में एक ऊष्मायन के बाद, 4-एमयू बेहिचक वायरस द्वारा उत्पन्न fluorometer द्वारा RFU में मापा जाता है। एनए अवरोध करनेवाला एक वायरस के एनए एंजाइम गतिविधि पर की निरोधात्मक प्रभाव एनए अवरोध करनेवाला एकाग्रता एनए गतिविधि के 50% कम करने के लिए आवश्यक है, एक आईसी 50 मूल्य के रूप में दिया के अनुसार गणना की जाती है।

Protocol

1. निर्धारण एक fluorometer पर फ्लोरोसेंट उत्पाद 4-एमयू की रैखिक रेंज

  1. पूर्ण इथेनॉल के 5 एमएल में 4-एमयू की 11.3 मिलीग्राम भंग द्वारा 6.4 मिमी 4-MU शेयर समाधान के 10 एमएल तैयार करें। (W / v) स्टॉक समाधान के लिए 10 एमएल बनाने के लिए 0.9% सोडियम क्लोराइड के 5 एमएल जोड़ें। 9 1x की एमएल परख बफर (33.3 मिमी 2- (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) और 4 मिमी 2 CaCl, पीएच 6.5) में 6.4 मिमी 4-एमयू का 1 एमएल कमजोर द्वारा काम कर समाधान एक 640 माइक्रोन तैयार करें।
    नोट: एमईएस की 13 ग्राम और आसुत जल के 1 एम CaCl की एमएल 2 992 करने के लिए 8 एमएल जोड़कर 2x परख बफर तैयार करें। NaOH के 10 एम का उपयोग करने के 6.5 पीएच को समायोजित करें। बफर छेद के आकार 0.2 सुक्ष्ममापी की एक बाँझ सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। सावधान! सोडियम हाइड्रोक्साइड कास्टिक है और त्वचा और आंखों के लिए रासायनिक जलता हो सकती है। सुनिश्चित करें कि पूर्ण व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहना है।
  2. 4-एमयू सांद्रता (यानी, 5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, 80 माइक्रोन, 160 & # की एक श्रेणी के 5 एमएल तैयार करें181; एम, और 320 माइक्रोन) 640 माइक्रोन 4-एमयू की एक दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने 1x परख बफर का उपयोग कर के माध्यम से।
  3. 4-एमयू (यानी, 5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, 80 माइक्रोन, 160 माइक्रोन, 320 माइक्रोन और 640 माइक्रोन) (कमजोर पड़ने प्रति दो कुओं) एक स्पष्ट में, 96- से प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 50 μL बांटना अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट और शेष कुओं (जो पृष्ठभूमि संकेतों को मापने के लिए रिक्त स्थान के रूप में सेवा) में 1x परख बफर के 50 μL।
    नोट: प्रतिक्रिया मात्रा में 4-एमयू के अंतिम सांद्रता (50 μL 4-एमयू + 50 μL 300 माइक्रोन Munana) 2.5 माइक्रोन, 5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, 80 माइक्रोन, 160 माइक्रोन और 320 माइक्रोन हैं ।
  4. आसुत जल के 20 एमएल में Munana की 25 मिलीग्राम के पुनर्गठन से एक 2.5 म मुनाना शेयर समाधान तैयार करें। 5.28 1x की एमएल परख बफर के साथ 2.5 म मुनाना की 0.72 एमएल मिक्स एक 300 माइक्रोन Munana काम कर समाधान (पर्याप्त एक प्लेट के लिए मात्रा) प्राप्त करने के लिए। 300 माइक्रोन Munana काम युक्त ट्यूब कवरजब तक तुरंत इस्तेमाल एल्यूमीनियम पन्नी के साथ जी समाधान और बर्फ पर रखें। बचे हुए किसी भी सामग्री को छोड़ें।
    नोट: 2.5 म मुनाना शेयर समाधान 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और एक फ्रीज / पिघलाव चक्र के भीतर किया जाना चाहिए। 4-एमयू और Munana समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं और लंबे समय तक प्रकाश जोखिम से बचाया जाना चाहिए।
  5. 300 माइक्रोन Munana के 50 μL प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें, धीरे मिश्रण करने टैप करते हैं, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक थाली सीलर वाष्पीकरण को रोकने के साथ थाली कवर।
    ध्यान दें: यह कदम एनए निषेध परख में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में करने के लिए है।
  6. 0.824 एम NaOH के 2.225 एमएल (एक थाली के लिए पर्याप्त मात्रा) के साथ पूर्ण इथेनॉल के 11 एमएल के मिश्रण से रोकने के समाधान तैयार करें।
  7. स्टॉप समाधान के 100 μL प्रत्येक अच्छी तरह से में जोड़े प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और धीरे मिश्रण करने टैप करें।
  8. प्लेट 355 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य स्थापित करने और 460 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेटिंग के साथ एक fluorometer का उपयोग पढ़ें, पे के रूप मेंr निर्माता के निर्देशों।
  9. सभी में कोई 4-एमयू युक्त कुओं से प्रतिदीप्ति संकेतों का उपयोग औसत पृष्ठभूमि संकेत की गणना। युक्त 4-एमयू कुओं में से प्रत्येक से इस औसत पृष्ठभूमि संकेत घटाना और प्रत्येक 4-एमयू एकाग्रता के लिए औसत संकेतों (RFU) की गणना। 4-एमयू एकाग्रता (माइक्रोन), जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया के खिलाफ RFU का एक मानक वक्र प्लॉट; एक क्लोज़-अप वक्र के रैखिक अनुभाग चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
  10. 4-एमयू एकाग्रता (माइक्रोन) रैखिक रेंज और इष्टतम लक्ष्य संकेत निर्धारित करने के खिलाफ RFU की साजिश कल्पना; रैखिक सीमा है जहां भूखंड पर 4-एमयू की बढ़ती सांद्रता के प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ जाती है उसी अनुपात में है, जबकि इष्टतम लक्ष्य संकेत रैखिक सीमा के भीतर एक मनमाना 4-एमयू एकाग्रता है।
    नोट: रैखिक रेंज और इष्टतम लक्ष्य संकेत fluorometer-अलग होते हैं। उदाहरण के लिए, मेलबोर्न WHOCCRRI पर fluorometer 2 की एक रेखीय श्रृंखला है0.5-40 माइक्रोन 4-एमयू और ~ 30 माइक्रोन 4-एमयू, जो ~ 1500 RFU से मेल खाती है का एक इष्टतम लक्ष्य संकेत।

2. वायरस की एनए गतिविधि का निर्धारण

नोट: इन्फ्लुएंजा वायरस Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं या embryonated चिकन अंडे 8 में पर्याप्त titers को सुसंस्कृत हैं।

  1. स्तंभ 1 में undiluted सुसंस्कृत इन्फ्लूएंजा वायरस के अच्छी तरह से प्रति 120 μL और 1x परख बफर के 60 μL 0.1% युक्त बांटना एनपी 40 एक 96 अच्छी तरह से, यू-नीचे प्लेट के शेष 11 कॉलम में।
  2. क्रमानुसार थाली भर में वायरस के दो गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन (यानी, स्तंभ 2 के लिए स्तंभ 1 से 60 μL हस्तांतरण और बहुत आगे है, स्तंभ 11 तक) एक multichannel विंदुक का उपयोग, एक रिक्त केवल 1x परख बफर युक्त के रूप में स्तंभ 12 हो जाता है।
  3. एक स्पष्ट, 96-अच्छी तरह, फ्लैट नीचे प्लेट में कुओं (पतला वायरस और कारतूस) में से प्रत्येक से 50 μL स्थानांतरण।
    ध्यान दें: यह ग करना आवश्यक नहीं हैपरिवर्तित करें विंदुक युक्तियाँ यदि सामग्री स्तंभ 1 के माध्यम से स्तंभ 12 से स्थानांतरित कर रहे हैं।
  4. 300 माइक्रोन Munana के 50 μL (कदम 1.4 के अनुसार तैयार किया) अच्छी तरह से प्रति जोड़ें और धीरे थाली मिश्रण करने टैप करें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। एक थाली सीलर वाष्पीकरण को रोकने के साथ थाली कवर।
  5. बंद समाधान (कदम 1.6 के अनुसार तैयार किया) अच्छी तरह से प्रति प्रतिक्रिया को समाप्त करने और धीरे थाली मिश्रण नल के 100 μL जोड़ें।
  6. प्लेट एक fluorometer का उपयोग पढ़ें।
    1. 355 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य स्थापित करने और 460 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेटिंग का उपयोग करें।
  7. स्तंभ 12 में प्रतिदीप्ति रीडिंग के आधार पर औसत पृष्ठभूमि संकेत निर्धारण करें और प्रत्येक अच्छी तरह से औसत पृष्ठभूमि संकेत घटाना। वायरस dilutions के खिलाफ RFU का ग्राफ प्लॉट करें।
    नोट: WHOCCRRI मेलबोर्न में 100 माइक्रोन Munana के लिए पृष्ठभूमि मूल्यों 50 और 120 के बीच RFU आम तौर पर कर रहे हैं, लेकिन इन fluorometer बी के आधार पर भिन्न होगाएनजी इस्तेमाल किया।
  8. वायरस dilutions के खिलाफ RFU की साजिश प्रत्येक वायरस (चित्रा 2) के लिए वक्र के रैखिक खंड के मध्य बिंदु निर्धारित करने के लिए देखें। इष्टतम लक्ष्य संदर्भ बिंदु के रूप (चरण 1 में निर्धारित) संकेत का प्रयोग करें।
    नोट: यह खंड 1 में निर्धारित fluorometer का 4-एमयू रैखिक सीमा के साथ अनुरूप होना चाहिए और वायरस के उचित एकाग्रता खंड 3 में इस्तेमाल किया जाएगा प्रदान करेगा।

3. एनए इनहिबिटर्स को वायरस संवेदनशीलता का आकलन एनए निषेध परख का उपयोग

  1. 300 माइक्रोन की सांद्रता में एनए अवरोधकों के मालिक शेयरों तैयार करें।
    1. 50 एमएल 2x की परख बफर में zanamivir की 5.0 मिलीग्राम भंग (66.6 मिमी एमईएस और 8 मिमी 2 CaCl, पीएच 6.5) से 300 माइक्रोन zanamivir (आणविक भार, मेगावाट = 332.32 छ / mol) तैयार करें।
    2. 2x परख बफर के 50 एमएल में 5.8 मिलीग्राम भंग द्वारा; (मेगावाट = 386.44 जी / मोल डी टारट्रेट) 300 माइक्रोन oseltamivir कार्बोक्सिलेट तैयार करें।
    3. तैयार करना300 माइक्रोन peramivir trihydrate (मेगावाट = 382.45 छ / mol) 2x परख बफर के 50 एमएल में 5.7 मिलीग्राम भंग करके।
    4. 2x परख बफर के 50 एमएल में 5.2 मिलीग्राम भंग द्वारा 300 माइक्रोन laninamivir (मेगावाट = 346.34 छ / mol) तैयार करें।
      नोट: NA अवरोध करनेवाला मास्टर शेयरों 12 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एनए अवरोधकों की मेगावाट की जाँच करें सुनिश्चित करने के लिए सही वजन और मात्रा पुनर्गठन में किया जाता है। oseltamivir कार्बोक्सिलेट प्रोड्रग oseltamivir फॉस्फेट के सक्रिय यौगिक है। इसलिए, केवल oseltamivir कार्बोक्सिलेट एनए निषेध परख में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. मास्टर शेयरों से, 0.03 एनएम, 0.3 एनएम, 3 एनएम, 30 एनएम, 300 nm, 3000 एनएम की सांद्रता में काम कर रहे 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एनए अवरोधकों का दस गुना धारावाहिक dilutions के शेयरों तैयार करना, और 2x परख में 30,000 एनएम बफर (66.6 मिमी एमईएस और 8 मिमी 2 CaCl, पीएच 6.5); इसे एक से अधिक assays में उपयोग के लिए है।
    नोट: प्रतिक्रिया volum में एनए अवरोधकों के अंतिम सांद्रताई (वायरस कमजोर पड़ने + 50 एनए की μL अवरोध करनेवाला + 50 300 माइक्रोन Munana की μL के 50 μL) 0.01 एनएम, 0.1 एनएम, 1 एनएम, 10 एनएम, 100 एनएम, 1000 एनएम, और 10,000 एनएम, क्रमशः रहे हैं। अंतिम एकाग्रता स्टॉप समाधान के 100 μL शामिल नहीं है। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर सभी एनए अवरोधकों dilutions संग्रहित करें। समाप्ति की तारीख मास्टर शेयरों की तरह ही है।
  3. एक 96 गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में युक्त 0.1% एनपी 40 पृष्ठसक्रियकारक 1x परख बफर में वायरस dilutions तैयार करें। एनए गतिविधि परख खंड 2. से प्राप्त परिणामों के आधार पर वायरस dilutions का उपयोग चार एनए अवरोधकों का परीक्षण करने के वायरस प्रति 2 एमएल की कुल मात्रा का प्रयोग करें।
    नोट: एक 96 गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में वायरस प्रति दो कुओं (अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल) तैयार करें। वायरस 1, 2, और 3 के लिए वायरस dilutions के उदाहरण तालिका 1 में दिखाया जाता है।
  4. एक 8 गहरे अच्छी तरह से जलाशय में एनए अवरोधकों (चरण 3.2 के अनुसार तैयार) के लिए आवश्यक मात्रा बांटना। वहाँ से, लेकर dilutions पर 50 एनए अवरोधकों की μL बांटना से 0 एनएम (2x परख खuffer केवल) एक स्पष्ट, 96-अच्छी तरह, फ्लैट नीचे प्लेट में एच के लिए पंक्तियों एक में 30,000 एनएम।
    नोट: थाली लेआउट 3 चित्र में दिखाया गया है।
  5. 50 μL केवल स्तंभ 12. करने के लिए कॉलम 1-11 और 1x परख बफर के अच्छी तरह से प्रति 50 μL करने के लिए अच्छी तरह से प्रति पतला परीक्षण वायरस के जोड़े धीरे मिश्रण और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं करने के लिए थाली को टैप करें। एक थाली सीलर वाष्पीकरण को रोकने के साथ थाली कवर।
  6. 300 माइक्रोन Munana के 50 μL (कदम 1.4 के अनुसार तैयार किया) अच्छी तरह से प्रति जोड़ें और धीरे थाली मिश्रण करने टैप करें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। एक थाली सीलर वाष्पीकरण को रोकने के साथ थाली कवर।
  7. प्रत्येक के लिए बंद समाधान (कदम 1.6 के अनुसार तैयार किया) के 100 μL अच्छी तरह से और धीरे से जोड़े मिश्रण थाली पर टैप करें।
  8. प्लेट एक fluorometer का उपयोग पढ़ें।
    1. जैसा कि पहले बताया गया है, 355 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 460 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।

4. की गणनाआईसी 50 मूल्यों

नोट: JASPR v1.2 वक्र फिटिंग सॉफ्टवेयर है कि आईसी 50 मूल्यों की गणना सक्षम बनाता है। सॉफ्टवेयर सीडीसी, अटलांटा, संयुक्त राज्य अमरीका में इन्फ्लुएंजा प्रभाग द्वारा विकसित किया गया था। सॉफ्टवेयर समीकरण का इस्तेमाल करता है: वी = वी अधिकतम एक्स (1 - ([मैं] / (कश्मीर मैं + [मैं]))) है, जहां वी अधिकतम चयापचय की अधिकतम दर है, [मैं] अवरोध करनेवाला एकाग्रता, वी है प्रतिक्रिया हिचकते जा रहा है, और कश्मीर मैं निषेध वक्र के लिए आईसी 50 है।

  1. कॉपी और एक 12 स्तंभ थाली प्रारूप (96-अच्छी तरह) में एक स्प्रेडशीट में fluorometer द्वारा outputted कच्चे डेटा पेस्ट, सेल A1 के साथ शुरू।
    नोट: प्रत्येक अनुवर्ती थाली से कच्चे डेटा एक रिक्त पंक्ति से टेढ़े किया जाना चाहिए। प्रत्येक वायरस चार एनए अवरोधकों के खिलाफ परीक्षण किया गया है, तो (प्रत्येक प्लेट के बीच एक रिक्त पंक्ति के साथ) चार का एक सेट में कच्चे डेटा पेस्ट करें।
  2. फिटिंग सॉफ्टवेयर और सीएल खोलें"प्रयोग" टैब पर Ick। चुनें "वैकल्पिक 2-दवा फ्लोरो 11 नमूने।"
  3. "विकल्प" टैब पर क्लिक करें और टिक "रेखांकन उत्पन्न करें।"
  4. "विकल्प" पर फिर से क्लिक करें और "नया कुंजी" टैब पर क्लिक करें। कच्चे डेटा स्प्रेडशीट फ़ाइल को उसी फ़ोल्डर में "inhibition_key" .csv फ़ाइल सहेजें।
  5. inhibition_key फ़ाइल में आईडी नीचे सभी नमूना नाम सूची। प्रत्येक नमूने नाम अद्वितीय होना चाहिए।
  6. यदि चार एनए अवरोधकों का परीक्षण किया गया, Oseltamivir नीचे दो अतिरिक्त पंक्तियों के लिए अंतराल डाल और में टाइप "Peramivir" और "Laninamivir।" inhibition_key फ़ाइल में किए गए परिवर्तनों को सहेजें।
  7. "Jaspr v 1.2 निषेध कर्व फिटिंग" खिड़की पर लौटें और "प्रयोग फ़ाइल" और के रूप में के रूप में inhibition_key कच्चे डेटा फ़ाइल का चयन करें "कुंजी फ़ाइल।" विश्लेषण चलाएँ। .csv और .pdf प्रारूप में परिणामों की बचत करें।
    ध्यान दें: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक अवरोध वक्र साजिश होगा (RFU agaiNST एनए अवरोध करनेवाला सांद्रता), जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया। कार्यक्रम भी एक व्यक्ति एनए अवरोध करनेवाला (चित्रा 4) के खिलाफ एक वायरस के लिए आईसी 50 मूल्यों की गणना करता है। साथ ही, JASPR आईसी 50 मूल्यों और संकेत करने वाली पृष्ठभूमि (एस / बी) स्प्रेडशीट प्रारूप में अनुपात प्रस्तुत करता है। पृष्ठभूमि मूल्यों इस्तेमाल किया fluorometer के आधार पर प्रयोगशाला में प्रयोगशाला से अलग कर सकते हैं। मेलबोर्न WHOCCRRI, पृष्ठभूमि 50 से 120 RFU के लिए 100 माइक्रोन Munana श्रृंखला के लिए महत्व देता है। एक विश्वसनीय आईसी 50 मूल्य के लिए, ≥10 के एस / बी अनुपात पसंद किया जाता है, हालांकि कम से कम 10 की एक अनुपात अभी भी स्वीकार्य है, विशेष रूप से उत्परिवर्ती वायरस बहुत कम एनए गतिविधि है कि के लिए।
  8. आईसी 50 मूल्यों और वक्र सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न आकार का निरीक्षण करें। सभी डेटा बिंदु या पर गिर चाहिए वक्र के करीब; यदि वे ऐसा नहीं करते हैं, एनए निषेध परख दोहराएँ।
    नोट: वायरस पता चलता है कि असामान्य रूप से उच्च आईसी 50 मूल्यों के लिए, परख दोहराने होना चाहिएएड परिणाम पुष्टि करने के लिए।

Representative Results

इन्फ्लुएंजा विषाणु-विरोधी संवेदनशीलता 9 की निगरानी पर डब्ल्यूएचओ कार्य समूह से मानकीकृत रिपोर्ट करने के दिशानिर्देशों का उपयोग करना, एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता शर्तों सामान्य निषेध (एनआई), कम निषेध (आरआई), और अत्यधिक कम निषेध का उपयोग कर रिपोर्ट कर रहे हैं (HRI) । एनआई वायरस इन्फ्लूएंजा वायरस (या इन्फ्लूएंजा बी वायरस के लिए 5 गुना से भी कम) के लिए 50 आईसी मंझला संदर्भ की तुलना में 10 गुना से कम 50 मूल्यों कम आईसी के साथ होते हैं। आरआई वायरस 10- और इन्फ्लूएंजा वायरस (या 5 और इन्फ्लूएंजा बी के लिए 50 गुना) के लिए 50 आईसी मंझला संदर्भ से 100 गुना के बीच आईसी 50 मूल्यों के साथ होते हैं। HRI वायरस इन्फ्लूएंजा वायरस के लिए (या ऊपर इन्फ्लूएंजा बी वायरस के लिए 50 गुना) 50 आईसी मंझला संदर्भ से 100 गुना के 50 मूल्यों आईसी के साथ उन कर रहे हैं; तालिका 2 देखें।

50 मान की गणना की और मेलबोर्न WHOCCRRI में प्रतिवर्ष अपडेट किया जाता है के आईसी 50 मूल्यों में मामूली परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने के एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा उपभेदों परिसंचारी (3 तालिका)। इन्फ्लूएंजा ए (H1N1) में औसत आईसी 50 मूल्यों pdm09 वायरस चार एनए अवरोधकों भर में लगभग एक ही हैं, लेकिन मंझला zanamivir और laninamivir आईसी ए (H3N2) वायरस के लिए 50 मूल्यों 2- उच्च 4 गुना oseltamivir की तुलना में कर रहे हैं और peramivir आईसी 50 मूल्यों (3 तालिका)। इन्फ्लूएंजा बी वायरस के लिए औसत oseltamivir आईसी 50 मूल्य आम तौर पर 5 के लिए zanamivir, peramivir, और laninamivir आईसी 50 मूल्यों (3 तालिका) की तुलना में अधिक 10 गुना है।

एनए निषेध परख एक प्ररूपी परख कि आनुवंशिक परिवर्तन एसोसिएशन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता हैआरआई या HRI साथ पैदा। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि आनुवांशिक विश्लेषण आरआई या HRI साथ वायरस की पहचान के बाद किया जाता है। मेलबोर्न WHOCCRRI में वेरिएंट की एनए जीन सेंगर अनुक्रमण और अग्निछाया-अनुक्रमण का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है। एमिनो एसिड प्रतिस्थापन आरआई और HRI वेरिएंट के साथ वायरस के एनए जीन में पाया जा सकता है का एक प्रतिनिधि सूची सारणी 4 में प्रस्तुत किया है। एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के एक अधिक व्यापक सूची है कि नई संवेदनशीलता को बदल सकते हैं भी डब्ल्यूएचओ वेबसाइट 10 पर उपलब्ध है।

आकृति 1
चित्र 1: 4-एमयू एकाग्रता के खिलाफ RFU। (क) 4-एमयू एकाग्रता (माइक्रोन) के खिलाफ RFU के मानक वक्र। डॉटेड बॉक्स fluorometer के लिए 4-एमयू के रैखिक श्रृंखला दर्शाता है। रैखिक रेंज से ऊपर प्रतिदीप्ति संकेत संतृप्त किया जा सकता है, और इसलिए, किसी भी रोंप्रतिदीप्ति में मॉल परिवर्तन fluorometer द्वारा पता लगाया नहीं जा सकता है। (ख) क्लोज-अप की पहचान के लिए चित्रा 1 ए के मानक वक्र के रैखिक अनुभाग "इष्टतम लक्ष्य संकेत।" मेलबोर्न WHOCCRRI पर fluorometer 2.5-40 माइक्रोन 4-एमयू की एक रेखीय रेंज और ~ 30 माइक्रोन 4-एमयू का एक इष्टतम लक्ष्य संकेत है, जो ~ 1500 RFU से मेल खाती है है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: इन्फ्लूएंजा वायरस के एनए गतिविधि घटता का उदाहरण। 50.61 RFU की औसत पृष्ठभूमि मूल्य एनए गतिविधि घटता पर हर कमजोर पड़ने बिंदु से घटाया गया है। तीर प्रत्येक वायरस के लिए लागू नहीं निषेध परख में उपयोग करने के लिए उचित वायरस कमजोर पड़ने का संकेत मिलता है। आसान तैयारी के लिएवायरस dilutions की aration, एक वायरस 3 के बजाय एक 1/96 कमजोर पड़ने के लिए एक 1/100 कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए चुन सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 चित्र: NA निषेध परख की स्थापना के लिए प्लेट लेआउट। प्रत्येक प्लेट अंतिम स्तंभ है, जो एक नकारात्मक नियंत्रण है कि कोई वायरस है, लेकिन केवल 1x परख बफर (एबी), एनए अवरोध करनेवाला, Munana शामिल रूप में कार्य करता शामिल है, और समाधान बंद करो। ध्यान दें: JASPR प्रत्येक थाली के स्तंभ 12 से रीडिंग का उपयोग करता है आईसी 50 मूल्यों की गणना में इस्तेमाल औसत खाली संकेत निर्धारित करने के। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्र 4: एक अवरोध वक्र और एक ए (H1N1) pdm09 वायरस, ए / पर्थ / 82/2015 के आईसी 50 मूल्य का उदाहरण। JASPR सॉफ्टवेयर वक्र के भीतर हर बिंदु फिट के साथ, एनए अवरोध करनेवाला की बढ़ती एकाग्रता (एनएम) के खिलाफ के रूप में प्रतिदीप्ति (RFU) निषेध वक्र प्रस्तुत करता है। निषेध वक्र के आधार पर, आईसी 50 मूल्य के रूप में लागू नहीं अवरोध करनेवाला की एकाग्रता वायरस एनए गतिविधि के 50% कम करने के लिए निर्धारित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वाइरस वायरस कमजोर पड़ने की आवश्यकता 1x परख बफर मात्रा (μL) पृष्ठसक्रियकारक-Amps-एनपी 40 (10%) (एमएल) वायरस की मात्रा (एमएल)
1 1/20 940 10 50
2 1/40 965 10 25
3 1/100 890 10 10

तालिका 1: NA निषेध परख में वायरस 1, 2 के लिए वायरस dilutions की तैयारी, और 3।

वायरस टाइप / उप-प्रकार / वंश सामान्य निषेध कम निषेध अत्यधिक कम निषेध
(एनआई) (आरआई) (HRI)
एक (H1N1) pdm09 <10 गुना 10-100 गुना > 100 गुना
ए (H3N2) और# 60; 10 गुना 10-100 गुना > 100 गुना
बी यामागाटा और बी विक्टोरिया <5 गुना 5-50 गुना > 50 गुना

तालिका 2: डब्ल्यूएचओ विषाणु-विरोधी कार्य समूह NA अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस संवेदनशीलता के वर्गीकरण के लिए दिशा निर्देश की सिफारिश की।

<td> 0.36 (0.01-3.48)
वायरस टाइप / उप-प्रकार / वंश एन zanamivir oseltamivir Peramivir Laninamivir
माध्य (रेंज) आईसी 50 एनएम माध्य (रेंज) आईसी 50 एनएम माध्य (रेंज) आईसी 50 एनएम माध्य (रेंज) आईसी 50 एनएम
एक (H1N1) pdm09 1,326 0,42 (0.1-3.43) 0,19 (0.07-1.60) 0,55 (0.05-2.29)
ए (H3N2) 1,654 0.9 (0.11-4.0) 0,38 (0.01-3.65) 0,33 (0.12-3.06) 1,38 (0.01-9.38)
बी यामागाटा और बी विक्टोरिया 1115 2.2 (1.24-10.72) 15,12 (2.39-70.75) 1,36 (0.57-6.67) 2,89 (1.62-9.15)

तालिका 3: सामान्य निषेध के माध्य आईसी 50 और आईसी 50 रेंज (एनआई) 2015 से वायरस डब्ल्यूएचओ CCRRI, मेलबोर्न में ली गई।

एमिनो एसिड प्रतिस्थापन प्रकार / उप-प्रकार / वंश आईसी 50 गुना-परिवर्तन सहसंदर्भ के लिए मंझला आईसी 50 मूल्यों mpared।
zanamivir oseltamivir Peramivir Laninamivir
H275Y एक (H1N1) pdm09 1 557 (HRI) 123 (HRI) 2
E119V ए (H3N2) 1 63 (आरआई) 1 1
H134Y बी विक्टोरिया 1 4 76 (HRI) 2
N151T बी विक्टोरिया 4 4 42 (HRI) 1
G104E बी विक्टोरिया 1,220 (HRI) 87 (HRI) 17,724 (HRI) 701 (HRI)
E105K बी विक्टोरिया 3 5 (आरआई) 59 (HRI) 2
I222T बी विक्टोरिया 2 7 (आरआई) 8 (आरआई) 3
H273Y बी यामागाटा 1 230 (HRI) 377 (HRI) 2
D197N बी यामागाटा 4 7 (आरआई) 32 (आरआई) 3

सारणी 4: कम निषेध (आरआई) या अत्यधिक कम निषेध (HRI) एनए अवरोधकों के से जुड़ा हुआ एमिनो एसिड प्रतिस्थापन की प्रतिनिधि सूची।

मुसीबत संभावित कारण) समाधान की)
कोई या कम एनए गतिविधि कोई वायरस मौजूद है या कम वायरस उपज था। क्लीनिकल नमूना या embryonated चिकन अंडे में सेल लाइनों में संवर्धित किया जाना चाहिए (यानी Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं)एनए निषेध परख में इस्तेमाल के लिए एक उच्च वायरस लोड करने के लिए।
कुछ उत्परिवर्ती वायरस उच्च वायरस लोड पर होने के बावजूद बेहद कम एनए गतिविधि है। परीक्षण के लिए स्वच्छ वायरस एकाग्रता का प्रयोग करें। लोअर पीएच परख बफर (जैसे पीएच 5.3) का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, सावधानी जब डेटा की तुलना लिया जाना चाहिए।
कोई या एनए निषेध परख में कम एनए गतिविधि कोई वायरस जोड़ दिया गया। वायरस फिर से पतला। वायरस सुनिश्चित सीधे 1x परख बफर में जोड़ा जाता है।
गलत वायरस कमजोर पड़ने इस्तेमाल किया गया था। एनए गतिविधि परख दोहराएँ।
अपर्याप्त ऊष्मायन समय। सुनिश्चित करें ऊष्मायन समय पीछा किया जाता है।
डाटा अंक आईसी 50 वक्र के अंतर्गत नहीं आता उच्च एकाग्रता के एनए अवरोध करनेवाला के क्रॉस संदूषण। सुनिश्चित करें कि सुझावों एनए inhibi के साथ संपर्क में नहीं हैंटो जब 96 अच्छी तरह से थाली में पतला वायरस वितरण।
एक 8 गहरे कुएं जलाशय इस्तेमाल किया गया था, तो त्यागने और एक नए सिरे से 8 गहरे कुएं जलाशय में सांद्रता अवरोध करनेवाला एनए फिर से बांटना।
एनए अवरोध करनेवाला या Munana या पतला वायरस की मात्रा प्रत्येक में अच्छी तरह से नहीं जोड़ा गया है समान रूप से। एक कैलिब्रेटेड विंदुक मल्टी चैनल के साथ परख दोहराएँ। सुनिश्चित करें प्रत्येक अभिकर्मक के बराबर मात्रा में अच्छी तरह से प्रत्येक में वितरित कर दिया जाता।
असामान्य रूप से उच्च आईसी 50 मूल्यों वायरस की बहुत अधिक एकाग्रता जोड़ा गया है। एनए गतिविधि परख और एनए निषेध परख दोहराएँ।
टेस्ट नमूना निहित इन्फ्लूएंजा ए और इन्फ्लूएंजा बी के मिश्रण वास्तविक समय पीसीआर वायरस मिश्रण की उपस्थिति की पहचान करने के निष्पादित करें।
नमूने में बैक्टीरियल संदूषण एंटीबायोटिक की उपस्थिति के साथ बाँझ हालत में संस्कृति वायरस।
उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत Munana सब्सट्रेट समय के साथ घट सकती है। Munana subtrate का एक नया बैच का उपयोग करें।
पड़ोसी कुओं से प्रतिदीप्ति की जांच। काला 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों का प्रयोग करें

तालिका 5: NA निषेध परख में संभावित समस्याओं का समस्या निवारण करना।

Discussion

एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस संवेदनशीलता की वैश्विक निगरानी वर्तमान में या तो फ्लोरोसेंट या chemiluminescent एनए निषेध assays 11, 12 का उपयोग कर प्रयोगशालाओं के एक नंबर के द्वारा आयोजित किया जा रहा है। फ्लोरोसेंट परख अधिक सामान्यतः chemiluminescent परख की तुलना में प्रयोग किया जाता है। हालांकि दोनों assays मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, प्रतिदीप्ति आधारित परख से प्राप्त आईसी 50 मूल्यों मुश्किल 13 दो assays से डेटा का एक प्रत्यक्ष तुलना करते समय, अक्सर chemiluminescence आधारित परख की तुलना में अधिक हैं। यहां तक ​​कि एक ही प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ, एक प्रयोगशाला से उत्पन्न डेटा दूसरे से भिन्न हो सकते हैं। क्योंकि प्रयोगशालाओं के बीच इन बदलावों की, डब्ल्यूएचओ कार्य समूह इन्फ्लुएंजा विषाणु-विरोधी संवेदनशीलता की निगरानी पर अंतर-प्रयोगशाला तुलना में सहायता के लिए एक दिशानिर्देश का उत्पादन किया। बल्कि पूर्ण आईसी 50 मूल्यों, इस निर्देश उपयोग की तुलना सेसा तुलना मंझला एनआई इन्फ्लूएंजा प्रत्येक विशेष प्रयोगशाला में परीक्षण किया वायरस के आईसी 50 आईसी 50 गुना अंतर के आधार पर। पाँच सहयोग केन्द्रों के डेटा की तुलना करने की क्षमता वैश्विक इन्फ्लूएंजा एंटीवायरल संवेदनशीलता डेटा 2, 3, 4 की वार्षिक प्रकाशन में बदल गया है। सार्वजनिक क्षेत्र में इन्फ्लूएंजा संवेदनशीलता डेटा की बड़ी राशि की उपलब्धता शोधकर्ताओं ने अपने स्वयं के प्रयोगशालाओं में उत्पन्न कि के साथ उन लोगों के अध्ययन से आईसी 50 डेटा की तुलना करने की अनुमति देता है।

अन्य एनए निषेध assays कि एक समान अवधारणा को अपनाने भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इन वाणिज्यिक किट कि रेडी-टू-उपयोग अभिकर्मकों शामिल (एनए शामिल नहीं inhibitors) समान रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। हालांकि, इन-हाउस एनए निषेध परख, काफी हद तक वाणिज्यिक किट की तुलना में सस्ता है, क्योंकि अभिकर्मकों के बहुमत में घर में बनाया जा सकता हैबड़ी मात्रा में और Munana सब्सट्रेट, जो पहले परख के प्रमुख लागत से बना, अब प्रतिस्पर्धी कीमतों पर विभिन्न स्रोतों से खरीदा जा सकता है। दवा प्रति एक इन्फ्लूएंजा अलग परीक्षण की लागत लगभग $ 1 (USD) है। मेलबोर्न WHOCCRRI में सुधार परख के तरल घटकों से निपटने के लिए एक रोबोट मंच के समावेश के बाद घर में एनए निषेध परख करने के लिए बनाया गया है। इसके अलावा वायरस dilutions के मैनुअल तैयार करने से, प्रक्रियाओं के बहुमत तरल से निपटने रोबोट का उपयोग किया जाता है। इतना ही नहीं इस मैनुअल हैंडलिंग को कम करता है, लेकिन यह भी assays कि एक दिन में चलाया जा सकता है की संख्या बढ़ जाती है।

हालांकि एनए निषेध परख अत्यधिक मजबूत है, वहाँ महत्वपूर्ण चरणों अतिरिक्त देखभाल के साथ पूरा हो जाने की जरूरत है कि के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, एनए अवरोध करनेवाला सांद्रता निषेध घटता और आईसी 50 मूल्यों बदलाव कर सकते हैं में किसी भी अनियमितता; इसलिए, ध्यान होना चाहिएभुगतान किया जब एनए अवरोध करनेवाला सांद्रता की तैयारी। दूसरा, सटीक pipetting और सटीक ऊष्मायन अवधि assays भर में लगातार परिणामों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं; इस कैलिब्रेटेड pipettes और टाइमर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। हर परख में नियंत्रण वायरस के शामिल किए जाने को भी परख से परख करने के लिए और समय की लंबी अवधि से अधिक परख प्रदर्शन की निगरानी में सक्षम बनाता है। तीसरा, क्योंकि मौसमी इन्फ्लूएंजा वायरस के एनए एंजाइम गतिविधि पीएच 6.5 पर इष्टतम है, परख बफर के सही पीएच महत्वपूर्ण है। कुछ रिपोर्ट में पाया है कि कम पीएच की स्थिति हो सकता है के उपयोग के इस तरह के एक (H7N9) R292K उत्परिवर्तन 14, 15 से युक्त संस्करण के रूप में इन्फ्लूएंजा वेरिएंट, की पहचान में सुधार। हालांकि, परख बफर का पीएच को संशोधन आईसी 50 मूल्यों परिवर्तन होगा, और इस प्रयोगशालाओं के भीतर और प्रयोगशालाओं के बीच डेटा की तुलना को मुश्किल हो सकती है। अन्य संशोधनों और समस्या निवारण कि पी हो सकता हैerformed तालिका 5 में सूचीबद्ध हैं।

एनए अवरोधकों को मंजूरी दे दी विषाणु-विरोधी है कि वर्तमान में इन्फ्लूएंजा वायरस घूम के खिलाफ प्रभावी रहे हैं की केवल वर्ग के हैं। जब तक अन्य एंटीवायरल कक्षाएं नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उपलब्ध हो जाते हैं, इन्फ्लूएंजा वायरस परिसंचारी के एंटीवायरल संवेदनशीलता निगरानी अकेले एनए अवरोधकों पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा। सादगी और परिणामों के reproducibility की वजह से, एनए निषेध परख के उपयोग एनए अवरोधकों के इन्फ्लूएंजा वायरस संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए जारी रहेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

मेलबोर्न डब्ल्यूएचओ संदर्भ और अनुसंधान इन्फ्लुएंजा पर सेंटर फॉर सहयोग स्वास्थ्य ऑस्ट्रेलियाई सरकार विभाग द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Influenza A and B viruses Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)  Biosynth AG M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)  Sigma M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU) Sigma M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)  Sigma M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)  APS AJAX Finechem  127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)  Thermo Fisher Scientific  PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)  APS AJAX Finechem 482-2.5KG
Absolute Ethanol  APS AJAX Finechem 214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates NUNC 456537
96-well U-bottom plates Greiner Bio-one  4650101
8 channel deep well block Pacific Laboratory Products RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells Pacific Laboratory Products P-2ML-SQ-C
Plate sealers Thermo Fisher Scientific  236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) Sigma-Aldrich CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) Greiner Bio-one  P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller Eppendorf 4430000018
Centrifuge tubes 50 mL BD Bioscience 352070
Racked tubes Scientific Specialties, Inc. 1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm TermoFisher Scientific ASCENT FL 374
Ascent software TermoFisher Scientific 5185410CD
Incubator set at 37 °C Lab Supply Biocell 1000
Zanamivir GlaxoSmithKline Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate Roche
Peramivir (BCX-1812) BioCryst
Laninamivir (R-125489) Daiichi-Sankyo
 JASPR v1.2 Influenza Division at the CDC Atlanta, USA  freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 122 प्रतिदीप्ति neuraminidase प्रतिरोध इन्फ्लूएंजा Munana विषाणु अवरोध करनेवाला प्ररूपी परख oseltamivir zanamivir
प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए
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Leang, S. K., Hurt, A. C. Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals. J. Vis. Exp. (122), e55570, doi:10.3791/55570 (2017).

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