Summary
Vi beskriver användningen av en fenotypisk fluorescensbaserad neuraminidas inhibitionsanalys för att bedöma känsligheten hos influensa A och B-virus till neuraminidashämmaren klass av antivirala läkemedel.
Abstract
De neuraminidas (NA) inhibitorer är den enda klass av antivirala läkemedel som godkänts för behandling och profylax av influensa som är effektiva mot aktuella cirkulerande stammar. Förutom deras användning vid behandling av säsongsbunden influensa, har NA-hämmare lagring av ett antal länder för användning i händelse av en pandemi. Det är därför viktigt att följa känsligheten hos cirkulerande influensavirus till denna klass av antivirala läkemedel. Det finns olika typer av analyser som kan användas för att bedöma mottagligheten hos influensavirus till NA-inhibitorer, men de enzymhämningsanalyser med användning av antingen ett fluorescerande substrat eller en kemiluminiscent substrat är den mest använda och rekommenderade. Detta protokoll beskriver användningen av en fluorescens-baserad analys för att utvärdera influensavirus mottaglighet för NA-hämmare. Analysen är baserad på NA enzymet klyver 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic syra (Munana) Substratet för att frisätta den fluorescenta produkten 4-metylumbelliferon (4-MU). Därför är den inhiberande effekten av an NA-inhibitor på influensavirus NA bestämmas baserat på koncentrationen av NA inhibitor som krävs för att reducera 50% av NA-aktivitet, som ges som ett IC50-värde.
Introduction
Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är de två stora ytglykoproteiner av influensa A och B-virus. HA binder till sialinsyra-galaktos av glykoproteiner eller glykolipider på cellytan, medan NA frisätter viruset genom klyvning av sialinsyra från galaktos på cellytan en. NA-hämmare är en klass av influensa antivirala medel som var rationellt utformade för att binda hårt till NA enzymatiska aktiva stället, för att därigenom förhindra frisättningen och spridning av virus avkomma. Oseltamivir och zanamivir är två NA-hämmare som har godkänts i många länder över hela världen för behandling och profylax av influensa. Under de senaste åren, ytterligare två NA-hämmare, peramivir och laninamivir, varit har godkänts för användning i ett begränsat antal länder. Screening av influensavirus för mottaglighet för NA-hämmare och identifiering av mutationer som ger resistens är viktiga för att bestämma och övervaka effectiveness av denna klass av antivirala läkemedel.
Under de senaste 16 åren har fluorescens-baserade NA hämningsanalys utförts rutinmässigt vid WHO Collaborating Centre for referens och forskning om influensa, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) för att övervaka den förändrade trenden av antiviral känslighet bland cirkulerande influensavirus. Årligen är mer än 2.000 influensavirus testas för antiviral känslighet. I de flesta influensa säsonger,> 98% av virus är känsliga för alla fyra NA inhibitorer 2, 3, 4, även om under 2007-2008 norra halvklotet influensasäsongen, fanns det en ökning i antalet av tidigare säsongs A (H1N1) virus som hade minskad känslighet för oseltamivir 5. Denna grupp av virus, som innehöll NA aminosyrasubstitution H275Y, spridas till resten av världen i slutet av 2008, vilket gör oseltamivir inappropriåt globalt för behandling av detta virus. Den stora majoriteten av närvarande cirkulerande influensa B, influensa A (H3N2) och influensa A (H1N1) pdm09 stammar är känsliga för oseltamivir, även om gemenskap kluster av A (H1N1) pdm09 varianter innehållande NA aminosyrasubstitutionen H275Y som ger reducerad oseltamivir och peramivir känslighet har rapporterats i olika delar av världen 6, 7.
På grund av behovet av en tillräckligt hög virustiter, måste kliniska prover (inklusive djur nasala tvättar) att passera i endera cellkultur eller embryonerade hönsägg före antiviral resistensbestämning. NA-inhiberingsanalys beskrivs i denna artikel kan delas in i tre sektioner:
Bestämning av den linjära området för den fluorescerande produkten 4-metylumbelliferon (4-MU) på en viss fluorometer
På grund av de inneboende skillnader mellan fluorometrar, than linjärt område för den fluorescerande slutprodukten, 4-MU, och den relativa fluorescensenhet (RFU), måste fastställas. När det linjära området för 4-MU är etablerad, är den optimala målsignalen vald, till vilken koncentrationen av influensavirus justeras i NA-aktivitetsanalys. När de är färdiga för en viss fluorometer, bör detta inte behöva upprepas.
Fastställande av NA aktiviteten av virus
NA aktivitetsanalysen är en enkel analys som innefattar tillsats av 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic syra (Munana) substrat för att serieutspäddes virus. Mängden fluorescerande slutprodukten 4-MU genereras från klyvning av Munana av NA mäts med användning av en fluorometer. Den lämpliga virusutspädning för användning i NA inhibitionsanalysen väljs genom plottning fluorescensenheter mot virusutspädning. Från sigmoidal kurva som produceras, bör mittpunkten av den linjära sektionen motsvararden 4-MU linjära området för fluorometern bestämd enligt punkt 1 och kommer att informera den lämpliga koncentrationen av virus som skall användas i avsnitt 3.
Bedöma virus mottaglighet för NA-inhibitorer med användning av NA-inhiberingsanalys
Att bedöma känsligheten av virus till en särskild NA-inhibitor, är virus vid utspädning bestämd enligt punkt 2 inkuberades med ett intervall av NA inhibitorkoncentrationer. Efter en efterföljande inkubation med Munana, är 4-MU genereras av ohämmade virus mätt i RFU genom fluorometern. Den inhiberande effekten av NA-hämmaren på NA-enzymaktiviteten hos ett virus beräknas enligt inhibitorkoncentration NA krävs för att reducera 50% av NA-aktivitet, som ges som ett IC50-värde.
Protocol
1. Fastställande av linjära området av fluorescerande produkt 4-MU på en fluorometer
- Förbereda 10 ml 6,4 mM 4-MU förrådslösning genom upplösning av 11,3 mg av 4-MU i 5 ml absolut etanol. Tillsätt 5 ml av 0,9% NaCl (vikt / volym) till förrådslösningen för att göra 10 ml. Bered en 640 pM arbetslösning genom att späda 1 ml av 6,4 mM 4-MU i 9 ml 1x analysbuffert (33,3 mM 2- (N-morfolino) etansulfonsyra (MES) och 4 mM CaCl2, pH 6,5).
OBS: Förbered 2x analysbuffert genom tillsats av 13 g av MES och 8 ml av en M CaCl2 till 992 ml destillerat vatten. Justera pH till 6,5 med användning av 10 M NaOH. Filtrera bufferten med användning av en steril cellulosaacetatfilter med porstorlek 0,2 um. Varning! Natriumhydroxid är frätande och kan orsaka kemiska brännskador på hud och ögon. Se till att full personlig skyddsutrustning är slitna. - Förbereda 5 ml av en rad av fyra-MU koncentrationer (dvs 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 & #181; M och 320 ^ M) genom en tvåfaldig serieutspädning av 640 ^ M 4-MU med användning 1x analysbuffert.
- Dispensera 50 pl av varje serieutspädning av 4-MU (dvs 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM, 320 pM och 640 pM) (två brunnar per utspädning) till en klar, 96- brunnars flatbottnad platta och 50 pl av 1x analysbuffert i de återstående brunnarna (som tjänar som råämnen för att mäta bakgrundssignaler).
OBS: De slutliga koncentrationerna av 4-MU i reaktionsvolymen (50 | il 4-MU + 50 ul 300 uM Munana) är 2,5 uM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM och 320 pM . - Bered en 2,5 mM MUNANA förrådslösning genom att rekonstituera 25 mg Muñana i 20 ml destillerat vatten. Blanda 0,72 ml 2,5 mM MUNANA med 5,28 ml 1x analysbuffert för erhållande av en 300 | iM Munana arbetslösning (tillräcklig volym för en platta). Täck röret med 300 | iM Muñana working lösning med aluminiumfolie och hålla den på is, om inte användas omedelbart. Kassera överblivna material.
OBS: 2,5 mM MUNANA förrådslösning kan lagras vid -20 ° C under en månad och måste användas inom en frysnings / upptiningscykel. De 4-MU och Munana lösningar är ljuskänsliga och måste skyddas från långvarig ljusexponering. - Tillsätt 50 | il av 300 | iM Munana till varje brunn, knacka försiktigt för att blanda och inkubera vid 37 ° C under 30 min. Täck plattan med en plattförslutning för att förhindra avdunstning.
OBS: Detta steg är att redogöra för bakgrunden fluorescens i NA hämningsanalysen. - Förbereda stopplösningen genom att blanda 11 ml absolut etanol med 2,225 ml av 0,824 M NaOH (tillräcklig volym för en platta).
- Tillsätt 100 | il stopplösning till varje brunn för att stoppa reaktionen och knacka försiktigt för att blanda.
- Läs plattan med användning av en fluorometer med en excitationsvåglängd inställning av 355 nm och en emissionsvåglängd inställning av 460 nm, som per tillverkarens anvisningar.
- Beräkna den genomsnittliga bakgrundssignalen med användning av fluorescenssignaler från alla brunnar som inte innehöll 4-MU. Subtrahera denna genomsnittliga bakgrundssignalen från var och en av brunnarna innehållande 4-MU och beräkna de genomsnittliga signalerna (RFU) för varje 4-MU-koncentration. Rita en standardkurva för RFU mot 4-MU-koncentration (^ M), såsom visas i figur 1a; en närbild linjär sektion av kurvan är visad i figur 1b.
- Visualisera handlingen i RFU mot 4-MU-koncentration (| iM) för att bestämma det linjära området och det optimala målsignalen; det linjära området är där fluorescenssignalen ökar i proportion till ökande koncentrationer av 4-MU på tomten, medan den optimala målsignalen är en godtycklig 4-MU-koncentration inom det linjära området.
OBS: Det linjära området och det optimala målsignalen är fluorometer specifik. Till exempel, fluorometern vid Melbourne WHOCCRRI har en linjär rad 20,5-40 pM 4-MU och en optimal målsignal av ~ 30 | iM 4-MU, vilket motsvarar ~ 1500 RFU.
2. Fastställande av NA aktiviteten av de virus
OBS: Influensavirus odlas till tillräckliga titrar i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler eller embryonerade hönsägg 8.
- Dispensera 120 mikroliter per brunn av outspädda odlade influensavirus i kolumn 1 och 60 mikroliter av 1x analysbuffert innehållande 0,1% NP-40 in i de återstående 11 kolumner i en 96-brunnars U-bottenplatta.
- Seriellt utföra två-faldig utspädning av virus över plattan (dvs överföra 60 | il från kolumn 1 till kolumn 2 och så vidare, upp till kolumn 11) med användning av en flerkanalspipett, lämnar kolonnen 12 som en blank innehållande endast 1x analysbuffert.
- Överföra 50 | il från var och en av brunnarna (utspädda virus och tomma) till en klar, 96-brunnars, flatbottnad platta.
OBS: Det är inte nödvändigt att cndra pipettspetsar om material överförs från kolonnen 12 genom till kolonn 1. - Lägga 50 mikroliter av 300 uM Munana (framställd enligt steg 1,4) per brunn och knacka försiktigt på plattan för att blanda. Inkubera plattan vid 37 ° C under 1 h. Täck plattan med en plattförslutning för att förhindra avdunstning.
- Tillsätt 100 | il stopplösning (framställd enligt steg 1,6) per brunn för att avsluta reaktionen och knacka försiktigt på plattan för att blanda.
- Läs plattan med hjälp av en fluorometer.
- Använd en excitationsvåglängd inställningen 355 nm och en våglängd inställning emission av 460 nm.
- Fastställa den genomsnittliga bakgrundssignalen baserad på fluorescensavläsningar i kolumn 12 och subtrahera den genomsnittliga bakgrundssignalen från varje brunn. Rita en graf över RFU mot virusspädningar.
OBS: Bakgrundsvärden för 100 | iM Muñana på WHOCCRRI Melbourne är vanligtvis mellan 50 och 120 RFU, men dessa kommer att variera beroende på fluorometer being används. - Visa plot av RFU mot virusspädningar för att bestämma mittpunkten av den linjära delen av kurvan för varje virus (figur 2). Använda den optimala målsignalen (bestämd i steg 1) som referenspunkt.
OBS: Detta bör överensstämma med det 4-MU linjära området för fluorometern bestämd enligt punkt 1 och kommer att ge den lämpliga koncentrationen av virus som skall användas i avsnitt 3.
3. Bedöma Virus Känslighet för NA-hämmare Använda NA Inhibition Assay
- Förbereda huvudlager av NA-inhibitorer vid koncentrationer av 300 pM.
- Förbereda 300 pM zanamivir (molekylvikt, MW = 332,32 g / mol) genom att lösa 5,0 mg av zanamivir i 50 ml 2x analysbuffert (66,6 mM MES och 8 mM CaCl2, pH 6,5).
- Förbereda 300 pM oseltamivirkarboxylat (D-tartrat; molekylvikt = 386,44 g / mol) genom att lösa 5,8 mg i 50 ml 2x analysbuffert.
- Förbereda300 pM peramivir trihydrat (MW = 382,45 g / mol) genom att lösa 5,7 mg i 50 ml 2x analysbuffert.
- Förbereda 300 pM laninamivir (MW = 346,34 g / mol) genom att lösa 5,2 mg i 50 ml 2x analysbuffert.
OBS: NA hämmarhuvudlagren kan lagras vid -20 ° C under 12 månader. Kontrollera MW NA-hämmare för att säkerställa en korrekt vikter och volymer används i beredning. Oseltamivirkarboxylat är den aktiva föreningen av prodrugen oseltamivir fosfat. Därför bör endast oseltamivirkarboxylat användas i NA hämningsanalys.
- Från masterlager, förbereda arbets lager av tiofaldiga seriespädningar av NA-inhibitorer i 50 ml centrifugrör vid koncentrationer av 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM, och 30 tusen nM i 2x analys buffert (66.6 mM MES och 8 mM CaCl2, pH 6,5); Detta är för användning i flera analyser.
OBS: De slutliga koncentrationerna av NA-inhibitorer i reaktions volume (50 | il av virusspädning + 50 mikroliter av NA-hämmare + 50 | il av 300 | iM Munana) är 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, och 10 tusen nM, respektive. Den slutliga koncentrationen innefattar inte de 100 pl av stopplösning. Lagra alla NA hämmare utspädningar vid 2-8 ° C. Utgångsdatumet är den samma som för master lager. - Förbereda de virusspädningar i 1 x analysbuffert innehållande 0,1% NP-40 ytaktivt medel i ett 96-deep-well block. Använda virusspädningar baserade på NA-aktivitetsanalysresultat erhållna från avsnitt 2. använda en total volym av 2 ml per virus för att testa fyra NA inhibitorer.
OBS: Förbered två brunnar (1 ml per brunn) per virus i en 96-deep-well block. Exempel på virusspädningar för VIRUS 1, 2, och 3 visas i tabell 1. - Dispensera den erforderliga volymen av NA-inhibitorer (framställda enligt steg 3,2) in i en 8 djup och reservoar. Därifrån, dispensera 50 | il av NA-inhibitorer vid utspädningar varierande från 0 nM (2x analys bUffer enbart) för att 30 tusen nM i raderna A till H i en klar, 96-brunnars, flatbottnad platta.
OBS: plattslayouten visas i fig 3. - Lägga 50 mikroliter av utspädda test virus per brunn till kolumnerna 1-11 och 50 | il per brunn av 1 x analysbuffert endast till kolonn 12. Knacka försiktigt plattan för att blanda och inkubera vid rumstemperatur i 45 min. Täck plattan med en plattförslutning för att förhindra avdunstning.
- Lägga 50 mikroliter av 300 uM Munana (framställd enligt steg 1,4) per brunn och knacka försiktigt på plattan för att blanda. Inkubera plattan vid 37 ° C under 1 h. Täck plattan med en plattförslutning för att förhindra avdunstning.
- Tillsätt 100 | il stopplösning (framställd enligt steg 1,6) till varje brunn och knacka försiktigt på plattan för att blanda.
- Läs plattan med hjälp av en fluorometer.
- Använda en exciteringsvåglängd av 355 nm och en emissionsvåglängd av 460 nm, såsom beskrivits tidigare.
4. Beräkning avIC50-Värden
OBS! JASPR v1.2 är kurva åtsittande programvara som gör beräkningen av IC 50-värden. Programvaran har utvecklats av influensa Division vid CDC, Atlanta, USA. Mjukvaran utnyttjar ekvationen: V = Vmax x (1 - ([I] / (Ki + [I]))), där Vmax är den maximala graden av metabolism, [I] är inhibitorkoncentrationen, V är responsen hämmas, och Ki är IC50 för hämningskurvan.
- Kopiera och klistra in rådata som matas ut av fluorometern till ett kalkylblad i en 12-kolonn plattformat (96-brunn), börjar med cell A1.
OBS: Rådata från varje efterföljande platta måste vara förskjutna med en tom rad. Om varje virus har testats mot fyra NA inhibitorer, klistra in rådata i en uppsättning av fyra (med en tom rad mellan varje platta). - Öppna anpassningsprogrammet och click på "Experiment" -fliken. Välj "Alternativ 2-drogen Fluoro 11 Samples."
- Klicka på fliken "Alternativ" och kryssa för "Skapa grafer."
- Klicka på "Alternativ" igen och klicka på "New Key" -fliken. Spara "inhibition_key" CSV-fil i samma mapp som rådata kalkylark.
- I inhibition_key filen lista alla provnamn under ID. Varje prov namn måste vara unikt.
- Om fyra NA-hämmare testades sätter utrymmen för ytterligare två rader nedanför Oseltamivir och skriv in "peramivir" och "Laninamivir." Spara ändringar som gjorts i inhibition_key filen.
- Återgå till "jaspr v 1,2-Inhibition Curve passande" fönstret och välj rådatafilen som "Experiment File" och inhibition_key som "Key File". Kör analysen. Spara resultaten i .csv och .pdf format.
OBS: Programvaran kommer automatiskt att rita en hämningskurva (RFU agaiNST NA inhibitorkoncentrationer), såsom visas i fig 4. Programmet beräknar också IC50-värden för varje virus mot en individ NA inhibitor (Figur 4). Dessutom JASPR presenterar de IC50-värden och signal-till-bakgrund (S / B) -förhållande i kalkylbladsformat. Bakgrundsvärdena kan skilja sig från labb till labb beroende på fluorometern används. På Melbourne WHOCCRRI värdena bakgrunden för 100 | iM Munana intervallet från 50 till 120 RFU. För en tillförlitlig IC 50-värde, är en S / B-förhållande av ≥10 föredragen, även om ett förhållande på mindre än 10 är fortfarande acceptabelt, speciellt för mutanta virus som har mycket låg NA-aktivitet. - Inspektera IC 50 värden och kurvformer som genereras av programvaran. Alla datapunkter ska falla på eller nära kurvan; Om de inte gör det, upprepa NA hämningsanalysen.
OBS: För virus som visar ovanligt höga IC 50-värden, bör analysen att upprepaed för att bekräfta resultatet.
Representative Results
Med hjälp av standardiserade riktlinjer för rapportering från WHO arbetsgrupp för övervakning av influensa antivirala Känslighet 9, är känsligheten hos influensavirus till NA-hämmare rapporteras med villkoren normal inhibition (NI), minskad inhibition (RI), och kraftigt reducerad inhibition (HRI) . NI virus är de med IC50-värden mindre än 10-faldig jämfört med referensmedian IC 50 för influensa A-virus (eller mindre än 5-faldigt för influensa B-virus). RI-virus är de med IC50-värden mellan 10- och 100-faldigt över referensmedian IC 50 för influensa A-virus (eller 5- och 50-faldig för influensa B). HRI virus är de med IC50-värden av 100-faldigt över referensmedian IC 50 för influensa A-virus (eller över 50-faldigt för influensa B-virus); se tabell 2.
IC50-värden för A (H1N1) pdm09, A (H3N2), och B Yamagata / B Victoria virus beräknas och uppdateras årligen på Melbourne WHOCCRRI att reflektera mindre förändringar i de IC50-värden på cirkulerande influensastammar till de NA-hämmare (tabell 3). Median IC50-värden i influensa A (H1N1) pdm09 virus är nästan samma över de fyra NA inhibitorer, men median zanamivir och laninamivir IC50-värden för A (H3N2) virus är 2- till 4-faldigt högre jämfört med oseltamivir och peramivir IC50-värden (tabell 3). Median oseltamivir IC 50 värde för influensa B-virus är i allmänhet 5- till 10-faldigt högre än zanamivir, peramivir, och laninamivir IC50-värden (tabell 3).
NA inhibitionsanalysen är en fenotypisk analys som inte ger information om genetiska förändringar Associated med RI eller HRI. Därför är det viktigt att genetisk analys utförs efter identifiering av virus med RI eller HRI. På Melbourne WHOCCRRI, är NA-genen av varianter analyserades med användning Sånger sekvensering och pyrosekvensering. En representativ lista av aminosyrasubstitutioner som kan hittas i NA-genen från virus med RI och HRI varianter presenteras i tabell 4. En mer omfattande förteckning över aminosyrasubstitutioner som kan förändra NAI känslighet finns även på WHO: s webbplats 10.
Figur 1: RFU mot 4-MU-koncentration. (A) Standardkurva för RFU mot 4-MU-koncentration (^ M). Den streckade rutan visar det linjära området för 4-MU för fluorometern. Fluorescenssignalerna över det linjära området kan vara mättad, och därför, eventuella sköpcentret förändringar i fluorescens kan inte detekteras genom fluorometern. (B) närbild linjär sektion för standardkurvan enligt figur 1a för identifiering av den "optimala målsignalen." Fluorometern vid Melbourne WHOCCRRI har ett linjärt område av från 2,5 till 40 ^ M 4-MU och en optimal målsignal av ~ 30 | iM 4-MU, vilket motsvarar ~ 1500 RFU. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på de NA aktivitetskurvor av influensavirus. Den genomsnittliga bakgrundsvärdet på 50,61 RFU har subtraherats från varje utspädning punkt på NA aktivitetskurvorna. Pilarna indikerar den lämpliga virusutspädning för användning i NA hämningsanalysen för varje virus. För att underlätta preprberedelse av virusspädningar, kan man välja att utföra en 1/100 utspädning för VIRUS 3 i stället för en 1/96 spädning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Plate layout för installationen av NA hämningsanalys. Varje platta innefattar den sista kolumnen, som fungerar som en negativ kontroll som inte innehåller någon virus utan endast 1x analysbuffert (AB), NA-inhibitor, Munana, och stopplösning. OBS: JASPR använder avläsningar från kolumn 12 av varje platta för att bestämma den genomsnittliga blank signal som används vid beräkningen av IC50-värdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på en hämningskurva och IC 50-värde av en A (H1N1) pdm09 virus, A / Perth / 82/2015. Den JASPR programvara presenteras hämningskurvan som fluorescens (RFU) mot ökande koncentration (nM) av NA-hämmare, med varje punkt passning i kurvan. Baserat på hämningskurvan, är IC 50 värdet bestämdes som den koncentration av NA-inhibitor för att minska 50% av viruset NA-aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Virus | Virusutspädning som krävs | 1x analysbuffertvolym (| il) | Ytaktivt-Amps-NP-40 (10%) (ml) | Virus volym (ml) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
Tabell 1: Framställning av virusspädningar för VIRUS 1, 2, och 3 i NA hämningsanalys.
| Virus typ / subtyp / härstamning | normal inhibering | reducerad hämning | Starkt reducerad hämning |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A (H1N1) pdm09 | <10-faldig | 10-100-faldigt | > 100-faldigt |
| A (H3N2) | &# 60; 10-faldigt | 10-100-faldigt | > 100-faldigt |
| B Yamagata och B Victoria | <5-faldigt | 5-50-faldig | > 50-faldigt |
Tabell 2: WHO Antiviral Arbetsgruppen rekommenderade riktlinjer för klassificering av influensavirus mottaglighet för NA-hämmare.
| Virus typ / subtyp / härstamning | N | zanamivir | oseltamivir | peramivir | Laninamivir |
| Median (intervall) IC 50 nM | Median (intervall) IC 50 nM | Median (intervall) IC 50 nM | Median (intervall) IC 50 nM | ||
| A (H1N1) pdm09 | 1326 | 0,42 (0,1-3,43) | <td> 0,36 (0,01-3,48)0,19 (0,07-1,60) | 0,55 (0,05-2,29) | |
| A (H3N2) | 1654 | 0,9 (0,11-4,0) | 0,38 (0,01-3,65) | 0,33 (0,12-3,06) | 1,38 (0,01-9,38) |
| B Yamagata och B Victoria | 1115 | 2,2 (1,24-10,72) | 15,12 (2.39-70.75) | 1,36 (0,57-6,67) | 2,89 (1,62-9,15) |
Tabell 3: Median IC 50 och IC 50 spektrum av normala hämning (NI) virus från 2015 härleds i WHO CCRRI, Melbourne.
| Aminosyrasubstitution | Typ / subtyp / härstamning | IC 50 faldiga förändringen compared till referensmedian IC50-värden. | |||
| zanamivir | oseltamivir | peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A (H1N1) pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A (H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1220 (HRI) | 87 (HRI) | 17.724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
Tabell 4: Representativa lista över aminosyrasubstitutioner kopplade till reducerad hämning (RI) eller mycket reducerad hämning (HRI) till NA-hämmare.
| Problem | Möjlig orsak (er) | Lösning (ar) |
| Ingen eller låg NA aktivitet | Inget virus var närvarande eller låg virusutbyte. | Kliniskt prov måste odlas i cellinjer (dvs Madin-Darby Canine Kidney-celler) eller i embryonerade hönsäggtill en högre virusbelastning för användning vid NA hämningsanalys. |
| Vissa muterade virus har extremt låg NA aktivitet trots vid hög virusbelastning. | Använd snyggt viruskoncentration för testning. Lägre pH analysbuffert (t.ex. pH 5,3) kan användas. Dock måste försiktighet iakttas när man jämför data. | |
| Ingen eller låg NA-aktivitet i NA-inhiberingsanalys | Inget virus tillsattes. | Åter späd viruset. Säkerställa viruset sätts direkt in i 1x analysbuffert. |
| Fel virus utspädning användes. | Upprepa NA aktivitetsanalys. | |
| Otillräcklig inkubationstid. | Se till att inkubationstiden följs. | |
| Datapunkter faller utanför IC 50 kurvan | Korskontaminering av NA inhibitor av högre koncentration. | Se till att tips är inte i kontakt med NA inhibitor vid dispensering utspädda virus in i 96 brunnar. |
| Om en 8 djup brunn reservoar användes, kassera och åter dispensera NA inhibitorkoncentrationer i en ny 8 djup brunn reservoar. | ||
| Volymen av NA-inhibitor eller Munana eller utspätt virus tillsattes inte lika i varje brunn. | Upprepa analysen med en kalibrerad flerkanalig pipett. Säkerställa lika stor volym av varje reagens dispenseras till varje brunn. | |
| Ovanligt höga IC50-värden | Alltför hög koncentration av virus tillsattes. | Upprepa NA aktivitetsanalys och NA hämningsanalys. |
| Testprov innehöll blandningar av influensa A och influensa B. | Utför realtids-PCR för att identifiera förekomst av virusblandningar. | |
| Bakteriell kontaminering i provet | Kultur virus i sterilt tillstånd med närvaron av antibiotikum. | |
| Hög bakgrundsfluorescenssignal | Munana substratet kan försämras med tiden. | Använd en ny sats av Munana subtrate. |
| Detektion av fluorescens från angränsande brunnar. | Använda svarta 96-brunnars flatbottnade plattor |
Tabell 5: Felsökning för potentiella problem i NR hämningsanalys.
Discussion
Den globala övervakning av influensavirus mottaglighet för NA-inhibitorer är närvarande genomförs av ett antal laboratorier med användning av antingen fluorescerande eller kemiluminescerande NA inhibitionsanalyser 11, 12. Den fluorescerande analysen mer vanligt förekommande än den kemiluminiscenta analysen. Även om båda analyserna är robusta och reproducerbar, IC50-värden som erhållits från fluorescensbaserad analys är ofta högre än den kemiluminescens-baserad analys, vilket gör en direkt jämförelse av data från de två analyserna svåra 13. Även med användning av samma protokoll, kan data som genereras från ett laboratorium variera från en annan. På grund av dessa variationer mellan laboratorier, WHO arbetsgrupp för övervakning av influensa antivirala känslighet fram en riktlinje för att hjälpa till mellan laboratorier jämförelser. I stället för att jämföra de absoluta IC 50-värden, denna riktlinje användningsa jämförelse baserad på IC 50 faldig skillnad till median IC 50 av de influensavirus NI testade i varje enskilt laboratorium. Möjligheten att jämföra data från de fem samverkande centra har resulterat i den årliga publiceringen av global influensa antivirala mottaglighet uppgifter 2, 3, 4. Tillgängligheten av den stora mängden av influensa känslighetsuppgifter i det offentliga rummet tillåter forskare att jämföra IC50 data från dessa studier med det som genereras i sina egna laboratorier.
Andra NA hämningsanalyser som antar ett liknande koncept är också kommersiellt tillgängliga. Dessa kommersiella kit som innehåller färdiga att använda reagenser (NA-hämmare inte ingår) är lika reproducerbara. Emellertid är in-house NA inhibitionsanalys väsentligen billigare än de kommersiella kit, eftersom majoriteten av reagensen kan göras i-hus istörre kvantiteter och Muñana substratet, som tidigare består den huvudsakliga kostnaden för analysen, kan nu köpas från olika källor till konkurrenskraftiga priser. Kostnaden för att testa ett influensaisolat per drogen är ca $ 1 (USD). På Melbourne WHOCCRRI har förbättringar gjorts till in-house NA inhibitionsanalys efter införlivandet av en robotplattform för de flytande komponenterna hanterings av analysen. Bortsett från den manuella framställningen av virusspädningar, är majoriteten av de förfaranden som utförs med hjälp av vätskehanteringsrobot. Inte bara detta minimera manuell hantering, men det ökar också antalet analyser som kan köras på en dag.
Även NA inhibitionsanalysen är mycket robust, finns det ett antal viktiga steg som måste kompletteras med ytterligare vård. Först, varje oegentlighet vid inhibitorkoncentrationer NA kan skifta inhibitionskurvor och IC50-värdena; Därför bör uppmärksamhet varabetalas vid upprättandet inhibitorkoncentrationer NA. För det andra, exakt pipettering och exakt inkubationsperioder är avgörande för att upprätthålla konsekventa resultat över analyser; Detta kan uppnås genom att använda kalibrerade pipetter och timers. Införandet av kontrollvirus i varje analys möjliggör också övervakning av analysprestanda från analys till analys och över långa tidsperioder. Tredje, eftersom NA enzymaktiviteten hos säsongs influensavirus är optimal vid pH 6,5, är viktigt rätt pH i analysbuffert. Vissa rapporter har funnit att användningen av lägre pH-betingelser maj förbättrar identifiering av influensavarianter, såsom A (H7N9) -varianten som innehöll R292K mutationen 14, 15. Kommer emellertid modifiering av pH för analysbufferten skifta IC50-värdena, och detta kan komplicera jämförelsen av data inom laboratorier och mellan laboratorier. Andra modifieringar och felsökning som kan vara performed listas i tabell 5.
NA-hämmare är den enda klassen godkända antivirala medel som för närvarande effektiva mot cirkulerande influensavirus. Fram till andra antivirala klasser blir tillgängliga för klinisk användning, kommer den antivirala känsligheten övervakning av cirkulerande influensavirus fokuseras på NA-hämmare ensam. På grund av enkelheten och reproducerbarhet av resultat, användning av NA-inhiberingsanalys bedöma influensavirus mottaglighet för NA-hämmare kommer att fortsätta.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
The Melbourne WHO Collaborating Centre för referens och forskning om influensa stöds av den australiska regeringen Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
| Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
| 96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96-well deep plates, 2.0 mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume) | |
| Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
| Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Incubator set at 37 °C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
| Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |
References
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
