Summary
We beschrijven het gebruik van een fenotypische fluorescentie-gebaseerde neuraminidase remming test om de gevoeligheid van influenza A en B virussen beoordelen in de neuraminidase-remmer klasse van antivirale middelen.
Abstract
De neuraminidase (NA) remmers zijn de enige klasse van antivirale middelen goedgekeurd voor de behandeling en preventie van influenza die effectief zijn tegen momenteel circulerende stammen zijn. In aanvulling op het gebruik ervan bij de behandeling van seizoensgebonden influenza, hebben de NA-remmers zijn opgeslagen door een aantal landen voor gebruik in het geval van een pandemie. Het is daarom belangrijk om de gevoeligheid van circulerende influenzavirussen om deze klasse van antivirale middelen te controleren. Er zijn verschillende assays die kunnen worden gebruikt om de gevoeligheid van influenzavirussen de NA inhibitors te beoordelen, maar het enzym remmingstesten met behulp van een fluorescent substraat of een chemiluminescerend substraat zijn de meest gebruikte en aanbevolen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een op fluorescentie gebaseerde assay influenzavirus gevoeligheid beoordelen NA remmers. De assay is gebaseerd op het NA-enzym splitsing van de 2 '- (4-methylumbelliferyl-) -α-D-N -acetylneuraminic acid (Muñana) Substraat naar het fluorescente product 4-methylumbelliferon (4-MU) vrijgeven. Derhalve wordt het remmende effect van een NA-remmer op het influenzavirus NA bepaald op basis van de concentratie van het NA remmer die vereist is om 50% vermindering van de activiteit NA, gegeven als een IC50-waarde.
Introduction
Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn de twee belangrijkste oppervlakte glycoproteïnen van influenza A en B virussen. HA bindt aan de siaalzuur-galactose van celoppervlak glycoproteïnen of glycolipiden, terwijl de NA vrijgeeft virus door splitsing van de siaalzuur van galactose aan het celoppervlak 1. De NA-remmers zijn een klasse van influenza antivirale middelen die rationeel ontworpen om strak te binden aan de NA enzymatisch actieve plaats, waardoor de introductie en verspreiding van het virus nageslacht voorkomen. Oseltamivir en zanamivir zijn twee NA-remmers die in veel landen zijn erkend wereldwijd voor de behandeling en preventie van influenza. In de afgelopen jaren, twee extra NA-remmers, peramivir en laninamivir, zijn goedgekeurd voor gebruik in een beperkt aantal landen. Screening van influenzavirussen op gevoeligheid voor remmers NA en de identificatie van mutaties die resistentie zijn belangrijk bij het bepalen en bewaken van de effectiveness van deze klasse van antivirale middelen.
In de laatste 16 jaar is de fluorescentie gebaseerde NA remmingstest routinematig uitgevoerd bij de WHO Samenwerkingscentrum voor onderzoekscollectie Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) aan de veranderende trend antivirale gevoeligheid bij circulerende influenzavirussen controleren. Jaarlijks worden meer dan 2.000 influenzavirussen getest op antivirale gevoeligheid. In de meeste seizoenen influenza,> 98% van de virussen zijn gevoelig voor alle vier de NA-remmers 2, 3, 4, hoewel tijdens de 2007-2008 noordelijk halfrond influenza seizoen, is er een sterke stijging van het aantal voormalige seizoensgebonden A (H1N1) virussen was dat de gevoeligheid was gereduceerd tot oseltamivir 5. Deze groep van virussen, die de NA aminozuursubstitutie H275Y bevatte, verspreid naar de rest van de wereld aan het einde van 2008, waarmee oseltamivir inappropriaten wereldwijd voor de behandeling van dit virus. De overgrote meerderheid van momenteel circulerende influenza B, influenza A (H3N2) en influenza A (H1N1) pdm09 stammen gevoelig voor oseltamivir, maar door clusters van A (H1N1) pdm09 varianten die het NA aminozuursubstitutie H275Y dat het karakter verminderde oseltamivir en peramivir gevoeligheid, zijn gemeld in verschillende delen van de wereld 6, 7.
Vanwege de noodzaak van een voldoende hoge titer virus moeten klinische monsters (met inbegrip van dierlijke nasale wassingen) worden doorgekweekt in zowel celkweek of bevruchte kippeneieren vóór antivirale gevoeligheidstests. De NA remmingstest beschreven in dit artikel kan worden onderverdeeld in drie delen:
Bepalen van het lineaire bereik voor het fluorescent product 4-methylumbelliferon (4-MU) op een bepaalde fluorometer
Vanwege de inherente verschillen tussen fluorometers, tHij lineaire bereik voor het fluorescerende eindproduct, 4-MU, en de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU), te worden vastgesteld. Zodra het lineaire bereik van 4-MU wordt gebracht, wordt de optimale doelsignaal geselecteerd, waarop de concentratie van de influenzavirussen wordt aangepast in de NA activiteitstest. Eenmaal voltooid voor een bepaald fluorometer, dient deze niet te worden herhaald.
Het bepalen van de NA activiteit van de virussen
De NA activiteitstest is een eenvoudige test die de toevoeging van de 2 'omvat - (4-methylumbelliferyl-) -α-D-N -acetylneuraminic acid (Muñana) substraat serieel verdunde virus. De hoeveelheid fluorescerende eindproduct 4-MU gevormd door de splitsing van Muñana door het NA wordt gemeten met een fluorometer. De geschikte virusverdunning gebruiken in het NA-remmingstest wordt geselecteerd door het uitzetten van fluorescentie-eenheden tegen virusverdunning. Van de sigmoïdale curve geproduceerd, dient het middelpunt van het lineaire gedeelte overeen methet 4-MU lineaire bereik van de fluorometer bepaald deel 1 en de geschikte concentratie van virussen in kennis worden in deel 3.
Het beoordelen virus gevoeligheid voor remmers met NA NA remmingstest
Om de gevoeligheid van virussen een bepaalde NA remmer beoordelen, zijn virussen in het verdunning bepaald in punt 2 geïncubeerd met een reeks NA remmerconcentraties. Na een verdere incubatie met Munana, wordt de 4-MU gevormd door ongeremde virussen gemeten in RFU door de fluorometer. Het remmende effect van de remmer op de NA NA enzymactiviteit van een virus wordt berekend volgens de NA remmerconcentratie nodig te verminderen 50% van het NA-activiteit, gegeven als een IC50-waarde.
Protocol
1. Het bepalen van de lineaire bereik van fluorescent product 4-MU op een Fluorometer
- Bereid 10 ml 6,4 mM 4-MU voorraadoplossing door het oplossen van 11,3 mg 4-MU in 5 ml absolute ethanol. Voeg 5 ml 0,9% NaCl (w / v) aan de voorraadoplossing tot 10 ml te maken. Bereid een 640 uM werkoplossing door verdunnen van 1 ml 6,4 mM 4-MU in 9 ml 1 x assay-buffer (33,3 mM 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) en 4 mM CaCl2, pH 6,5).
OPMERKING: Bereid de 2x assaybuffer door toevoeging van 13 g MES en 8 ml 1 M CaCl 2-992 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 6,5 onder toepassing van 10 M NaOH. Filtreer de buffer met een steriele celluloseacetaatfilter poriegrootte 0,2 urn. Voorzichtigheid! Natriumhydroxide is bijtend en kan chemische brandwonden op de huid en de ogen veroorzaken. Ervoor zorgen dat de volledige persoonlijke beschermingsmiddelen is versleten. - Bereid 5 ml van een reeks van 4-MU concentraties (dat wil zeggen, 5 uM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 & #181, M en 320 pM) door een tweevoudige seriële verdunning van 640 uM 4-MU behulp 1x testbuffer.
- Afzien van 50 ul van elke seriële verdunning van 4-MU (dwz, 5 uM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM, 320 pM en 640 pM) (twee putjes per verdunning) in een heldere, 96- putjes met vlakke bodemplaat en 50 pl testbuffer 1x in de resterende putjes (die dienen als blanco te achtergrondsignalen meten).
OPMERKING: De eindconcentraties van 4-MU in het reactievolume (50 gl 4-MU + 50 pl 300 pM Muñana) zijn 2,5 uM, 5 uM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM en 320 pM . - Bereid een 2,5 mM voorraadoplossing Muñana door reconstitutie 25 mg Muñana in 20 mL gedestilleerd water. Meng 0,72 ml 2,5 mM MUNANA met 5,28 ml 1X bepalingsbuffer een 300 pM Muñana werkoplossing (voldoende volume van een plaat) te verkrijgen. Bedek de buis met 300 uM Muñana working oplossing met aluminiumfolie en houd het op ijs, tenzij onmiddellijk gebruikt. Gooi overgebleven materialen.
LET OP: De 2.5 mM MUNANA voorraad oplossing kan gedurende 1 maand worden bewaard bij -20 ° C en moet worden gebruikt binnen één vries / dooi-cyclus. De 4-MU en Muñana oplossingen zijn lichtgevoelig en moet worden beschermd tegen langdurige blootstelling aan licht. - Voeg 50 ul van 300 pM Muñana aan elk putje tik zachtjes te mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Bedek de plaat met een plaatafdichter om verdamping te voorkomen.
OPMERKING: Deze stap is die overeenkomt met het achtergrondfluorescentie in het NA-remmingstest. - Bereid de stopoplossing door mengen van 11 ml absolute ethanol met 2,225 ml 0,824 M NaOH (voldoende volume van een plaat).
- Voeg 100 pl stopoplossing aan elk putje om de reactie te stoppen en tik voorzichtig mengen.
- Lees de plaat met behulp van een fluorometer met excitatiegolflengte instelling van 355 nm en een emissiegolflengte van 460 nm instelling, zoals per instructies van de fabrikant.
- Bereken het gemiddelde achtergrondsignaal behulp fluorescentiesignalen uit alle putjes die geen 4-MU. Trek de gemiddelde achtergrondsignaal uit elk van de putjes met 4-MU en bereken het gemiddelde signaal (RFU) per 4-MU-concentratie. Plot een standaardcurve van RFU tegen 4-MU-concentratie (uM), zoals getoond in figuur 1a; een close-up lineaire gedeelte van de kromme is weergegeven in figuur 1b.
- Visualiseren de plot van RFU tegen 4-MU-concentratie (uM) aan het lineaire gebied en het optimale doelsignaal te bepalen; het lineaire gebied is waar het fluorescentiesignaal evenredig toeneemt met toenemende concentraties van 4-MU op perceel, terwijl de optimale doelsignaal een willekeurig 4-MU concentratie binnen het lineaire bereik.
OPMERKING: Het lineaire bereik en de optimale doelsignaal zijn fluorometer-specifiek. Bijvoorbeeld de fluorometer op de Melbourne WHOCCRRI een lineaire reeks 20,5-40 uM 4-MU en een optimale doelsignaal van -30 uM 4-MU, wat overeenkomt met ~ 1500 RFU.
2. Bepalen NA activiteit van de virussen
LET OP: Influenza virussen worden gekweekt om voldoende titers in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen of bevruchte kippeneieren 8.
- Afzien 120 ul per putje verdunde gekweekte influenzavirussen in kolom 1 en 60 pl 1x testbuffer bevattende 0,1% NP-40 in de resterende 11 kolommen van een 96 putjes U bodemplaat.
- Oogpunt gebeurt tweevoudige verdunning van de virussen over de plaat (dwz overdracht 60 ul van kolom 1 tot kolom 2, enzovoort, tot kolom 11) met een multichannel pipet, waarbij kolom 12 als een blanco met alleen 1 x testbuffer.
- Breng 50 pl van elk van de putjes (verdunde virussen en blanco's) in een heldere, 96 putjes, platte bodemplaat.
NB: Het is niet nodig om te change pipetpunten als materialen worden van kolom 12 tot kolom 1. - Voeg 50 ul van 300 pM Muñana (bereid volgens stap 1.4) per well en zachtjes op de plaat om te mengen. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. Bedek de plaat met een plaatafdichter om verdamping te voorkomen.
- Voeg 100 pi stopoplossing (bereid volgens stap 1.6) per putje om de reactie te beëindigen en zachtjes op de plaat om te mengen.
- Lees de plaat met behulp van een fluorometer.
- Met een excitatiegolflengte instelling van 355 nm en een emissiegolflengte van 460 nm instelling.
- Bepaal het gemiddelde achtergrondsignaal basis van de fluorescentie metingen in kolom 12 en aftrekken van het gemiddelde achtergrondsignaal uit elk putje. Maak een grafiek van de RFU tegen virus verdunningen.
OPMERKING: De achtergrond waarden van 100 uM Muñana op de WHOCCRRI Melbourne zijn meestal tussen de 50 en 120 RFU, maar deze zullen verschillen afhankelijk van de fluorometer being gebruikt. - Bekijk de plot van RFU tegen virusverdunningen het middelpunt van het lineaire gedeelte van de curve voor elk virus (figuur 2) te bepalen. Met de optimale doelsignaal (bepaald in stap 1) als referentiepunt.
Opmerking: Dit moet overeenstemmen met het 4-MU lineaire bereik van de fluorometer bepaald deel 1 en zorgen voor de juiste concentratie van virussen voor gebruik in hoofdstuk 3.
3. Het beoordelen Virus gevoeligheid voor remmers NA De NA-remmingstest
- Bereid meester voorraden NA remmers bij concentraties van 300 uM.
- Bereid 300 uM zanamivir (molecuulgewicht, MW = 332,32 g / mol) door het oplossen van 5,0 mg zanamivir in 50 ml 2x assaybuffer (66,6 mM MES en 8 mM CaCl2, pH 6,5).
- Bereid 300 uM oseltamivircarboxylaat (D-tartraat; MW = 386,44 g / mol) door het oplossen van 5,8 mg in 50 ml 2x assaybuffer.
- Bereiden300 pM peramivir trihydraat (MG = 382,45 g / mol) door het oplossen van 5,7 mg in 50 ml 2x assaybuffer.
- Bereid 300 uM laninamivir (MG = 346,34 g / mol) door het oplossen van 5,2 mg in 50 ml 2x assaybuffer.
Opmerking: Het NA remmer grote voorraden kunnen 12 maanden bewaard bij -20 ° C. Controleer de MW van de NA-remmers te zorgen voor de juiste gewichten en volumes worden gebruikt in de reconstructie. Oseltamivircarboxylaat de werkzame stof met de prodrug oseltamivirfosfaat. Daarom moet slechts oseltamivircarboxylaat worden toegepast bij de NA remmingstest.
- Vanuit de master voorraden, bereiden werkvoorraden van tienvoudige seriële verdunningen van de NA inhibitoren in centrifugebuizen van 50 ml bij concentraties van 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM en 30000 nM in 2x assay buffer (66,6 mM MES en 8 mM CaCl2, pH 6,5); Dit is voor meerdere assays.
OPMERKING: De eindconcentraties van NA remmers bij de reactie volume (50 pL virusverdunning + 50 pl remmer NA + 50 pl 300 pM Muñana) 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, en 10.000 nM. De eindconcentratie omvat niet de 100 pl stopoplossing. Sla alle NA remmers verdunningen bij 2-8 ° C. De vervaldatum is dezelfde als die van de master voorraden. - Bereid het virus verdunningen in 1 x assaybuffer die 0,1% NP-40 oppervlakteactieve stof in een 96 diepe putjes block. Gebruik virus verdunningen op basis van het NA activiteitstest resultaten afgeleid volgens punt 2. Gebruik een totaalvolume van 2 ml per virus vier NA remmers te testen.
OPMERKING: Maak twee wells (1 ml per putje) per virus in een 96 diepe putjes block. Voorbeelden van virus verdunningen VIRUS 1, 2 en 3 zijn weergegeven in tabel 1. - Bereid het gewenste volume NA remmers (bereid volgens stap 3.2) in een 8 deep-well reservoir. Van daaruit af 50 pl NA remmers in verdunningen variërend van 0 nM (2x assay bUffer) om 30.000 nM in rijen A tot H in een heldere, 96 putjes, platte bodemplaat.
OPMERKING: De plaatindeling is weergegeven in figuur 3. - Voeg 50 ul verdund testvirussen per putje kolommen 1-11 en 50 ul per putje van 1 x assaybuffer alleen kolom 12. Tik voorzichtig de plaat te mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Bedek de plaat met een plaatafdichter om verdamping te voorkomen.
- Voeg 50 ul van 300 pM Muñana (bereid volgens stap 1.4) per well en zachtjes op de plaat om te mengen. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. Bedek de plaat met een plaatafdichter om verdamping te voorkomen.
- Voeg 100 pi stopoplossing (bereid volgens stap 1,6) aan elk putje en de plaat tik zachtjes te mengen.
- Lees de plaat met behulp van een fluorometer.
- Met een excitatiegolflengte van 355 nm en een emissiegolflengte van 460 nm, zoals hierboven beschreven.
4. Berekening vanIC 50 Waarden
OPMERKING: De JASPR v1.2 is curveverbinding software die het berekenen van IC50 waarden mogelijk maakt. De software werd ontwikkeld door het Influenza Division aan de CDC, Atlanta, USA. De software maakt gebruik van de vergelijking: V = Vmax x (1 - ([I] / (K + [I]))), waarbij Vmax is de maximale snelheid van het metabolisme, [I] is de remmerconcentratie, V de reactie geremd en Ki is de IC50 voor de remming curve.
- Reacties De ruwe gegevens uitgevoerd door de fluorometer in een spreadsheet in een 12-kolom plaatformaat (96 putjes), beginnend met cel A1.
OPMERKING: Ruwe data van elke volgende plaat moet worden gespreid met een lege rij. Als elk virus werd getest tegen vier NA remmers Plak de ruwe gegevens in een set van vier (een lege rij tussen elke plaat). - Open de fitting software en click op het tabblad "Experiment". Kies "Alternatief 2-drug Fluor 11 Samples."
- Klik op het tabblad "Opties" en vink "grafieken genereren."
- Klik op de "Opties" weer en klik op het tabblad "Nieuwe sleutel". Sla de "inhibition_key" CSV-bestand in dezelfde map als de ruwe data spreadsheet-bestand.
- In de inhibition_key bestand, een lijst van alle monster namen onder de ID. Elke naam monster moet uniek zijn.
- Als vier NA remmers werden onderzocht, spaties twee extra rijen onder oseltamivir en type in "Peramivir" en "Laninamivir." Sla de wijzigingen in het inhibition_key bestand.
- Terug naar de "jaspr v 1.2-Remming Curve fitting" en selecteer de ruwe data bestand als "Experiment File" en inhibition_key als de "Key File." Voer de analyse. Sla de resultaten in .csv en .pdf-formaten.
OPMERKING: De software zal automatisch een remming curve plotten (RFU against NA remmerconcentraties), zie figuur 4. Het programma berekent ook IC50 waarden voor elk virus tegen particulier NA remmer (figuur 4). Bovendien JASPR presenteert de IC50 waarden en de signaal-achtergrond (S / B) -verhouding een spreadsheet. De achtergrond waarden kunnen verschillen van lab tot lab, afhankelijk van de fluorometer gebruikt. Bij de Melbourne WHOCCRRI, de achtergrond-waarden voor 100 uM Munana bereik van 50 tot 120 RFU. Voor een betrouwbare IC50 waarde, wordt een S / B-verhouding van ≥10 voorkeur, hoewel een verhouding van minder dan 10 nog acceptabel, in het bijzonder voor mutante virussen die zeer lage NA activiteit. - Inspecteer de IC 50-waarden en de curvevormen gegenereerd door de software. Alle gegevens punten moet vallen op of in de buurt van de curve; Zo niet, herhaal dan de NA-remmingstest.
OPMERKING: Voor virussen die ongewoon hoge IC 50 waarden weer te geven, de test moet herhalened om het resultaat te bevestigen.
Representative Results
Het gebruik van gestandaardiseerde richtlijnen voor rapportage van de WHO Werkgroep Surveillance van influenza Antivirale gevoeligheid 9, de gevoeligheid van influenzavirussen aan de NA-remmers worden gerapporteerd op basis van de voorwaarden normale remming (NI), verminderde inhibitie (RI), en sterk gereduceerde remming (HRI) . NI virussen zijn die met IC50 waarden van minder dan 10-voudig in vergelijking met de referentie gemiddelde IC50 voor influenza A virussen (of minder dan 5-voudig voor influenza B-virussen). RI virussen zijn die met IC50 waarden tussen 10- en 100-voudig hoger dan de referentiewaarde gemiddelde IC50 voor influenza A virussen (of 5- en 50-voudig voor influenza B). HRI virussen zijn die met IC50-waarden van 100-voudig boven het referentiepunt gemiddelde IC50 voor influenza A virussen (of meer dan 50-voudig voor influenza B virussen); zie tabel 2.
50-waarden voor A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B Yamagata / B Victoria virussen worden berekend en geactualiseerd wordt op de Melbourne WHOCCRRI om kleine veranderingen in de IC 50-waarden van weerspiegelen circulerende influenzastammen de NA remmers (Tabel 3). De gemiddelde IC50 waarden influenza A (H1N1) pdm09 virussen zijn nagenoeg gelijk over de vier NA remmers, maar de mediaan zanamivir en laninamivir IC50 waarden voor A (H3N2) virussen 2- tot 4-voudig hoger vergeleken met oseltamivir en peramivir IC50-waarden (tabel 3). De mediane oseltamivir IC 50-waarde voor influenza B virussen in het algemeen 5- tot 10-voudig hoger dan de zanamivir, peramivir en laninamivir IC50-waarden (tabel 3).
De NA remmingstest een fenotypische test die geen informatie wordt verstrekken over de genetische veranderingen associated met RI of HRI. Daarom is het belangrijk dat de genetische analyse wordt uitgevoerd na de identificatie van virussen met RI of HRI. Op de Melbourne WHOCCRRI, wordt het NA-gen varianten geanalyseerd met Sanger sequentiebepaling en pyro-sequencing. Een representatieve lijst van aminozuursubstituties die ligt in het NA-gen van virussen met RI en HRI varianten is weergegeven in Tabel 4. Een meer uitgebreide lijst met aminozuursubstituties die NAI gevoeligheid kan veranderen is ook beschikbaar op de WHO-website 10.
Figuur 1: RFU tegen 4-MU-concentratie. (A) Standaardcurve van RFU tegen 4-MU-concentratie (uM). De gestippelde doos staat het lineaire traject van 4-MU de fluorometer. De fluorescentiesignalen boven het lineaire bereik kan verzadigd, en derhalve alle jarenmall veranderingen in fluorescentie kan niet worden gedetecteerd door de fluorometer. (B) Close-up lineaire deel van de standaardcurve van Figuur 1 a voor de identificatie van de "optimale doelsignaal." De fluorometer op de Melbourne WHOCCRRI een lineair bereik van 2,5-40 pM 4-MU en een optimale doelsignaal van -30 uM 4-MU, wat overeenkomt met ~ 1500 RFU. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: voorbeeld van het NA activiteitskrommen influenzavirussen. De gemiddelde achtergrondconcentratie waarde van 50,61 RFU werd afgetrokken van elke verdunning punt op de NA-activiteit curves. De pijlen geven de juiste virusverdunning te gebruiken in de NA remmingstest voor elk virus. Voor gemakkelijker prepreiding van virusverdunningen, kan men kiezen om een 1/100 verdunning uit te voeren voor virus 3 in plaats van een 1/96 verdunning. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Plaat layout voor de instelling van de NA remmingstest. Elke plaat bevat de laatste kolom, die als een negatieve controle die geen virus maar 1x testbuffer (AB), NA inhibitor, Munana bevat en stop oplossing. OPMERKING: JASPR gebruikt metingen uit kolom 12 van elke plaat om de gemiddelde blankingssignaal gebruikt bij de berekening van de IC50 waarden te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van een remmingscurve en IC50 waarde van een A (H1N1) virus pdm09, A / Perth / 82/2015. De JASPR software biedt de remmingskromme fluorescentie (RFU) tegen de toenemende concentratie (nM) van NA remmer, en elk punt binnen de curve fit. Op basis van de inhibitiecurve, de IC 50-waarde wordt bepaald als de concentratie van remmer NA tot 50% van het virus NA activiteit te verminderen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Virus | Virus verdunning vereist | 1x assaybuffer volume (pl) | Surfactant-Amps-NP-40 (10%) (ml) | Virus volume (ml) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
Tabel 1: Bereiding van virus verdunningen VIRUS 1, 2 en 3 in het NA-remmingstest.
| type virus / subtype / lineage | normaal remming | verminderde remming | Sterk gereduceerde remming |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A (H1N1) pdm09 | <10-voudig | 10-100 voudig | > 100-voudige |
| A (H3N2) | &# 60; 10 voudig | 10-100 voudig | > 100-voudige |
| B Yamagata en B Victoria | <5-voudig | 5-50 voudig | > 50-voudig |
Tabel 2: De WHO Antiviral werkgroep aanbevolen richtlijnen voor de indeling van het griepvirus gevoeligheid voor NA-remmers.
| type virus / subtype / lineage | N | zanamivir | oseltamivir | peramivir | Laninamivir |
| Mediaan (bereik) IC50 nM | Mediaan (bereik) IC50 nM | Mediaan (bereik) IC50 nM | Mediaan (bereik) IC50 nM | ||
| A (H1N1) pdm09 | 1326 | 0,42 (0,1-3,43) | <td> 0,36 (0,01-3,48)0,19 (0,07-1,60) | 0,55 (0,05-2,29) | |
| A (H3N2) | 1654 | 0,9 (0,11-4,0) | 0,38 (0,01-3,65) | 0,33 (0,12-3,06) | 1,38 (0,01-9,38) |
| B Yamagata en B Victoria | 1115 | 2,2 (1,24-10,72) | 15.12 (2,39-70,75) | 1,36 (0,57-6,67) | 2,89 (1,62-9,15) |
Tabel 3: Mediane IC50 en IC50 aantal normale remming (NI) virussen uit 2015 behaald in de WHO CCRRI, Melbourne.
| Aminozuursubstitutie | Type / subtype / lineage | IC50 veelvoudverandering compared tot mediane IC50 referentiewaarden. | |||
| zanamivir | oseltamivir | peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A (H1N1) pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A (H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1220 (HRI) | 87 (HRI) | 17724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
Tabel 4: Representatieve lijst aminozuursubstituties in verband met verminderde remming (RI) of sterk verminderde inhibitie (HRI) NA remmers.
| Probleem | Mogelijke redenen) | Oplossingen) |
| Geen of lage NA activiteit | Geen virus aanwezig of lage virusopbrengst. | Klinisch monster worden gekweekt in cellijnen (bijv Madin-Darby Canine Kidney cellen) of in geëmbryoneerde kippeneiereneen hogere virale belasting voor toepassing bij de NA remmingstest. |
| Sommige mutant virussen hebben een extreem lage NA-activiteit, ondanks een hoge viral load. | Gebruik nette virus concentratie voor het testen. Lagere pH assaybuffer (bijvoorbeeld pH 5,3) worden gebruikt. Wel moet voorzichtigheid worden genomen bij het vergelijken van gegevens. | |
| Geen of lage NA NA activiteit remmingstest | Geen virus werd toegevoegd. | Re-verdunnen het virus. Verzekeren het virus wordt direct toegevoegd aan de 1x assaybuffer. |
| Verkeerde virus verdunning werd gebruikt. | Herhaal de NA activiteitstest. | |
| Onvoldoende incubatietijd. | Zorgen de incubatietijd wordt gevolgd. | |
| Datapunten vallen buiten het IC 50 curve | Kruisbesmetting van NA remmer hogere concentratie. | Zorg ervoor dat de tips zijn niet in contact met de NA inhibitor bij het overhevelen verdund virussen in de plaat met 96 putjes. |
| Wanneer een 8 diepe put reservoir werd gebruikt, weggooien en opnieuw af NA remmerconcentraties in een schoon reservoir 8 diepe put. | ||
| Het volume van de NA remmer of Muñana of verdunde virus werd niet evengoed toegevoegd in elk. | Herhaal de test met een gekalibreerde meerkanaals pipet. Een gelijke hoeveelheid van elk reagens wordt in elke well. | |
| Ongebruikelijk hoge IC 50-waarden | Een te hoge concentratie van het virus werd toegevoegd. | Herhaal de activiteitstest NA en NA-remmingstest. |
| Testmonster bevatte mengsels van influenza A en influenza B | Een real-time PCR om de aanwezigheid van virusmengsels identificeren. | |
| Bacteriële besmetting in het monster | Cultuur virus in de steriele toestand met de aanwezigheid van antibiotica. | |
| High achtergrond fluorescentiesignaal | Munana substraat kan na verloop van tijd. | Gebruik een nieuwe partij van Munana subtrate. |
| Detectie van de fluorescentie van naburige putten. | Met zwarte 96-putjes vlakke bodemplaten |
Tabel 5: Problemen om mogelijke problemen op het NA remmingstest.
Discussion
De wereldwijde monitoring influenzavirus NA gevoeligheid voor remmers wordt momenteel uitgevoerd door een aantal laboratoria met behulp van fluorescente of chemiluminescente NA remmingstesten 11, 12. De fluorescentie wordt vaker gebruikt dan de chemiluminescente assay. Hoewel beide assays robuust en reproduceerbaar, de IC50-waarden verkregen uit de op fluorescentie gebaseerde assay zijn vaak hoger dan de chemiluminescentie gebaseerde test, die een directe vergelijking van de gegevens van de twee assays moeilijke 13. Zelfs met het gebruik van hetzelfde protocol, kunnen gegevens gegenereerd door één laboratorium verschillen van elkaar. Vanwege deze verschillen tussen laboratoria, de WHO Werkgroep Surveillance van influenzavaccins gevoeligheid produceerde een leidraad om te helpen bij vergelijkingen tussen laboratoria. In plaats van het vergelijken van de absolute IC 50-waarden, deze richtlijn gebruiksa vergelijking op basis van het IC 50-voudig verschil voor de gemiddelde IC50 van het NI influenzavirussen getest in elk afzonderlijk laboratorium. De mogelijkheid om gegevens van de vijf samenwerkende centra vergelijken heeft geresulteerd in de jaarlijkse publicatie van globale influenzavaccins gevoeligheidsgegevens 2, 3, 4. De beschikbaarheid van de grote hoeveelheid influenza gevoeligheid gegevens in het publieke domein stelt onderzoekers in staat om 50 gegevens te vergelijken IC van die studies met die gegenereerd in hun eigen laboratoria.
Andere NA remming testen die een gelijkaardig concept vast te stellen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Deze commerciële kits die kant-en-klare reagentia bevatten (NA remmers niet inbegrepen) even reproduceerbaar. De interne NA remmingstest is aanzienlijk goedkoper dan de commerciële kits, omdat de meerderheid van de reagentia intern kunnen worden gemaaktgrotere hoeveelheden en de Munana substraat, die eerder de belangrijkste kosten van de test bestaat, kan nu worden gekocht bij verschillende bronnen tegen concurrerende prijzen. De kosten van het testen van een influenza-isolaat per geneesmiddel ongeveer $ 1 (USD). Op de Melbourne WHOCCRRI zijn verbeteringen aangebracht in de interne NA remmingsassay na oprichting van een robotplatform voor de vloeistofverwerking componenten van het assay. Naast de handmatige bereiding van virusverdunningen, de meeste procedures worden uitgevoerd met de vloeistofverwerking robot. Niet alleen is dit een minimum te beperken manueel hanteren, maar het verhoogt ook het aantal tests die kan worden uitgevoerd in een dag.
Hoewel de NA remmingstest stevig en solide zijn er een aantal kritische stappen die moeten worden aangevuld met extra zorg. Eerst, onregelmatigheid van de NA remmerconcentraties kan de inhibitie curven en de IC50 waarden verplaatsen; Daarom moet nadrukkelijk aandacht worden besteedbetaald bij het bereiden van de NA remmerconcentraties. Ten tweede, nauwkeurig pipetteren en precieze incubatieperioden zijn van cruciaal belang voor het behoud van consistente resultaten assays; Dit kan worden bereikt door gekalibreerde pipetten en timers. De opname van controle virussen in elke test maakt ook de monitoring van de test prestaties van de test om te testen en gedurende lange perioden van tijd. Ten derde, omdat de NA enzymactiviteit van seizoensgebonden influenzavirussen optimaal is bij pH 6,5, de juiste pH van de assaybuffer belangrijk. Sommige rapporten hebben gevonden dat het gebruik van lagere pH-omstandigheden kan verbetert de identificatie van influenza varianten, zoals de A (H7N9) variant bevattende de mutatie R292K 14, 15. Echter de wijziging van de pH van de assaybuffer verschuiven de IC50 waarden, en kan de vergelijking van gegevens bemoeilijken in laboratoria en tussen laboratoria. Andere modificaties en probleemoplossing p kan wordenerformed worden in tabel 5.
De NA-remmers zijn de enige klasse van goedgekeurde antivirale middelen die op dit moment werkzaam zijn tegen circulerende griepvirussen. Tot andere antivirale klassen beschikbaar zijn voor klinisch gebruik, zal de antivirale gevoeligheid bewaking van circulerende influenzavirussen zijn gericht op NA-remmers alleen. Vanwege de eenvoud en de reproduceerbaarheid van de resultaten, het gebruik van het NA remmingstest met influenzavirus NA gevoeligheid voor remmers beoordelen blijft.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Melbourne WHO Collaborating Centre for Reference en onderzoek inzake het Influenza wordt ondersteund door de Australische regering Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
| Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
| 96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96-well deep plates, 2.0 mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume) | |
| Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
| Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Incubator set at 37 °C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
| Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |
References
- Moscona, A.
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
