Summary
Vi beskriver bruken av en fenotypisk fluorescens-baserte neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensa A og B virus til neuraminidase inhibitor klasse av antivirale midler.
Abstract
De neuraminidase (NA) inhibitorer er den eneste klassen av antivirale midler som er godkjent for behandling og profylakse av influensa som er effektive mot nåværende sirkulerende stammer. I tillegg til deres anvendelse ved behandling av sesong influensa, har de NA-inhibitorer lagre med en rekke land til bruk i tilfelle av en-epidemien. Det er derfor viktig å overvåke følsomheten av sirkulerende influensavirus til denne klassen av antivirale midler. Det finnes forskjellige typer av bestemmelser som kan brukes til å vurdere i hvilken grad influensavirus til NA-inhibitorer, men de enzyminhibering analyser ved anvendelse av enten et fluorescerende substrat eller en kjemiluminescent substrat er den mest brukte og anbefalt. Denne protokollen beskriver bruk av en fluorescens-basert assay for å bedømme influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer. Analysen er basert på NA enzymet spalte den 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Munana) Substrat for å frigjøre den fluorescerende produkt 4-metylumbelliferon (4-MU). Derfor er den inhiberende effekt av an NA-inhibitor på influensavirus NA bestemt basert på konsentrasjonen av NA inhibitor som er nødvendig for å redusere 50% av NA-aktivitet, gitt som en IC50-verdi.
Introduction
Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er de to hovedoverflate-glykoproteiner av influensa A og B virus. HA bindes til sialsyre-galaktose av celleoverflate-glykoproteiner eller glykolipider, mens den NA frigjør viruset ved spalting av sialinsyre fra galaktose på celleoverflaten 1. Na-inhibitorer er en klasse av influensaantivirale som ble rasjonalt designede å binde tett til NA enzymatiske aktive setet, for derved å hindre utslipp og spredning av virusavkom. Oseltamivir og zanamivir er to NA-hemmere som er godkjent i mange land over hele verden for behandling og forebygging av influensa. I de senere år, ytterligere to NA-hemmere, peramivir og laninamivir, er godkjent for bruk i et begrenset antall land. Screening av influensa vira til mottakelighet for NA-inhibitorer og identifikasjon av mutasjoner som medfører resistens er viktig ved bestemmelse og overvåking av effektivieness av denne klassen av antivirale midler.
I de siste 16 år, har den fluorescens-baserte NA inhiberingsanalyse blitt utført rutinemessig ved WHO Collaborating Centre for referanse og forskning på Influensa, Melbo (Urne WHOCCRRI) for å overvåke den endrede utviklingen av antivirale mottagelighet hos sirkulerende influensavirus. Årlig, er mer enn 2000 influensavirus testet for antiviral mottakelighet. I de fleste influensa årstider,> 98% av virus er følsomme for alle fire NA-inhibitorer 2, 3, 4, men i løpet av 2007 til 2008 nordlige halvkule influensa årstid, var det en økning i antallet av tidligere sesong A (H1N1) virus som hadde redusert følsomhet for oseltamivir 5. Denne gruppen av viruser, som inneholdt den NA aminosyresubstitusjon H275Y, spres til resten av verden ved utgangen av 2008. Den gjør oseltamivir inapproprispiste globalt for behandling av dette viruset. De aller fleste av tiden sirkulerer influensa B, influensa A (H3N2) og influensa A (H1N1) pdm09 stammer er utsatt for Oseltamivirs, selv om samfunnet klynger av A (H1N1) pdm09 varianter som inneholder NA aminosyresubstitusjonen H275Y som overfører redusert oseltamivir og peramivir mottakelighet, har blitt rapportert i ulike deler av verden 6, 7.
På grunn av behovet for et tilstrekkelig høyt virustiter, må kliniske prøver (inkludert dyr nesevasker) bli overført enten i cellekultur eller embryonerte kyllingegg før antiviral følsomhetstesting. NA-inhiberingsanalysen som er beskrevet i denne artikkelen, kan deles inn i tre deler:
Å bestemme det lineære område for den fluorescerende produkt 4-metylumbelliferon (4-MU) på et bestemt fluorometer
På grunn av de iboende forskjeller mellom fluorometers, than lineære område for den fluorescerende sluttproduktet, 4-MU, og den relative fluorescensen enheten (RFU), trenger å bli etablert. Når det lineære området for 4-MU er etablert, blir den optimale målsignalet valgt, til hvilken konsentrasjonen av influensavirus blir justert i den NA aktivitetsanalyse. Etter fullført for en bestemt fluorometer, bør dette ikke må gjentas.
Bestemmelse av NA aktiviteten av virusene
NA-aktivitetsanalyse er en enkel analyse som involverer tilsetningen av 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Munana) substrat til serielt fortynnet virus. Mengden av fluoriserende sluttprodukt 4-MU generert fra spaltingen av Munana ved NA blir målt ved anvendelse av et fluorometer. Den passende virus fortynning til bruk i den NA-inhiberingsanalyse er valgt ved å plotte fluorescensenheter mot virus fortynning. Fra sigmoidal kurve som produseres, bør midtpunktet av den lineære seksjon tilsvarer4-MU lineære området for fluorometer bestemt i seksjon 1 og vil informere den passende konsentrasjon av virus for å bli brukt i avsnitt 3.
Vurdering av virus mottakelighet for NA-inhibitorer ved hjelp av NA-inhiberingsanalysen
For å bestemme mottakeligheten til virus til et bestemt NA-inhibitor, er virus ved fortynning bestemt i seksjon 2 ble inkubert med et område av NA-inhibitorkonsentrasjoner. Etter en etterfølgende inkubering med Munana, er 4-MU generert av uinhiberte virus målt i RFU av fluorometeret. Den inhiberende effekt av NA-inhibitor på NA-enzymaktiviteten av et virus blir beregnet i henhold til NA-inhibitor-konsentrasjon som er nødvendig for å redusere 50% av NA-aktivitet, gitt som en IC50-verdi.
Protocol
1. Bestemme lineære området av Fluorescent Produkt 4-MU på en Fluorometer
- Fremstill 10 ml av 6,4 mM 4-MU stamløsning ved å oppløse 11,3 mg av 4-MU i 5 ml absolutt etanol. Tilsett 5 ml 0,9% NaCl (vekt / volum) til stamoppløsningen for å lage 10 ml. Fremstill en 640 uM arbeidsløsning ved fortynning av 1 ml av 6,4 mM 4-MU i 9 ml 1 x prøvebuffer (33,3 mM 2- (N-morfolino) etansulfonsyre (MES) og 4 mM CaCl2, pH 6,5).
MERK: Klargjør 2x prøvebuffer ved tilsetning av 13 g av MES og 8 ml av 1 M CaCl 2 til 992 ml destillert vann. Juster pH til 6,5 med 10 M NaOH. Filtrer buffer ved anvendelse av en steril celluloseacetat-filter med porestørrelse 0,2 pm. Forsiktighet! Natriumhydroksid er etsende og kan forårsake etseskader på hud og øyne. Sørg for at full personlig verneutstyr er slitt. - Forbered 5 ml av en rekke 4-MU-konsentrasjoner (det vil si, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 & #181, M, og 320 pM) via en to-gangers seriell fortynning av 640 uM 4-MU ved hjelp 1x analysebuffer.
- Tilsette 50 pl av hver seriefortynning av 4-MU (dvs, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM og 640 uM) (to brønner pr fortynning) til en klar, 96- brønns flatbunnet plate og 50 ul av 1 x assaybuffer til de gjenværende brønnene (som tjener som emnene for å måle bakgrunnssignaler).
MERK: Sluttkonsentrasjonene av 4-MU i reaksjonsvolumet (50 ul 4-MU + 50 ul 300 uM Munana) er 2,5 gm, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM og 320 uM . - Fremstill en 2,5 mM forrådsoppløsning Munana ved rekonstituering av 25 mg av Munana i 20 ml destillert vann. Bland 0,72 ml av en 2,5 mM MUNANA med 5,28 ml av 1 x prøvebuffer for å oppnå en 300 pM Munana arbeidsløsning (tilstrekkelig volum for en plate). Dekk røret som inneholder 300 pM Munana redskapeng oppløsning med aluminiumfolie og holde den på is med mindre det brukes umiddelbart. Kast eventuelle tiloversblevne materialer.
MERK: 2,5 mM MUNANA stamløsning kan oppbevares ved -20 ° C i 1 måned, og må brukes i løpet av én fryse / tine-syklus. De 4-MU og Munana løsninger er lysfølsomme, og må beskyttes mot forlenget lyseksponering. - Tilsett 50 ul av 300 uM Munana til hver brønn, banke forsiktig for å blande, og inkuber ved 37 ° C i 30 min. Dekk med et plateforsegler for å forhindre fordampning.
MERK: Dette trinnet er å gjøre rede for bakgrunnsfluorescens i Na-hemmingstesten. - Klargjør stopp løsning ved å blande 11 ml absolutt etanol med 2,225 ml 0,824 M NaOH (tilstrekkelig volum for en plate).
- Tilsett 100 ul stoppløsning til hver brønn for å stoppe reaksjonen og banke forsiktig for å blande.
- Avles platen ved bruk av et fluorometer med en eksitasjonsbølgelengde innstilling på 355 nm og en innstilling emisjonsbølgelengde på 460 nm, som per produsentens instruksjoner.
- Beregne gjennomsnittlig bakgrunnssignal ved å bruke fluorescens-signaler fra alle brønnene som inneholdt no 4-MU. Trekk fra denne gjennomsnittsbakgrunnssignal fra hver av brønnene som inneholdt 4-MU og beregne middelverdisignaler (RFU) for hver 4-MU-konsentrasjon. Plotte en standardkurve av RFU mot 4-MU-konsentrasjon (uM), som vist i figur 1a; et nærbilde lineære delen av kurven er vist i figur 1b.
- Visual handlingen i RFU mot 4-MU-konsentrasjon (uM) for å bestemme det lineære område og optimal målsignal; det lineære område er der fluorescens-signal øker proporsjonalt med økende konsentrasjoner av 4-MU på tomten, mens den optimale målsignal er en vilkårlig 4-MU-konsentrasjon innenfor det lineære området.
NB: Det lineære området og det optimale målsignal er fluorometer-spesifikke. For eksempel, fluorometeret på Melbourne WHOCCRRI har en lineær rekke 20,5 til 40 uM 4-MU og en optimal målsignal av ~ 30 uM 4-MU, som svarer til ~ 1500 RFU.
2. Bestemmelse av NA Aktivitet av virusene
MERK: Influensavirus dyrkes til tilstrekkelig titer i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler eller befruktede hønseegg 8.
- Dispensere 120 ul per brønn av ufortynnede dyrkede influensavirus i kolonne 1, og 60 ul av 1 x prøvebuffer inneholdende 0,1% NP-40 i de resterende 11 kolonnene til en 96-brønn U-bunnplate.
- Serielt utføre to-gangers fortynning av virus på tvers av platen (dvs., å overføre 60 ul fra kolonne 1 og kolonne 2 og så videre, opp til kolonne 11) ved bruk av en multikanal pipette, slik at kolonne 12 som en blank som inneholdt kun 1x analysebuffer.
- Overfør 50 ul fra hver av brønnene (fortynnede virus og blindprøver) til en klar, 96-brønn, flatbunnet plate.
MERK: Det er ikke nødvendig å cndre pipettespisser hvis materialene overføres fra kolonne 12 gjennom til en kolonne. - Tilsett 50 pl av 300 pM Munana (fremstilt som i trinn 1.4) per brønn og banke forsiktig på platen for å blande. Inkuber platen ved 37 ° C i 1 time. Dekk med et plateforsegler for å forhindre fordampning.
- Tilsett 100 ul stoppløsning (fremstilt som i trinn 1.6) per brønn for å avslutte reaksjonen og banke forsiktig på platen for å blande.
- Les platen ved hjelp av et fluorometer.
- Bruk en innstilling eksitasjonsbølgelengde på 355 nm og en innstilling emisjonsbølgelengde på 460 nm.
- Bestemme den midlere bakgrunnssignalet basert på fluorescens-målingene i kolonne 12 og subtrahere gjennomsnittsbakgrunnssignalet fra hver brønn. Plotte en graf av RFU mot virus fortynninger.
MERK: bakgrunnsverdier for 100 uM Munana på WHOCCRRI Melbourne er vanligvis mellom 50 og 120 RFU, men disse vil variere avhengig av fluorometeret being anvendes. - Se handlingen i RFU mot virus fortynninger for å bestemme midtpunktet av den lineære delen av kurven for hvert virus (figur 2). Bruke optimal målsignal (bestemt i trinn 1) som referansepunkt.
Merk: Dette skal korrespondere med 4-MU lineære området for fluorometer bestemt i seksjon 1 og vil gi den passende konsentrasjon av virus for å bli brukt i avsnitt 3.
3. Vurdering av Virus Mottakelighet for NA Inhibitorer hjelp av NA hemningsmetoden
- Forbered master-lagrene av NA-inhibitorer ved konsentrasjoner på 300 uM.
- Forbered 300 uM Zanamivirdoser (molekylvekt, MW = 332,32 g / mol) ved å oppløse 5,0 mg Zanamivirdoser i 50 ml av 2x prøvebuffer (66,6 mM MES og 8 mM CaCl2, pH 6,5).
- Forbered 300 uM oseltamivirkarboksylat (D-tartrat; MV = 386,44 g / mol) ved å løse 5,8 mg i 50 ml av 2x prøvebuffer.
- Forberede300 uM peramivir trihydrat (MG = 382,45 g / mol) ved å løse 5,7 mg i 50 ml av 2x prøvebuffer.
- Forbered 300 uM laninamivir (MG = 346,34 g / mol) ved å løse 5,2 mg i 50 ml av 2x prøvebuffer.
MERK: NA inhibitor stammassen kan lagres ved -20 ° C i 12 måneder. Kontroller MW av NA-inhibitorer for å sikre at riktig vekt og volum er brukt i rekonstitusjon. Oseltamivirkarboksylat er den aktive forbindelse av prodrogen oseltamivirfosfat. Derfor bør bare oseltamivirkarboksylat bli brukt i Na-hemmingstesten.
- Fra stam aksjer, forberede arbeids lagrene av ti-gangers seriefortynninger av NA-inhibitorer i 50 ml sentrifugerør i konsentrasjoner på 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM og 30000 nM i 2x assay -buffer (66,6 mM MES og 8 mM CaCl2, pH 6,5); Dette er for bruk på tvers av flere analyser.
MERK: Sluttkonsentrasjonene av NA-inhibitorer i reaksjons volume (50 ul virus fortynning + 50 ul inhibitor NA + 50 ul av 300 uM Munana) er 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM og 10000 nM, respektivt. Den endelige konsentrasjonen inkluderer ikke de 100 ul stoppløsning. Lagre alle NA-inhibitorer fortynninger ved 2-8 ° C. Utløpsdatoen er den samme som for master aksjer. - Fremstille virus fortynninger i 1x analysebuffer inneholdende 0,1% NP-40 overflateaktivt middel i en 96-brønn dyp-blokken. Bruk virus fortynninger basert på NA-aktivitet analyseresultatene avledet fra seksjon 2. bruke et totalt volum på 2 ml pr virus for å teste fire NA-inhibitorer.
MERK: Fremstill to brønner (1 ml pr brønn) per-virus i en 96-brønn dyp-blokken. Eksempler på virus fortynninger av virus 1, 2 og 3 er vist i tabell 1. - Dispensere det nødvendige volumet av NA-inhibitorer (fremstilt som i trinn 3.2) til en 8-dyp brønn reservoaret. Derfra fordeles 50 ul av NA-inhibitorer ved fortynninger i området fra 0 nM (2x assay bUffer bare) til 30.000 nM i radene A til H i en klar, 96-brønn, flatbunnet plate.
MERK: Platen layout er vist i figur 3. - Tilsett 50 ul fortynnet test virus per brønn til kolonner 1-11 og 50 ul per brønn av 1 x assaybuffer bare til kolonne 12. forsiktig på platen for å blande og inkubere ved romtemperatur i 45 min. Dekk med et plateforsegler for å forhindre fordampning.
- Tilsett 50 pl av 300 pM Munana (fremstilt som i trinn 1.4) per brønn og banke forsiktig på platen for å blande. Inkuber platen ved 37 ° C i 1 time. Dekk med et plateforsegler for å forhindre fordampning.
- Tilsett 100 ul stoppløsning (fremstilt som i trinn 1.6) til hver brønn og banke forsiktig på platen for å blande.
- Les platen ved hjelp av et fluorometer.
- Bruke en eksitasjonsbølgelengde på 355 nm og en emisjonsbølgelengde på 460 nm, som beskrevet tidligere.
4. Beregning avIC 50 verdier
MERK: JASPR V1.2 er kurvetilpasning programvare som gjør det mulig å beregne IC50-verdier. Programvaren er utviklet av Influensa Division ved CDC, Atlanta, USA. Programmet benytter ligningen: V = V maks x (1 - ([I] / (K ^ + [I]))), hvor V max er den maksimale hastighet av metabolisme, [I] er inhibitorens konsentrasjon, er V responsen blir hemmet, og K, er IC50 for den inhiberingskurven.
- Kopier og lim inn rådata som mates ut av den fluorometer til et regneark i en 12-kolonne plateformat (96-brønn), og starter med celle A1.
MERK: Rådata fra hver påfølgende plate må forskyves med en tom rad. Hvis hvert virus har blitt testet mot fire NA-inhibitorer, lim rådata i et sett av fire (med en tom rad mellom hver plate). - Åpne tilpasningsprogramvare og click på "Experiment" -kategorien. Velg "Alternative to-stoff Fluor 11 Samples."
- Klikk på "Alternativer" -kategorien og kryss av for "Generer grafer."
- Klikk på "Options" igjen og klikk på "Ny Key" -kategorien. Lagre "inhibition_key" CSV-fil i samme mappe som rådata regnearkfilen.
- I inhibition_key fil, liste alle prøvenavn under ID. Hver prøve Navnet må være unikt.
- Hvis fire NA-inhibitorer ble testet, sett mellomrom for ytterligere to rader under Oseltamivirfosfat og skriv inn "Peramivir" og "Laninamivir". Lagre endringene som er gjort i inhibition_key filen.
- Tilbake til "jaspr v 1,2-Hemming kurvetilpasning" vinduet og velg rådatafilen som "Experiment Fil" og inhibition_key som "Key File". Kjør analysen. Lagre resultatene i CSV og .pdf-format.
MERK: Programvaren vil automatisk plotte en hemning kurve (RFU against NA inhibitorkonsentrasjoner), som vist i figur 4. Programmet beregner også IC 50-verdier for hvert virus mot et individ NA-inhibitor (figur 4). I tillegg presenterer JASPR IC50-verdier og signal-til-bakgrunn (S / B) forholdet i regneark. Bakgrunnsverdiene kan variere fra lab til lab avhengig av fluorometer brukt. På Melbourne WHOCCRRI, verdier bakgrunnen for 100 uM Munana området 50-120 RFU. For en pålitelig IC 50 verdi, blir et S / B-forhold på ≥10 foretrukket, selv om et forhold på mindre enn 10 fremdeles er akseptabelt, særlig for mutante virus som har meget lav NA aktivitet. - Inspisere IC50-verdiene og de kurveformer som genereres av programvaren. Alle datapunktene skulle falle på eller nær kurven; hvis de ikke, gjentas NA-inhiberingsanalysen.
NB: For viruser som viser uvanlig høye IC50-verdier, bør analysen være gjentaed å bekrefte resultatet.
Representative Results
Ved å bruke standardiserte meldings retningslinjer fra WHO-arbeidsgruppen for overvåkning av influensavirale Mottakelighet 9 blir mottakelighet av influensavirus til NA-inhibitorer rapportert bruk av termene normal inhibering (NI), redusert hemning (K), og sterkt redusert hemming (HRI) . NI virus er de med IC50 verdier mindre enn 10 ganger sammenlignet med referanse median IC50 for influensa A-virus (eller mindre enn 5 ganger for influensa B-virus). RI virus er de med IC50-verdier mellom 10- og 100-ganger større enn referanse median IC50 for influensa A-virus (eller 5- og 50-gangers for influensa B). HRI virus er de med IC50-verdier på 100 ganger større enn referanse median IC50 for influensa A-virus (eller over 50 ganger for influensa B-virus); se tabell 2.
50-verdier for A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B Yamagata / B Victoria virus beregnes og oppdateres hvert år på Melbourne WHOCCRRI for å reflektere mindre endringer i IC50 verdier på sirkulerende influensastammer til NA-inhibitorer (tabell 3). Median IC 50-verdier i influensa A (H1N1) pdm09 virus er omtrent de samme i de fire NA-inhibitorer, men median zanamivirresistente og laninamivir IC 50-verdier for A (H3N2) virus er 2- til 4-ganger høyere sammenlignet med oseltamivir og peramivir IC 50-verdiene (Tabell 3). Median oseltamivirs IC 50-verdien for influensa B-virus er vanligvis 5 til 10 ganger høyere enn den Zanamivirdoser, peramivir, og laninamivir IC 50-verdiene (Tabell 3).
NA-inhiberingsanalysen er en fenotypisk assay som ikke gir informasjon om den genetiske endringer associrerte med RI eller HRI. Derfor er det viktig at genetisk analyse blir utført ved å følge identifikasjon av virus med RI eller HRI. På Melbourne WHOCCRRI, blir NA-genet av varianter analysert ved hjelp av Sanger-sekvensering og pyro-sekvensering. En representativ liste over aminosyresubstitusjoner som kan finnes i den NA-genet av virus med RI og HRI varianter er presentert i tabell 4. En mer omfattende liste over aminosyresubstitusjoner som kan endre NAI mottakelighet er også tilgjengelig på WHOs nettside 10.
Figur 1: RFU mot 4-MU-konsentrasjon. (A) Standardkurve av RFU mot 4-MU-konsentrasjon (uM). Den stiplede boks viser det lineære området av 4-MU for fluorometeret. Fluorescenssignalene over det lineære område kan være mettet, og derfor, eventuelle small endringer i fluorescens kan ikke bli detektert av fluorometeret. (B) nærbilde lineære del av standardkurven i figur 1a for identifikasjon av den "optimale målsignal." Fluorometeret på Melbourne WHOCCRRI har et lineært område av 2,5 til 40 uM 4-MU og en optimal målsignal av ~ 30 uM 4-MU, som svarer til ~ 1500 RFU. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på NA virkningskurver av influensavirus. Den gjennomsnittlige bakgrunnsverdi på 50,61 RFU er blitt subtrahert fra hver fortynning punkt på NA-virkningskurver. Pilene indikerer den aktuelle virus fortynning til bruk i den NA hemmingstesten for hvert virus. For enklere prepFraskilling av virus fortynninger, kan man velge å utføre en 1/100 fortynning for VIRUS 3 i stedet for en 1/96 fortynning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Plate layout for oppsett av NA-inhiberingsanalysen. Hver plate inneholder den siste kolonnen, som virker som en negativ kontroll som ikke inneholder noe virus, men bare 1 x prøvebuffer (AB), NA-inhibitor, Munana, og stoppe løsning. MERK: JASPR anvender målinger fra kolonne 12 i hver plate for å bestemme den gjennomsnittlige blank-signal som anvendes i beregningen av IC50-verdiene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempel på en inhiberingskurve og IC 50-verdien til en A (H1N1) pdm09 virus, A / Perth / 82/2015. Den JASPR programvare presenterer inhiberingskurven som fluorescens (RFU) mot den økende konsentrasjonen (nM) av NA-inhibitor, med hvert punkt inne i den kurve. Basert på inhiberingskurven, er IC50-verdien bestemmes som den konsentrasjon av NA inhibitor for å redusere 50% av virus NA aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Virus | Virus fortynning som kreves | 1x analysebuffervolumet (il) | Overflateaktivt middel-ampere-NP-40 (10%) (ml) | Virus volum (ml) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
Tabell 1. Fremstilling av virus fortynninger av virus 1, 2 og 3 i de NA-inhiberingsanalysen.
| Virus type / subtype / avstamning | normal hemming | redusert inhibering | Sterkt redusert inhibering |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A (H1N1) pdm09 | <10 gangers | 10-100 gangers | > 100 gangers |
| A (H3N2) | &# 60; 10 gangers | 10-100 gangers | > 100 gangers |
| B Yamagata og B Victoria | <5 gangers | 5-50 gangers | > 50 gangers |
Tabell 2: WHO Antiviral Working Group anbefalte retningslinjer for klassifisering av influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer.
| Virus type / subtype / avstamning | N | zanamivir | oseltamivir | Peramivir | Laninamivir |
| Median (område) IC50 nM | Median (område) IC50 nM | Median (område) IC50 nM | Median (område) IC50 nM | ||
| A (H1N1) pdm09 | 1326 | 0,42 (0,1 til 3,43) | <td> 0,36 (0,01 til 3,48)0,19 (0,07 til 1,60) | 0,55 (0,05 til 2,29) | |
| A (H3N2) | 1654 | 0,9 (0,11 til 4,0) | 0,38 (0,01 til 3,65) | 0,33 (0,12 til 3,06) | 1,38 (0,01 til 9,38) |
| B Yamagata og B Victoria | 1115 | 2,2 (1,24 til 10,72) | 15,12 (2.39-70.75) | 1,36 (0,57 til 6,67) | 2,89 (1,62 til 9,15) |
Tabell 3: Median IC50 og IC50 området for normal inhibering (NI) virus fra 2015 utledet i WHO CCRRI, Melbourne.
| Aminosyresubstitusjon | Type / undertype / avstamning | IC 50 gangers endring compared å referere til median IC50-verdier. | |||
| zanamivir | oseltamivir | Peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A (H1N1) pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A (H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1220 (HRI) | 87 (HRI) | 17724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
Tabell 4: representativ liste over aminosyresubstitusjoner som er knyttet til redusert hemning (K) eller sterkt redusert inhibering (HRI) til NA-inhibitorer.
| Problem | Mulig årsak (er) | Solution (s) |
| Lav eller ingen aktivitet NA | Ingen virus var til stede eller lav virusutbytte. | Klinisk prøve må dyrkes i cellelinjer (dvs. Madin-Darby-hundenyre-celler) eller i embryonerte hønseeggtil en høyere virusbelastning for bruk i den NA hemmingstesten. |
| Noen mutante virus har ekstremt lav NA aktivitet til tross for høy virusmengde. | Bruk ryddig viruskonsentrasjon for testing. Lavere pH-analysebuffer (for eksempel pH 5,3) anvendes. Imidlertid må man vise forsiktighet når man sammenligner data. | |
| Lav eller ingen aktivitet i NA NA inhiberingsanalyse | Ingen virus ble lagt til. | Re-fortynne viruset. Sikre viruset tilsettes direkte inn i 1x analysebuffer. |
| Feil virus fortynning ble anvendt. | Gjenta NA aktivitetsanalyse. | |
| Utilstrekkelig inkubasjonstid. | Sørg for at inkubasjonstiden er fulgt. | |
| Datapunkter som faller utenfor IC50 kurve | Smitte av NA inhibitor av høyere konsentrasjon. | Pass på at tips ikke er i kontakt med NA inhibitor ved dispensering fortynnet virus i 96-brønners plate. |
| Hvis en åtte dyp brønn-reservoaret ble anvendt, kast og re-dispensere NA inhibitorkonsentrasjoner inn i et friskt 8 dyp brønn reservoaret. | ||
| Volumet av NA-inhibitor eller Munana eller fortynnet virus ble ikke tilsatt like inn i hver brønn. | Gjenta analysen med en kalibrert flerkanals pipette. Sikre lik volumet av hver reagens blir dispensert i hver brønn. | |
| Usedvanlig høye IC50-verdier | For høy konsentrasjon av viruset ble tilsatt. | Gjenta NA aktivitetsanalysen og NA-inhiberingsanalysen. |
| Forsøksprøven inneholdt blandinger av influensa A og influensa B. | Utføre sanntids-PCR for å identifisere tilstedeværelse av virusblandinger. | |
| Bakteriell forurensning i prøven | Kultur virus i steril tilstand med tilstedeværelse av antibiotikum. | |
| Høy bakgrunns Fluorescenssignalet | Munana Substratet kan brytes ned over tid. | Bruk en ny gruppe med Munana substratmaterialet. |
| Påvisning av fluorescens fra nærliggende brønner. | Bruk sort 96-brønns flatbunnede plater |
Tabell 5: Feil for potensielle problemer i NA-inhiberingsanalysen.
Discussion
Den globale overvåkning av influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer er for tiden blir utført av en rekke laboratorier ved anvendelse av enten fluorescerende eller kjemiluminescerende NA inhiberingsanalysene 11, 12. Den fluorescens-undersøkelses er mer vanlig enn det kjemiluminescerende assay. Selv om begge analysene er robuste og reproduserbar, IC50-verdiene som ble oppnådd fra den fluorescens-baserte analysen er ofte høyere enn den kjemiluminescens-baserte analysen, noe som gjør en direkte sammenligning av data fra de to analysene vanskelige 13. Selv med bruk av den samme protokoll, kan data generert fra ett laboratorium variere fra en annen. På grunn av disse variasjoner mellom laboratorier, WHO-arbeidsgruppen for overvåkning av influensavirale Mottakelighet produsert en retningslinje for å bistå i inter-laboratorie sammenligninger. Snarere enn å sammenligne de absolutte IC50 verdier, denne retningslinjen bruks en sammenligning basert på IC-50 gangers forskjell til midt IC50 av NI influensavirus ble testet i hvert spesielt laboratorium. Evnen til å sammenlikne data fra de fem samarbeidende sentrene har resultert i den årlige publikasjon av global influensavirale følsomhetsdata 2, 3, 4. Tilgjengeligheten av den store mengden av influensa følsomhetsdata i den offentlige sfæren kan forskerne sammenligne IC 50 data fra disse studiene med det som genereres i egne laboratorier.
Andre NA inhiberingsanalysene som tar i bruk et lignende konsept er også kommersielt tilgjengelige. Disse kommersielle sett som inneholder klare til bruk reagenser (NA inhibitorene er ikke inkludert) er like reproduserbare. Imidlertid er in-house NA inhiberingsanalyse vesentlig billigere enn de kommersielle sett, fordi de fleste av de reagenser kan fremstilles in-house instørre mengder og Munana substratet, som tidligere utgjorde det store kostnadene av analysen, kan nå kjøpes fra forskjellige kilder, til konkurransedyktige priser. Kostnaden for å teste ett isolat influensa per stoffet er omtrent $ 1 (USD). På Melbourne WHOCCRRI, er det gjort forbedringer for in-house NA inhiberingsanalyse etter innlemmelse av en robot-plattform for væskehåndtering komponenter av analysen. Bortsett fra manuell fremstilling av virus fortynninger, er de fleste av operasjonene som utføres ved hjelp av væskehåndteringsrobot. Ikke bare gjør dette redusere manuell håndtering, men det øker også antall analyser som kan kjøres på en dag.
Selv om NA-inhiberingsanalysen er meget robust, finnes det en rekke viktige tiltak som må fylles ut med ekstra omhu. Først enhver uregelmessighet i de NA inhibitorkonsentrasjoner kan forskyve inhiberingskurvene og IC50-verdier; Derfor bør forsiktig oppmerksomhet værebetalt ved utarbeidelsen av NA inhibitorkonsentrasjoner. For det andre, nøyaktig pipettering og nøyaktig inkubasjonsperioder er avgjørende for å opprettholde konsistente resultater på tvers av analyser; Dette kan oppnås ved anvendelse av kalibrerte pipetter og tidsur. Inkluderingen av kontrollvirus i hver analyse muliggjør også overvåking av målemetoden fra analyse for å analysere og over lange tidsperioder. For det tredje, fordi den NA enzymaktiviteten av sesong influensavirus er optimal ved pH 6,5, er den riktige pH-verdien i analysebuffer viktig. Enkelte rapporter har funnet at anvendelse av lavere pH-forhold kan forbedres identifisering av influensa varianter, slik som A (H7N9)-variant inneholdende mutasjon R292K 14, 15. Imidlertid vil endring av pH-verdien i analysebuffer forskyve IC50-verdier, og dette kan komplisere sammenligningen av data i laboratorier og mellom laboratorier. Andre modifikasjoner og feilsøking som kan være performed er oppført i tabell 5.
Na-inhibitorer er den eneste klassen av godkjente antivirale midler som for tiden er effektive mot sirkulerer influensavirus. Inntil andre antivirale klasser blitt tilgjengelige for klinisk bruk, vil den antivirale mottakelighet overvåking av sirkulerende influensavirus være fokusert på NA-inhibitorer alene. På grunn av enkelheten og reproduserbarheten av resultatene, til bruk av NA-inhiberingsanalysen vurdere influensavirus mottakelighet for NA-inhibitorer vil fortsette.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Melbourne WHO samarbeidssenter for Referanse og forsknings Influensa er støttet av den australske regjeringen Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
| Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
| 96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96-well deep plates, 2.0 mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume) | |
| Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
| Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Incubator set at 37 °C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
| Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |
References
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
