Summary
قطرات الدهون هي عضيات مهمة لتكرار عدة مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس التهاب الكبد C (HCV). نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لمطياف الكتلة الكمية من البروتينات المرتبطة بها. أنها يمكن أن تستخدم في إطار مجموعة من الشروط، مثل عدوى فيروس، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.
Abstract
قطرات الدهون ضرورية لتكرار مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض المختلفة، وأبرزها فيروس التهاب الكبد C (HCV)، والموقع المفترض التشكل الفيريون. ويمكن استخدام تحليل بروتيوم الدهون قطرات الكمي لتحديد البروتينات التي توطين أو مشردون من قطرات الدهون في ظل ظروف مثل العدوى بالفيروس. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لوصف التغيرات التي طرأت على بروتيوم الدهون قطرات بعد الإصابة مع HCV. نحن نستخدم مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)، وبالتالي تسمية بروتيوم كاملة من السكان واحدة من الخلايا التي تحتوي على الأحماض الأمينية "الثقيلة" ل quantitate البروتينات التي مطياف الكتلة. لعزل الدهون قطرة، والسكان الخلية اثنين (أي / "خفيفة" الأحماض الأمينية المصابة HCV و / الأحماض الأمينية "الثقيلة" غير المصابة السيطرة) يتم خلط 1: 1 و هي lysed ميكانيكيا في المخزن منخفض التوتر. بعد إزالة النوى وخلايا دebris بانخفاض الطرد المركزي السرعة، يتم إثراء البروتينات المرتبطة قطرات الدهون من قبل اثنين من الخطوات تنبيذ فائق اللاحقة تليها ثلاث خطوات الغسيل في المخزن متساوي التوتر. ويتم تحليل نقاء الكسور قطرات الدهون التي النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الاعتراف مقصورات التحت خلوية مختلفة. ثم يتم فصل البروتينات المرتبطة قطرات الدهون عن طريق الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد (SDS-PAGE)، يليه Coomassie تلطيخ. بعد زيتية هضم، وكميا الببتيدات التي اللوني التأين electrospray، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي السائل (LC-ESI-MS / MS). باستخدام هذا الأسلوب، حددنا البروتينات تجنيدهم للقطرات الدهون على فيروس التهاب الكبد الوبائي التي قد تمثل العوامل المضيفة المؤيدة أو المضادة للفيروسات. يمكن تطبيق أسلوبنا لمجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة والظروف والثقافة، مثل العدوى مع مسببات الأمراض، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.
Introduction
قطرات الدهون هي غاية الحيوية هيولي (والنووية) عضيات الخلية تتكون من مجموعة أساسية من الدهون المحايدة (الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول استر (CE)) محاطة أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية مع البروتينات جزءا لا يتجزأ 1. جميع أنواع الخلايا تنتج قطرات الدهون، ولكنها تختلف في الحجم والتكوين الدهون، والديكور البروتين. قطرات الدهون الوفاء وظائف متنوعة، بما في ذلك منصب الطاقة والسلائف غشاء الخزانات أو ودائع البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال امتصاص الدهون، وأنها تحمي الخلايا من lipotoxicity، والدهون الإفراج كما يشير الجزيئات، ويشاركون في تدهور البروتين والشبكة الإندوبلازمية (ER) استجابات التوتر 2. على هذا النحو، ومجموعة من البروتينات ربط قطرات الدهون ويحكم جيلهم، وتدهور، والاتجار، والتفاعل مع العضيات الأخرى. ومن بين هذه الأسرة perilipin من البروتينات الدهنية قطرة ملزمة الحسنة النية (PLIN1-5)و "> 3.
الدهون قطرات نشوء حيوي المرجح يبدأ في ER، حيث تحفيز الانزيمات-ER المقيمين تركيب الدهون المحايدة التي تتراكم داخل طبقة ثنائية الغشاء، وتشكيل عدسة الدهون المحايدة، وهي العملية التي كانت تصور في الآونة الأخيرة بشكل جيد في الخميرة 4. ثم ويعتقد أن غشاء الانحناء وارتفاع مستويات حمض ومادة ال diacylglycerol الفسفاتيديك لجذب البروتينات المشاركة في التركيب الحيوي فوسفورية، وتركيب وقت واحد من الدهون المحايدة الأساسية والدهون الفوسفاتية التدريع مطلوب لتوليد الدهون قطرات 5. الانزيمات إيواء المجالات عبر الغشاء الذي يقيم في ER تحفيز هذه العملية. التوسع إلى قطرات الدهون الكبيرة يتطلب النشاط من فئة مختلفة من الإنزيمات تجميع الدهون التي تؤوي على الحلزون متقابلة الزمر وبالتالي يمكن السفر من ER إلى قطرات الدهون. تعبئة الدهون من قطرات الدهون يحدث من خلال تفعيل المحلي للtriglyceridه ومادة ال diacylglycerol الليباز الليباز الدهنية الدهون الثلاثية (ATGL) وهرمون الليباز حساسة (HSL) أو عن طريق مسارات ذاتية البلعمة مختلفة، مثل الاقتصاد الكلي والاقتصاد microlipophagy أو الالتهام الذاتي 6 الوصيفة بوساطة. قطرات الدهون تتفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى، مثل الميتوكوندريا (لبيتا للأكسدة والتوليف الدهن) وER (لتخليق الدهون والاتجار البروتين)، ولكن أيضا مع الجسيمات الحالة، الإندوسومات، والفجوات الناجمة عن البكتيريا داخل الخلايا 7. في الواقع البكتيريا والفيروسات والطفيليات حتى تستهدف قطرات الدهون للنسخ المتماثل والمثابرة، من بينها HCV 8.
فيروس التهاب الكبد الوبائي هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة ذات الصلة الكبد والوفاة في جميع أنحاء العالم، وهو ما يمثل حوالي 0.5 مليون حالة وفاة سنويا 9. العدد الحقيقي للإصابات HCV غير معروف، ولكن تشير التقديرات الأخيرة التي 130-150٬000٬000 الناس مصابون بشكل مزمن. لا VACCINيوجد الإلكترونية، ولكن تمت الموافقة عليه مؤخرا مضادات الفيروسات المفعول المباشر زيادة كبيرة الاستجابات العلاجية مقارنة مع العلاج القائم على فيروسات القياسية. ومع ذلك، في جميع أنحاء العالم، من المرجح أن يقتصر علاج المرضى بسبب التكاليف الباهظة للعلاجات جديدة. ما يقرب من نصف جميع الأفراد المصابين المزمنين مع HCV تطوير مرض الكبد الدهني (تنكس دهني)، وهي حالة تتميز التراكم المفرط للقطرات الدهون في خلايا الكبد. ومن المثير للاهتمام، ظهرت قطرات الدهون أيضا العضيات الخلوية كما الحيوية للنسخ المتماثل HCV، خدمة مزعومة كمواقع التجمع الفيروسية 10، 11.
في الخلايا المصابة HCV، جوهر البروتين الفيروسي وNS5A توطين لقطرات الدهون في عملية تعتمد على مكونات الدهون الثلاثية، ومثبطات مادة ال diacylglycerol ناقلة الأسيل-1 (DGAT1) يضعف الاتجار إلى قطرات الدهون وHCV لاحق إنتاج الجسيمات 12 و 13 و 14 و 15. وبالإضافة إلى ذلك، والطفرات في الدهون المجالات ملزم قطرة إما الأساسية أو NS5A قمع HCV التجمع 16 و 17. الأساسية وNS5A ثم تجنيد جميع البروتينات الفيروسية الأخرى، وكذلك المجمعات تكرار RNA الفيروسي، إلى الأغشية المرتبطة بشكل وثيق مع دهن قطرات 16. مطلوب إجراءات متضافرة من جميع البروتينات الفيروسية لإنتاج الناجح للسلالة الفيروسية المعدية 10 و 11. البروتينات الهيكلية هي جزء من virions، والبروتينات غير الهيكلية تعزيز التفاعلات البروتين البروتين المطلوبة لهذه العملية. ومن المثير للاهتمام، يطلب من حسن النية الدهون ملزم قطرة البروتين PLIN3 / TIP47 لكل من تكرار RNA HCV وإطلاق سراح virions 18 و 19
هنا، نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي من البروتينات المرتبطة بها. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا تغيرات عميقة في بروتيوم الدهون الحبرية خلال فيروس التهاب الكبد الوبائي، وحددت A3 annexin كما بروتين المضيف الذي مع قطرات الدهون-fractionates التعاون ومطلوب لHCV كفاءة نضوج 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام عن مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)
ملاحظة: هنا، والكميات كيت SILAC البروتين - DMEM تستكمل مع 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك كانت تستخدم لوضع العلامات SILAC. يتم توفير مدال الجنين العجل المصل (FCS) مع مجموعة الكميات SILAC البروتين.
- إزالة 50 مل من كل زجاجة من DMEM المتوسطة وإضافة 50 مل من FCS مدال.
- حل 50 ملغ من 13 C 6 L-ليسين-2HCl و 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 1 مل من المتوسط. تخلط جيدا وإضافة الأحماض الأمينية إلى المتوسطة DMEM + FCS.
- إضافة 1X القلم / بكتيريا و1X-L الجلوتامين بديلا. معقم مرشح المتوسط باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تسمية زجاجة كوسط SILAC "الثقيل".
- لإعداد "خفيفة" المتوسطة، كرر الخطوات من 1،1-1،3 باستخدام 50 ملغ من L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك و 50 ملغ من L-ليسين-2HCl. تسمية زجاجة باسم "ضوء "المتوسطة SILAC.
2. SILAC وضع العلامات والأحماض الأمينية تحكم التأسيس
- يعرض للتريبسين الخلايا (1X التربسين-EDTA) وانقسام 1 × 10 5 Huh7.5 الخلايا في 2 آبار لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من المتوسط، واحدة بشكل جيد مع المتوسط SILAC "الثقيل" واحد مع "النور" SILAC المتوسطة.
- ثقافة الخلايا لمدة لا تقل عن 6 مقاطع (نسبة انقسام: 1: 6)؛ بعد 6 فقرات، يجب أن يكون إدراج الأحماض الأمينية "الثقيلة" أكثر من 95٪.
- حصاد 1 × 10 6 خلايا "الثقيل" - السكان الخلية -labeled و "النور" لتحليل فعالية التأسيس. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
- إعادة تعليق الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر من MS-العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و1 ملم EDTA تستكمل مع 1X كوكتيل مثبط البروتياز)، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ليز جملتعلمي اللغة اإلنكليزية صوتنة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: فيما يلي إعدادات صوتنة المستخدمة هنا: توقيت، عقد. مراقبة الانتاج، 8؛ دورة العمل، 80٪، و2 × 30 نبضة. - إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11000 x ج و 4 ° C. نقل طاف لأنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
- خلط 75 ميكروغرام من البروتين العازلة مع عينة 6X (375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 25.8٪ الجلسرين، 123 ملغ / مل SDS، 600 ميكروغرام / مل برموفينول الأزرق، و 60 ميكرولتر / مل β-المركابتويثانول)، يغلي في درجة حرارة 95 درجة C لمدة 5 دقائق، وفصل البروتينات عن طريق SDS-PAGE في SDS العازلة تشغيل (3.02 جم / L تريس قاعدة، 18.8 غ / L الجلايسين، و 1 غرام / L SDS) في 180 V لحوالي 1 ساعة أو وفقا لمصنعي "التعليمات.
- نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال الفرقة البروتين نفسه من كل حارة. هضم البروتينات مع التربسين وتحليل فعالية التأسيس من قبل MS تحليل سياسيالصورة، كما هو موضح 22.
3. الدهون القطرة عزل الخلايا Huh7.5 المسمى SILAC
- تصيب السكان واحدة من الخلايا (أي تلك التي وصفت مع الأحماض "خفيفة" الأمينية) مع فيروس مراسل HCV التي يحتضنها مع مخزونات فيروس (على سبيل المثال، JC1 NS5AB-mKO2-BSD، MOI 1) لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية، كما هو موضح 21 .
ملاحظة: JC1 NS5AB-mKO2-BSD هو فيروس HCV يحمل مراسل مضان (أحادى Kusabira أورانج 2، mKO2) لمراقبة معدلات الإصابة تليها Blasticidin المقاومة جين (BSD) بين تكرار موقع NS5A-NS5B الانقسام، التي سبق وصفها 21، 23. العمل مع HCV يتطلب BSL2 + (USA) أو S3 ** (ألمانيا) الاحتواء والممارسات على مستوى السلامة الحيوية. بدلا من الإصابة بفيروس HCV، وخلايا يمكن أن يصاب مع مسببات الأمراض المختلفة. - توسيع الخلايا المصابة HCV "الخفيفة" وغير مصاب & #34؛ الخلايا الثقيلة "خلال الركض من الثقافات، وتحديد قسامة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني وتحديد معدلات الإصابة HCV التدفق الخلوي من البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال، mKO2)، كما هو موضح 21، و وينبغي أن تكون معدلات الإصابة أعلى من 90٪ للدهن قطيرة العزلة ملاحظة: إذا كنت تستخدم JC1 NS5AB-mKO2-BSD HCV سلالة، إضافة 10 ميكروغرام / مل blasticidin S إلى متوسطة "خفيفة" لتحديد لخلايا HCV إيجابي.
- 1 د قبل العزلة الدهون قطرة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين، resuspend في "النور" و "الثقيل" المتوسطة، وعد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. بذور 7 × 10 6 خلايا من كل السكان في 150 سم 2 خلية طبق الثقافة. إعداد لا يقل عن 5 أطباق في "النور" و "الثقيل" سكان الخلية. ثقافة الخلايا في 30 مل من المتوسط / طبق O / N.
- إزالة المتوسطة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. فصل الخلايا في 1XPBS باستخدام مكشطة الخلية.
- عدد سكان كل منهما خلية باستخدام غرفة عد نويباور وتجمع أعداد الخلايا متساوية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
- إزالة PBS و resuspend بيليه خلية في 1 مل من عازلة السكروز (0.25 M السكروز، 1 ملم EDTA، و1 ملم DTT، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). نقل تعليق خلية إلى ضيقة الخالط Dounce وليز الخلايا مع 200 السكتات الدماغية على الجليد.
ملاحظة: تأكيد تحلل الخلية الكامل باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. - نقل المحللة في أنبوب 1.5 مل microfuge وتدور باستمرار نوى وحطام خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 ° C.
- بعد الطرد المركزي، وتخزين قسامة من 25 ميكرولتر من جزء آخر من الأسلحة النووية (PNS) في -20 ° C كعنصر تحكم الإدخال.
- ضع بقية جزء الجهاز العصبي المحيطي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم) وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3 مل، 4 مل طفلالله) (50 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم 7.4 درجة الحموضة، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم، 1 ملم EDTA، و1 ملم phenylmethanesulfonyl الفلورايد).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 100000 x ج و 4 ° C. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب (حوالي 250-500 ميكرولتر، اعتمادا على كمية من قطرات الدهون). وضع جزء الدهون قطرة في أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم)، وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3.5 مل، 4 مل الكل)، وكرر الخطوة الطرد المركزي.
- حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب ونقل قطرات الدهون إلى 1.5 أنبوب جديد microfuge مل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة الدهون قطرة وتدور لمدة 20 دقيقة في 21000 x ج و 4 ° C.
ملاحظة: قطرات الدهون تظهر والفرقة بيضاء تطفو على أعلى العازلة. - إزالة غسل العازلة تحتاني باستخدام هلام تحميل ماصة وكرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات.
- بعد إزالة النهائية للغسل العازلة باستخدام هلام تحميل ماصة، مزيج 5 ميكرولتر من الكسور قطرات الدهون مع 10 ميكرولتر من NP-40 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1٪ NP-40 ، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق. وهناك حاجة لا يقل عن 35 ميكروغرام من البروتين لMS-التحليل.
- تخزين الدهون كسور قطرة في -20 ° C.
- مزيج حجم المماثل من قطرات جزء الدهون مع 4x وصبغ التحميل. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. يغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- فصل البروتينات باستخدام SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الصانعين. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال جميع العصابات البروتين من الهلام. بعد تريبسيني في جل الهضم 24 </ سوب>، تتبخر العينات ويحل لهم في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. تحليل من قبل LC-MS / MS.
ملاحظة: هنا، وLC-MS / MS أجريت التحليلات على الرباعي وقت من الطيران مطياف الكتلة (Q-TOF) أو على مصيدة الخطي الرباعي (LTQ) orbitrap مطياف الكتلة. وإلى جانب كل من الأدوات مع ESI المصدر إلى نظام نانو UPLC. تحليل البيانات وLC-MS / MS تحليل على Q-TOF وعلى مطياف الكتلة orbitrap أجريت على النحو المبين 21 و 22. الحرص على عدم تلويث العينة مع الكيراتين الإنسان. دائما استخدام نصائح ماصة خالية من الكيراتين وأنابيب. إعداد مخازن تحت غطاء تدفق الصفحي مع المواد الكيميائية خالية من الكيراتين. قبل الاستخدام، وتنظيف جميع الأسطح والأجهزة مع الماء المقطر والايثانول. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر.
4. تحليل الدهون القطرة الطهارة
- تمييع aliquots من الدهون كسور قطرة 1: 2 وكسور الإدخال (راجع الخطوة 3.9) 01:10 مع NP-40 ليزهو العازلة. احتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
- خلط كميات متساوية من البروتين العازلة مع عينة 6X واحتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. المضي قدما SDS-PAGE ونقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من النشاف دبابات على 80 V لمدة 90 دقيقة.
ملاحظة: بعد حجب الغشاء في عرقلة العازلة (الخالي المجففة مسحوق الحليب 5٪ في TBS-T (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ Tween20))، واحتضان مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات قطرات الدهون (على سبيل المثال ، PLIN1، PLIN2، أو PLIN3) وعلامات من المقصورات التحت خلوية أخرى (على سبيل المثال، CALR، MnSOD، أو تويولين)، تليها الأجسام المضادة إلى جانب HRP الثانوية. استخدام التوهج للكشف عن البروتينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قطرات الدهون ضرورية لفيروس التهاب الكبد الوبائي مثل المواقع المفترضة التجمع الفيريون، ولكن الآليات الجزيئية من التشكل والخروج من virions غير معروفة إلى حد كبير. لتحديد عوامل التبعية المضيف جديدة تشارك في هذه العملية، أجرينا الكمي تحليل بروتيوم الدهون قطرة من الخلايا المصابة HCV 21 (الشكل 1A). أنشأنا بروتوكول لتنقية قطرات الدهون وبشكل روتيني الكشف عن تخصيب قوي من الدهون ملزم قطرة البروتينات PLIN2 / ADRP وPLIN3 / TIP47 واستنزاف علامات الأجزاء الخلوية الأخرى، مثل β تويولين للالأنابيب الدقيقة، MnSOD للالميتوكوندريا، أو calreticulin / calnexin لER (الشكل 1B، C). نحن بتجميع قائمة من البروتينات التي cofractionate موثوق مع قطرات الدهون في الخلايا Huh7.5 (1D الشكل)، وذلك باستخدام النظائر وضع العلامات، والبروتينات التي تم تحديدها على وجه التحديد أن يتم تجنيدأو النازحين من قطرات الدهون في الخلايا المصابة HCV (الشكل 1E). وتشير النتائج التي توصلنا إليها HCV يفصل قطرات الدهون من وظيفة عادية في التمثيل الغذائي و / أو تنظيم وتحديد تبعية المضيفة وتقييد العوامل المفترضة.
شكل 1: (A) مخطط للتجربة. وصفت الخلايا Huh7.5 ساذجة مع الأحماض الأمينية "الثقيل" أو "خفيفة" الأحماض الأمينية. والخلايا المصابة تحمل "خفيفة" الأحماض الأمينية مع فيروس HCV مراسل (JC1 NS5AB-mKO2-BSD). كانت مختلطة "لايت" و "الثقيل" السكان المسمى الأحماض الأمينية، وتم عزل قطرات الدهون من قبل اثنين من تنبيذ فائق لاحق وثلاثة غسل الخطوات، مفصولة SDS-PAGE، وتحليلها من قبل LC-ESI-MS / MS. لاحظ العائمة الأبيض جزء الدهون قطرة (السهم الأحمر) بعد ultracentrifugati على والغسيل في أنابيب microfuge. (B) تحليل لطخة غربية الكسور قطرة آخر النووية والدهون ويظهر في إثراء الدهون البروتينات قطرة علامة في أجزاء قطرات الدهون واستنزاف علامات الأجزاء الخلوية الأخرى. (C) Coomassie الأزرق والفضة تلطيخ من طاف بعد النووي (السندات الإذنية) وكسور قطرات الدهون مفصولة SDS-PAGE. ويرد تلطيخ الفضة لتصور فقط. (D) مخطط النشاط لعدد من الببتيدات ونسبة التغطية بروتين من البروتينات التي تم تحديدها في كسور الدهون قطرة من خلايا Huh7.5 (قطع: ≥5 الببتيدات وتغطية ≥20٪). (E) مخطط النشاط يصور المخصب أو المنضب الدهون البروتينات المرتبطة قطرة بعد الإصابة بفيروس HCV (تطبيع لمتوسط، قطع 1.5 أضعاف، * ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001). تعديل من 21.وآخرون = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل قطرات الدهون لتحليل الدهون قطرات بروتيوم الكمي لمقارنة التخصيب واستنزاف البروتينات المرتبطة قطرات الدهون في ظل ظروف ثقافة متنوعة، مثل الالتهابات الفيروسية. كطريقة بديلة، يمكن إجراء تحليل بروتيوم مع quantifications خالية من التسمية على أساس مجموع شدة الذروة. هذا الأسلوب لديه أي قيود النطاق الديناميكي ويتجنب المشاكل الأيضية. الاستفادة من نهج SILAC هي أن العينات يتم تجميع السابقة الدهون قطرات العزلة، وبالتالي فإن النتائج تكون مستقلة عن أخطاء في إعداد العينات، الهضم، وتحليل LC-MS / MS. ونحن نوصي بشدة هذا النهج لدهن الكمي تحليل قطرة بروتيوم.
كما إثراء أو استنزاف البروتينات المرتبطة قطرات الدهون لوحظ في تحليل MS يمكن أن تعكس لمحة تعريفية أو قمع التعبير البروتين، وتحليل مستويات التعبير quantitativالبريد RT-PCR و (يفضل) ينصح النشاف الغربي. وبالإضافة إلى ذلك، طريقتين يمكن استخدامها للتحقق من تخصيب أو نضوب بروتينات معينة في قطرات الدهون: العزلة قطرات الدهون تليها الغربية النشاف والتحليل المناعي مع الأصباغ محبة للدهون، مثل BODIPY أو LD540، أن قطرات الدهون وصمة عار على النحو المبين 21.
إجراء تجارب مع شروط وضع العلامات تبادلت للتأكد من أن وضع العلامات مع الأحماض الأمينية "الثقيلة" لا تؤثر على التعبير البروتين أو الدهون قطرات التوطين وتحديد الملوثات البروتين من المصادر البيئية المتوسطة "خفيفة" و. لتحديد البروتين، يجب أن يتم تنفيذ البحث مع كاذبة معدل اكتشاف (FDR) من 0.01 على كل من الببتيد ومستوى البروتين. لضمان تحقيق نتائج ثقة عالية، ونحن ننصح أداء لا يقل عن 3 - 4 تجارب مستقلة، مع خلايا من مقاطع مختلفة، ومختلفة الاستعدادات الأسهم الفيروس. اعتمادا على مagnitude التغيير، قد تكون هناك حاجة تجارب أكثر استقلالية.
لتطبيع البيانات MS الكمية لتصحيح مختلفة قليلا أعداد الخلايا أو قطرات الدهون، مركز نسب الكشف عن "النور" على الببتيدات "الثقيلة"، أو العكس بالعكس، في ظروف وصفها تبادلت بقسمة من خلال متوسط جميع البروتينات التي تم تحديدها ، كما هو موضح 25. إذا كانت كمية قطرات الدهون يختلف بشكل كبير بين العينات، وتطبيع للبروتينات الدهنية علامة قطرة، مثل PLIN2، قد يكون من المستحسن. عندما كنا تطبيع البيانات MS جهدنا لمستويات PLIN2، نجد نتائج مماثلة كما أننا عندما تطبيع لمتوسط (تحليل لا تظهر). وتجدر الإشارة، في ظل ظروف زراعة الخلايا التي نستخدمها، نحن لا كشف عن تراكم كبير الدهون قطرات على فيروس التهاب الكبد الوبائي.
قطرات الدهون هي على اتصال وثيق مع العضيات الخلوية الأخرى، وأبرزها الميتوكوندريا وER. ولذلك، البروتينات ومدمج هذه المقصورات يمكن أن تشارك في يجزئ مع قطرات الدهون أثناء العزلة. إذا كان هذا "ملوث" البروتين هو دون تغيير في وفرة في الاستجابة للعدوى أو العلاج، وانها لن تؤثر على تحليل الدهون قطرات بروتيوم المقارن. وتجدر الإشارة، مع ذلك، أنه في ظل بعض الظروف، والاتصال بين قطرات الدهون والعضيات الأخرى التي يمكن تغييرها. على سبيل المثال، في ظل ظروف دهون، تم الكشف عن البروتينات الميتوكوندريا على ترددات أعلى في الأجزاء الدهنية قطرة من الخلايا الشحمية 3T3-L1 حفز lipolytically مقارنة مع الظروف القاعدية 26. حفز دي نوفو تكون الدهون، من ناحية أخرى، قد يؤدي إلى تعزيز الشراكة مع ER. ثم تعكس هذه التغييرات تغييرات في التفاعل عضية الناجمة عن مختلف المحفزات وقد تكون مثيرة للاهتمام، وحتى إن لم يكن تعبيرا عن خالص توطين الدهون الحبرية.
استخدمنا هذا البروتوكول لدهن الكمي قطرة proteom واسعة النطاقتحليل (ه) من الخلايا غير المصابة السيطرة مقابل المصابة HCV للكشف عن الاضطرابات الناجمة عن فيروس التهاب الكبد الوبائي وتحديد المنظمين النسخ المتماثل HCV 21. في خط الخلية الكبدي Huh7.5، حددنا بشكل روتيني حتى 2900 البروتينات داخل كسور الدهون الحبرية، مع ~ 300 البروتينات التي تم تحديدها مع الببتيدات متعددة في كل تجربة. بعد الإصابة مع HCV، لاحظنا تجنيد واستنزاف للبروتينات المضيف كليهما. عدة بروتينات يدعى عالي التخصيب في قطرات الدهون من الخلايا المصابة HCV وقد نشرت سابقا العوامل المضيفة HCV (على سبيل المثال، مربع DEAD البروتينات 1 و 3 (DDX1، DDX3) أو عامل-II النمو الذي يشبه الانسولين بروتين 1 (مرنا-ملزمة IGF2BP1))، مما يدل على مصداقية النهج SILAC 27 و 28 و 29. وبالإضافة إلى ذلك، غالبا ما المشروح البروتينات تجنيدهم للبروتينات ملزم RNA، وتسليط الضوء على جمعية ضيقة من نسخ مماثلة RNA الفيروسيالمجمعات أوجه مع كسور الدهون الحبرية. في المقابل، والبروتينات المنضب من قطرات الدهون المشروح أساسا لعمليات الأيض الدهون، مشيرا إلى أن HCV يشوش تكوين البروتين لفصل قطرات الدهون من تنظيمها التمثيل الغذائي العادي وظيفة.
البروتوكول وصفنا هو قابلة للتعديل لخطوط مختلفة من الخلايا والظروف والثقافة، ويمكن أن تساعد في فك رموز وظيفة قطرات الدهون في دورة الحياة من مسببات الأمراض المختلفة التي تعتمد على قطرات الدهون للنسخ المتماثل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر R. Bartenschlager (جامعة هايدلبرغ) ليبني JC1، CM رايس (جامعة روكفلر) للخلايا Huh7.5، J مكلوشلان (مجلس البحوث الطبية وحدة علم الفيروسات) لبناء، T واكيتا (المعهد الوطني للJFH1 الأمراض المعدية، واليابان) لJFH1، وB وبستر ووك غرين (معهد جلادستون لعلم الفيروسات والمناعة) ليبني مراسل HCVcc. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من DFG (HE 6889 / 2-1 (EH)، INST 337 / 15-1 2013، وINST 337 / 16-1 2013 (HS)). ويدعم معهد هاينريش بيت، معهد ليبنيز لعلم الفيروسات التجريبي من قبل الحرة ومدينة هامبورغ ووزارة الصحة الاتحادية. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
