Summary
gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.
Abstract
gotículas lipídicas são vitais para a replicação de uma variedade de diferentes agentes patogénicos, mais proeminentemente o vírus da hepatite C (VHC), tal como o local putativo de morfogese do viri. análise do proteoma de gotículas de gordura quantitativo pode ser usado para identificar proteínas que se localizam a ou são deslocadas a partir de gotículas lipídicas em condições, tais como infecções por vírus. Aqui, descrevemos um protocolo que tem sido utilizado com sucesso para caracterizar as alterações no proteoma de gotículas de gordura após a infecção com HCV. Usamos Stable Isótopos Etiquetagem com Aminoácidos em cultura celular (SILAC) e, assim, identificar o proteoma completa de uma população de células com aminoácidos "pesadas" para quantificar as proteínas por espectrometria de massa. Para o isolamento de gotículas de gordura, as duas populações de células (isto é, / "leves" aminoácidos infectados com HCV e / aminoácidos não infectadas de controlo "pesadas") são misturados 1: 1 e lisadas mecanicamente em tampão hipotónico. Após a remoção dos núcleos e de células debris por centrifugação a baixa velocidade, as proteínas associadas a gotícula de lípido são enriquecidos por dois passos de ultracentrifugação subsequentes seguidos de três passos de lavagem em tampão isotónico. A pureza das fracções de gotículas lipídicas é analisada por transferência de western com anticorpos que reconhecem diferentes compartimentos subcelulares. proteínas associadas a gotícula de lípido são então separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida por manchamento de Coomassie. Após digestão tríptica, os péptidos são quantificados por espectrometria de massa de cromatografia de ionização por electrospray-tandem líquido (LC-ESI-MS / MS). Usando este método, identificamos proteínas recrutados para gotículas lipídicas após infecção HCV que possam representar fatores do hospedeiro pró ou anti-virais. O nosso método pode ser aplicado a uma variedade de diferentes células e condições de cultura, tais como a infecção com agentes patogénicos, o stress ambiental, ou tratamento com droga.
Introduction
Gotículas lipídicas são altamente citoplasmáticos (e nucleares) organelos celulares dinâmicas compostas por um núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) e éster de colesterol (EC)) fechado por uma monocamada de fosfolípidos com proteínas incorporadas 1. Todos os tipos de células produzem gotículas lipídicas, mas que variam em tamanho, composição lipídica, e decoração proteína. gotículas lipídicas cumprir diversas funções, incluindo a servir como reservatórios de energia e precursores de membrana ou como depósitos de proteínas. Além disso, através da absorção de lípidos, que protegem as células de lipotoxicidade, lípidos de libertação como moléculas de sinalização, e estão envolvidas na degradação da proteína e respostas a stress do retículo endoplasmático (ER) 2. Como tal, uma série de proteínas ligar-se a gotículas de lípidos e regular a sua geração, degradação, tráfego e interacção com outros organelos. Entre elas estão a família de proteínas de ligação perilipin gotícula de lípido bona fide (PLIN1-5)f "> 3.
Lipid gota biogénese provável começa no ER, em que as enzimas ER-residente catalisar a síntese de lípidos neutros que se acumulam no interior da bicamada da membrana, formando uma lente de lípidos neutros, um processo que foi recentemente visualizado bem em levedura 4. Membrana de dobragem e os níveis de ácido e diacilglicerol fosfatídicos elevadas são depois pensado para atrair as proteínas envolvidas na biossíntese de fosfolípido, como a síntese simultânea dos lípidos neutros e dos fosfolípidos do núcleo de blindagem é necessário para a geração de gotículas de gordura 5. Enzimas que albergam domínios transmembranares que residem no ER catalisar este processo. Expansão de grandes gotículas lipídicas requer a actividade de uma classe diferente de enzimas de síntese de lípidos que abrigam uma hélice anfipática e pode, assim, viajam do RE para gotículas lipídicas. A mobilização de lípidos de gotículas lipídicas ocorre através da activação local do triglicéridese diacilglicerol e lipases da lipase de triglicéridos adiposo (ATGL) e sensível a hormonas lipase (HSL) ou por diferentes vias autofágicos, tais como macro e microlipophagy ou autofagia 6 chaperona-mediada. Gotículas lipídicas interagir com outros organelos celulares, tais como as mitocôndrias (para beta-oxidação e a síntese de lípidos) e ER (para a síntese de lípidos e o tráfico de proteína), mas também com os lisossomas, endossomas, e os vacúolos induzidas por bactérias intracelulares 7. Com efeito bactérias, vírus, parasitas e mesmo alvo gotículas lipídicas para replicação e persistência, entre os quais o HCV 8.
Infecção pelo HCV é uma das principais causas de morbidade relacionada com o fígado e mortalidade no mundo, respondendo por cerca de 0,5 milhões de mortes por ano 9. O verdadeiro número de infecções por HCV é desconhecida, mas as estimativas recentes sugerem que 130 - 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas. Sem vaccine existe, mas os antivirais de actuao directa recentemente aprovados aumentar dramaticamente a resposta terapêutica em comparação com a terapia à base de interferão padrão. No entanto, em todo o mundo, o tratamento de pacientes provavelmente será restrito devido aos custos extremamente elevados das novas terapias. Cerca de metade de todos os indivíduos cronicamente infectados com VHC desenvolvem a doença de fígado gordo (esteatose), uma condição caracterizada pela acumulação excessiva de gotículas lipídicas em hepatócitos. De forma intrigante, gotículas lipídicas também surgiu como organelos celulares vitais para a replicação do HCV, putativamente servir como locais de montagem virais 10, 11.
Em células infectadas com HCV, a proteína do núcleo virai e NS5A localizar de gotículas lipídicas em um processo de que depende a biossíntese de triglicéridos, como inibidores de diacilglicerol aciltransferase-1 (DGAT1) prejudicar o tráfico de gotículas lipídicas e subsequente produção de partículas de HCV 12 >, 13, 14, 15. Além disso, as mutações nos domínios de ligação de gotículas lipídicas de qualquer núcleo ou NS5A suprimir montagem de VHC 16, 17. Núcleo e, em seguida, NS5A recrutar todas as outras proteínas virais, bem como complexos de replicação do ARN viral, para as membranas estreitamente associadas com lípidos gotas 16. É necessária uma acção concertada de todas as proteínas virais para a produção bem sucedida de progenitura viral infecciosa 10, 11. As proteínas estruturais são parte dos viriões, e as proteínas não estruturais promovem as interacções proteína-proteína necessárias para este processo. Curiosamente, o bona fide lípido-proteína de ligação de gotículas PLIN3 / TIP47 é necessário para a replicação do ARN de HCV e a libertação de viriões de 18, 19
Aqui, descrevemos um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas. Utilizando este método, foram encontradas alterações profundas no proteoma gotícula de lípido, durante a infecção pelo HCV e identificado anexina A3 como uma proteína hospedeira que co-fracciona com gotículas lipídicas e é necessário para a maturação de HCV eficiente 21.
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Protocol
1. Preparação de Meios para Stable Isótopos Etiquetagem com Aminoácidos em cultura celular (SILAC)
NOTA: Aqui, a quantificao Kit SILAC Proteína - DMEM suplementado com 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl foi utilizado para rotulagem SILAC. O dialisado Soro Fetal de Vitelo (FCS) é fornecido com o Kit de Quantificao SILAC proteína.
- Remover 50 mL de cada frasco de meio DMEM e adicionar 50 ml de FCS dialisado.
- Dissolve-se 50 mg de 13 C 6 L-Lisina-2HCl e 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl em 1 mL de meio. Misturar bem e adicionar os ácidos aminados ao meio DMEM + FCS.
- Adicionar 1x Pen / Strep e 1x substituto L-glutamina. Esterilizada por filtro do meio utilizando um filtro de 0,45. Rotular o frasco como meio SILAC "pesado".
- Para preparar o meio de "luz", repetir os passos 1,1-1,3 usando 50 mg de L-Arginina-HCl e 50 mg de L-Lisina-2HCl. Rotular o frasco como "luz" médio SILAC.
2. SILAC-rotulagem e Controlo de Aminoácidos Incorporação
- Tripsinizar as células (1x tripsina-EDTA) e de divisão de 1 x 10 5 células Huh7.5 em 2 pos de uma placa de cultura de 6 cavidades contendo 2 mL de meio, um poço com a forma SILAC "pesadas" e um com a "luz" meio SILAC.
- Cultura das células durante, pelo menos, 6 passagens (relação de divisão 1:: 6); depois de 6 passagens, a incorporação dos aminoácidos "pesadas" deve ser mais do que 95%.
- Colheita 1 x 10 6 culas do "pesado" - população celular marcado com e "luz" para analisar a eficácia de incorporação. Lavam-se as células em PBS 1x e peletizar as células por centrifugação durante 5 min a 160 xg e 4 ° C.
- Ressuspender as peletes de células em 150 uL de SM-tampão (150 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, e EDTA 1 mM suplementado com um cocktail inibidor de protease 1x) e incuba-se as células em gelo durante 30 min. Lyse o cells por ultra-sons a 4 ° C.
NOTA: A seguir estão as configurações de sonicação usados aqui: temporizador, segure; de controlo de saída, 8; ciclo de serviço, 80%; e 2 x 30 pulsos. - Remover os resíduos celulares por centrifugação durante 10 min a 11000 xg e 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e determinar a concentração de proteínas com um ensaio de proteína compatíveis com detergentes.
- Misturar 75 ug de proteína com tampão de amostra de 6x (Tris-HCl a 375, pH 6,8, 25,8% de glicerol, 123 mg / ml de SDS, azul de 600 ug / bromofenol mL, e 60 uL / mL β-mercaptoetanol), fervura em 95 ° C, durante 5 minutos, e separar as proteínas por SDS-PAGE em SDS tampão de corrida (3,02 g / base Tris, 18,8 g / l de glicina, e 1 g / L de DPS) a 180 V durante aproximadamente 1 h, ou de acordo com os fabricantes "instruções.
- Transferir o gel em solução coloidal coloração com Coomassie. Extirpar a mesma banda de proteína de cada pista. Digerir as proteínas com tripsina e analisar a eficácia de incorporação por MS analysis, tal como descrito 22.
3. Lipid gota Isolamento de células Huh7.5 marcado com SILAC
- Infectar uma população de células (por exemplo, os marcados com aminoácidos "leves"), com um virus repórter VHC por incubação com reservas de vírus (por exemplo, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) durante 4 h a 37 ° C, tal como descrito 21 .
NOTA: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD é um vírus HCV transportando um repórter fluorescência (monomérica Kusabira laranja 2, mKO2) para monitorizar as taxas de infecção, seguida por um gene de resistcia a blasticidina (DEB) entre um local de clivagem duplicado NS5A-NS5B, descrito anteriormente 21, 23. Trabalho com HCV requer BSL2 + (EUA) ou S3 ** (Alemanha) contenção e práticas em nível de biossegurança. Em vez de infecção com HCV, as células podem ser infectadas com diferentes agentes patogénicos. - Expandir as células infectadas pelo HCV "light" e não infectados & #34;. As células pesadas", Durante a passagem das culturas, fixar-se uma alíquota com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS e determinar as taxas de infecção de HCV por citometria de fluxo da proteína marcador fluorescente (por exemplo, mKO2), tal como descrito 21; a as taxas de infecção deve ser maior do que 90% de lípido gota isolamento. NOTA: Se usando o Jc1 NS5AB-mKO2-BSD estirpe de HCV, adicionam-se 10 ug / ml de blasticidina S para a forma "luz" para seleccionar as células-HCV positivo.
- 1 d antes do isolamento de gotículas de gordura, lava-se as células com PBS, trypsinize, ressuspender em "luz" e "pesados" médio, e contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Semente de 7 x 10 6 culas de cada população em uma placa de cultura de 150 centímetros 2 célula. Prepare pelo menos 5 pratos por população de células "light" e "pesado". Cultura das células em 30 mL de meio / placa S / N.
- Remover o meio e lava-se as células em PBS 1x. Separe as células em 1xPBS utilizando um raspador de células.
- Contagem de ambas as populações de células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer e reunir os números de células iguais em um tubo de centrífuga de 50 mL. Sedimentar as células por centrifugação durante 5 min a 160 xg e 4 ° C.
- Remover o PBS e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de tampão de sacarose (sacarose 0,25 M, EDTA 1 mM, e DTT a 1 mM, suplementado com um cocktail inibidor de protease). Transferir a suspens celular para um homogeneizador de Dounce apertada e lisar as células com 200 batidas em gelo.
NOTA: Confirme a lise celular completa utilizando a coloração azul de tripano. - Transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e girar para baixo os núcleos e fragmentos de células durante 10 min a 1000 xg e 4 ° C.
- Após centrifugação, armazenar-se uma alíquota de 25 uL da fracção pós-nuclear (SNP) a -20 ° C como um controlo de entrada.
- Coloque o restante da fracção de PNS na parte inferior do tubo de centrifugação (11 x 60 mm) e sobrepor com tampão de lavagem de lípidos gota (~ 3 mL; 4 mL totai) (50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,4, cloreto de potássio 100 mM, EDTA 1 mM e fluoreto de fenilmetano-sulfonilo 1 mM).
- Centrifugar durante 2 h a 100.000 xg e 4 ° C. Colher a fracção de gotículas de gordura flutuante usando um dobrado, cânula romba a partir do topo do tubo (aproximadamente 250-500 ml, dependendo da quantidade de gotículas lipídicas). Coloque a fracção de gotículas de gordura em um tubo de ensaio (11 x 60 mm), sobreposição com tampão de lavagem de lípidos gota (~ 3,5 mL; 4 mL no total), e repetir a etapa de centrifugação.
- Colher a fracção de gotículas de gordura flutuante usando um dobrado, cânula romba a partir do topo do tubo e transferir as gotículas lipídicas para um novo tubo de microcentruga de 1,5 mL. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem de gotículas de gordura e centrifugação durante 20 min a 21000 xg e 4 ° C.
NOTA: gotículas lipídicas aparecer como uma banda branca que flutua no topo do tampão. - Remover o tampão de lavagem subjacente utilizando uma ponta de pipeta de carga do gel e repetir este passo de lavagem três vezes.
- Após a remoção final do tampão de lavagem utilizando uma ponta de pipeta de carregamento de gel, misturar 5 uL de fracções de gotículas lipídicas com 10 ul de NP-40 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM e NP-40 a 1% , suplementado com um cocktail inibidor de protease). Incubar a amostra em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Determinar o nível de proteína com um ensaio de proteína de detergente-compatível; pelo menos 35 ug de proteína são necessárias para MS-análise.
- Armazenar as fracções de gotículas de lípidos, a -20 ° C.
- Mistura-se o volume correspondente da fracção de gotículas de gordura com 4x carga de corante. Incubar em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Ferver a 95 ° C durante 5 min.
- Separaram-se as proteínas utilizando SDS-PAGE de acordo com o protocolo dos fabricantes. Transferir o gel em solução coloidal coloração com Coomassie. Excisar todas as bandas de proteína a partir do gel. Depois da digestão tríptica no gel 24 </ Sup>, evapora-se as amostras e os dissolver em ácido fórmico a 0,1%. Analisar por LC-MS / MS.
NOTA: Aqui, LC-MS / MS foram realizadas análises em um espectrômetro de massa Quadrupole-Time-of-Flight (Q-TOF) ou em uma armadilha Linear Quadrupole (LTQ) Orbitrap espectrômetro de massa. Ambos os instrumentos foram acoplados com uma ESI-fonte para um sistema de nano-UPLC. Análise dos dados e análises de LC-MS / MS no Q-TOF e no espectrómetro de massa Orbitrap foram realizadas como descrito 21, 22. Tome muito cuidado para não contaminar a amostra com queratina humana. Utilize sempre pontas de pipeta isentas de queratina e tubos. Preparar tampões sob a câmara de fluxo laminar com produtos químicos isentos de queratina. Antes da utilização, limpar todas as superfícies e dispositivos com água destilada e etanol. Use sempre luvas e uma bata de laboratório.
4. Análise of Lipid Gota Pureza
- Dilui-se alíquotas de fracções de lípidos de gotículas 1: 2 e as fracções de entrada (ver passo 3.9) 01:10 com NP-40 a Lysé tampão. Incubar as amostras sobre gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Determinar o nível de proteína com um ensaio de proteína compatíveis com detergentes.
- Misture quantidades iguais de proteína com tampão de amostra de 6x e incuba-se as amostras em gelo durante 1 hora para inactivar o vírus se trabalhar com material infeccioso. Prosseguir com SDS-PAGE e transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose por blotting tanque a 80 V durante 90 min.
NOTA: Depois de bloquear a membrana em tamp de bloqueio (5% seca-se leite magro em pó em TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, e 0,05% de Tween 20)), incubar com anticorpos dirigidos contra marcadores de gotículas de gordura (por exemplo, , PLIN1, PLIN2, ou PLIN3) e os marcadores de outros compartimentos subcelulares (por exemplo, Calr, MnSOD, ou tubulina), seguido por anticorpos acoplados a HRP secundário. Use de quimiluminescência para a detecção de proteínas.
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Representative Results
gotículas lipídicas são vitais para a infecção por HCV, como os locais putativos de montagem do virião, mas os mecanismos moleculares da morfogénese e saída de viriões são em grande parte desconhecida. Para identificar os factores de dependência hospedeiro novos envolvidos neste processo, foi realizada a análise do proteoma de gotículas de gordura quantitativa de células infectadas com HCV 21 (Figura 1A). Foi estabelecido um protocolo para a purificação de gotículas lipídicas e rotineiramente detectada um forte enriquecimento do lido de ligao a gota proteínas PLIN2 / ADRP e PLIN3 / TIP47 e uma depleção de marcadores de outros compartimentos celulares, tais como β-tubulina em microtúbulos, MnSOD para as mitocôndrias, ou calreticulina / calnexina para o ER (Figura 1B, C). Nós compilada uma lista de proteínas que cofractionate forma fiável com gotículas lipídicas em células Huh7.5 (Figura 1D) e, usando marcação isotópica, proteínas identificadas que são recrutados especificamenteou deslocadas de gotículas lipídicas em células infectadas com HCV (Figura 1E). Nossos resultados indicam que o HCV desconecta gotículas lipídicas da sua função e / ou regulação metabólica regular e identificar os fatores de dependência de acolhimento e de restrição putativos.
Figura 1: (A) Esquema da experiência. células Huh7.5 naive foram marcadas com ácidos "pesado" amino ou aminoácidos "light". As células que transportam aminoácidos "leves" foram infectadas com um vírus repórter VHC (NS5AB Jc1-mKO2-DEB). populações marcada com ácido "leves" e "pesados" aminados foram misturados, e gotículas lipídicas foram isoladas por ultracentrifugação duas subsequente e três passos de lavagem, separados por SDS-PAGE e analisadas por LC-ESI-MS / MS. Note-se a fracção flutuante branco gotícula de lípido (seta vermelha) após ultracentrifugati no e lavagem em tubos de microcentrífuga. (B) Análise de transferência de Western de fracções pós-nucleares de gotículas lipídicas e mostra um enriquecimento de proteínas marcadoras de gotículas lipídicas em fracções de gotículas de gordura e uma depleção de marcadores de outros compartimentos celulares. (C) de Coomassie azul e coloração com prata de sobrenadante pós-nuclear (PNS) e fracções de gotículas lipídicas, separadas por SDS-PAGE. coloração de prata é apresentada apenas para visualização. (D) Heatmap do número de péptidos e a percentagem de cobertura de proteína de proteínas identificadas em fracções de gotículas lipídicas de células Huh7.5 (corte: ≥5 péptidos e cobertura ≥20%). (E) Heatmap que descreve enriquecida ou empobrecida proteínas associadas a gotículas de lípidos depois da infecção com VHC (normalizados para a média, de corte de 1,5 vezes, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Modificado de 21.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para isolar gotículas lipídicas para análise quantitativa do proteoma gotícula de lípido para comparar o enriquecimento e empobrecimento de proteínas associadas com gotículas lipídicas sob diversas condições de cultura, tais como infecções virais. Como um método alternativo, a análise do proteoma pode ser realizada com quantificações, livre de marcador com base no total de intensidades de pico. Este método não tem nenhuma limitação da gama dinâmica e evita problemas metabólicos. A vantagem da abordagem SILAC é que as amostras são reunidas antes do isolamento gotícula de lípido, e por conseguinte, os resultados são independentes de erros na preparação de amostras, digest e anise por LC-MS / MS. Recomendamos vivamente esta abordagem para análise gota proteoma lipídico quantitativa.
À medida que o enriquecimento ou empobrecimento de proteínas associadas a gotículas lipídicas observadas na análise MS poderia reflectir uma indução ou repressão da expressão da proteína, a análise dos níveis de expressão por quantitative RT-PCR e (preferivelmente) western blotting é aconselhada. Além disso, os dois métodos podem ser utilizados para verificar o enriquecimento ou empobrecimento de proteínas específicas em gotículas lipídicas: o isolamento de gotículas de gordura seguido de western blotting e análise por imunofluorescência com corantes lipoficos, como BODIPY ou LD540, que as gotículas lipídicas mancha como descrito 21.
Realizar experiências com as condições de rotulagem trocadas para assegurar que a marcação com aminoácidos "pesadas" não influencia a expressão da proteína ou lípido gota a localização e a identificação de contaminantes de proteína a partir do meio de fontes ambientais "luz" e. Para a identificação de proteínas, a busca deveria ser realizada com uma taxa de falsos descoberta (FDR) de 0,01 em ambos o nível de proteína e péptido. Para garantir resultados de alta confiança, que aconselham realizando, pelo menos, 3 - 4 experiências independentes, com células de diferentes passagens e diferentes preparações de vírus. Dependendo da mmagnitude dessa mudança, experimentos mais independentes pode ser necessária.
Para normalizar os dados quantitativos MS para corrigir para os números de células ou gotículas lipídicas ligeiramente diferente, o centro de rácios de detecção de a "luz" ao longo dos péptidos de "pesados", ou vice-versa, em condições de rotulagem permutadas pela divisão através da mediana de todas as proteínas identificadas , tal como descrito 25. Se a quantidade de gotículas lipídicas difere significativamente entre as amostras, para normalizar as proteínas marcadoras de gotículas de lípidos, tais como PLIN2, pode ser aconselhável. Quando normalizar nossos dados MS aos níveis PLIN2, encontramos resultados semelhantes como quando normalizar a mediana (análise não mostrados). De nota, sob as condições de cultura celular que usamos, nós não detectar significativa acumulação de gotículas de gordura sobre a infecção pelo HCV.
gotículas lipídicas estão em estreito contacto com outros organelos celulares, mais notavelmente as mitocôndrias e o ER. Portanto, as proteínas from estes compartimentos podem co-fraccionar com gotículas lipídicas durante o isolamento. Se uma proteína "contaminante" como é inalterado em abundância em resposta a infecção ou tratamento, que não afectará a análise de lípidos gota proteoma comparativa. Deve-se notar, no entanto, que, sob algumas circunstâncias, o contacto entre as gotículas lipídicas e outros organelos pode ser alterada. Por exemplo, sob condições lipolíticas, proteínas mitocondriais são detectada a frequências mais elevadas em fracções de gotículas de gordura de lipolytically estimuladas adipócitos 3T3-L1, em comparação com condições basais 26. Estimulados de novo lipogênese, por outro lado, pode levar a associação reforçada com a ER. Estas alterações então reflectir as alterações na interacção organelo induzidas pelos vários estímulos e pode ser interessante, mesmo se não reflexivo de puro localização de gotículas de gordura.
Utilizou-se este protocolo durante um extenso gota proteom lípido quantitativaanálise e de, células de controlo não infectadas contra infectados com o HCV para revelar as perturbações causadas por infecção pelo HCV e para identificar reguladores de replicação do HCV 21. Na linha de células de hepatoma Huh7.5, que rotineiramente identificados até 2.900 proteínas dentro de fracções de gotículas de lípido, com ~ 300 proteínas identificadas com vários péptidos em cada experiência. Após a infecção com HCV, observou-se o recrutamento ambos e esgotamento de proteínas do hospedeiro. Várias proteínas identificadas como altamente enriquecido em gotículas lipídicas de células infectadas com HCV foram anteriormente publicados como factores do hospedeiro de HCV (por exemplo, proteínas dead box 1 e 3 (DDX1, DDX3) ou o factor-II de crescimento semelhante a insulina de proteína 1 (ARNm de ligao IGF2BP1)), indicando a confiabilidade da abordagem SILAC 27, 28, 29. Além disso, as proteínas são muitas vezes recrutados anotada para proteínas de ligação a ARN, destacando a associação apertada do replic de ARN viralcomplexos ation com fracções de gotículas lipídicas. Em contraste, as proteínas empobrecido de gotículas lipídicas foram anotados principalmente para processos metabólicos de lípidos, o que indica que o HCV perturba a composição de proteína para desligar as gotículas lipídicas da sua regulação metabólica normal e função.
O protocolo que descrevemos é modificável para diferentes linhas de células e condições de cultura e poderia ajudar a decifrar a função de gotículas lipídicas no ciclo de vida de diferentes agentes patogénicos que dependem de gotículas lipídicas para replicação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos R. Bartenschlager (Universidade de Heidelberg) para as construções JC1, CM Rice (Universidade Rockefeller) para as células Huh7.5, J. McLauchlan (Virologia Unidade Medical Research Council) para o JFH1 construir, T. Wakita (Instituto Nacional de Doenças infecciosas, Japão) para o JFH1 e B. Webster e WC Greene (Instituto Gladstone de Virologia e Imunologia) para as construções repórter HCVcc. Este trabalho foi apoiado por fundos da DFG (HE 6889 / 01/02 (EH), INST 337 / 15-1 2013, e INST 337 / 16-1 2013 (SH)). O Instituto Heinrich Pette, do Instituto Leibniz para Experimental Virologia é apoiado pela Cidade Livre e Hanseática de Hamburgo e do Ministério Federal da Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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