Summary
טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.
Abstract
טיפות ליפידים חיוניות שכפול של מגוון פתוגנים שונים, ובעיקר את וירוס הפטיטיס C (HCV), כאתר המשוער של morphogenesis virion. ניתן להשתמש בניתוח proteome אגל שומנים כמותיות לזהות חלבוני לוקליזציה או נעקרו מן טיפות שומנים בתנאים כגון זיהומי וירוס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוצל בהצלחה כדי לאפיין את שינויי proteome שומני האגל הבאים זיהום עם HCV. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) ובכך תווית proteome השלם של אוכלוסייה אחת של תאים עם חומצות אמינו "כבדות" לכמת את החלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה. עבור בידוד אגל שומנים, שתי אוכלוסיות התאים (כלומר נגוע HCV / "אור" חומצות אמינו ו / שליטה נגועה "כבדות" חומצות אמינו) מעורבבים 1: 1 ו lysed מכאנית במאגר hypotonic. לאחר הסרת הגרעינים ואת התא דebris ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, חלבוני אגל-מזוהה שומנים מועשרים על ידי שני צעדי ultracentrifugation עוקבים אחריו שלושה צעדי כביסה במאגר איזוטוני. טוהר שברי אגל השומנים מנותח על ידי מערבי סופג עם נוגדנים להכיר תאי subcellular שונים. חלבונים שומנים הקשורים אגל מופרדים ולאחר מכן על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ואחריו Coomassie מכתים. לאחר tryptic Digest, פפטידים הם לכמת ידי ספקטרומטריית מסה טנדם-יינון נוזלי electrospray-כרומטוגרפיה (LC-ESI-MS / MS). באמצעות שיטה זו, זיהינו חלבוני גייס עד טיפות שומנים על זיהום HCV שעשוי לייצג גורמים המארח בעד או אנטי. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של תאים שונים ותנאי תרבות, כגון זיהום עם פתוגנים, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.
Introduction
טיפות ליפידים הם מאוד ציטופלסמית דינמיים (ו גרעיניים) אברונים בתא מורכבים ליבה של ליפידים ניטראלי (טריגליצרידים (TG) ואסתר כולסטרול (CE)) מוקפים בשכבה של פוספוליפידים עם חלבונים מוטבעים 1. כל סוגי התאים לייצר טיפות שומנים, אבל הם משתנים בגודלם, רכב שומנים, ודקורצית חלבון. טיפות ליפידים למלא פונקציות מגוונות, כולל לשמש מאגרי אנרגיה מבשר קרום או פיקדונות חלבון. בנוסף, באמצעות ספיגת שומנים, הם להגן על תאים מפני lipotoxicity, שומני שחרור כמו מולקולות איתות, ומעורבי פירוק חלבונים ו reticulum endoplasmic תגובות דחק (ER) 2. ככזה, שורה של חלבונים הנקשרים טיפות השומנים והם חלים הדור שלהם, השפלה, סחר, ואינטראקציה עם אברונים אחרים. ביניהם יש את המשפחה perilipin של חלבונים מחייב אגל השומנים בתום לב (PLIN1-5)f "> 3.
Biogenesis אגל ליפידים מתחיל הנראה על ER, שבו אנזימים תושב ER לזרז את הסינתזה של ליפידים נייטרלי שמצטברים בתוך bilayer קרום, להרכיב עדשה של ליפידים נייטרלי, תהליך אשר דמיינו לאחרונה יפה שמרים 4. ממברנה כיפוף ורמות phosphatidic חומצה diacylglycerol גבוהות נחשבים אז כדי למשוך חלבונים המעורבים ביוסינתזה פוספוליפידים, כמו סינתזה סימולטני של ליפידים נייטרלי הליבה ואת פוספוליפידים מיגון נדרשת אגל השומנים דור 5. אנזימים מחסה תחומי transmembrane השוכנים בבית ER לזרז את התהליך הזה. הרחבת טיפות שומנים גדולות מחייב הפעילות של מח' אחרת של אנזימים לסינתזה של שומנים כי נמל Helix amphipathic ובכך יכול לנסוע מ ER כדי טיפות שומנים. ניוד השומנים מן טיפות שומנים מתרחש דרך ההפעלה המקומית של triglyceridlipases דואר ו diacylglycerol lipase טריגליצרידים שומני (ATGL) ואת ההורמון רגיש lipase (HSL) או על ידי מסלולי autophagic שונים, כגון מקרו microlipophagy או מלווים בתיווך autophagy 6. טיפות ליפידים אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים, כגון המיטוכונדריה (עבור חמצון בטא וסינתזה השומנים) ו ER (עבור סינתזה השומנים וסחר חלבון), אלא גם עם lysosomes, endosomes, ואת וקואולות המושרה על ידי חיידקים תאיים 7. ואכן חיידקים, וירוסים, טפילים ואפילו למקד טיפות שומנים עבור שכפול והתמדה, ביניהם 8 HCV.
זיהום HCV הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה הקשורות בכבד ברחבי העולם, המהווים כ -0.5 מיליון מקרי מוות בשנה 9. המספר האמיתי של זיהומים HCV אינו ידוע, אך לפי הערכות שבוצעו לאחרונה ש -130 - -150 מיליון בני אדם נדבקים כרוני. אין vaccinדואר קיים, אך הנגיפים ישיר למשחק שאושר לאחרונה להגדיל באופן דראמטי את התגובות טיפוליות לעומת הטיפול הסטנדרטי מבוסס-אינטרפרון. עם זאת, ברחבי העולם, לטיפול בחולים יוגבל הנראה בשל עלויות גבוהות מאוד של תרופות חדשות. כמחצית מכלל אנשים נגועים כרוני עם HCV לפתח מחלת כבד שומני (steatosis), מצב המאופיין על ידי הצטברות יתר של טיפות השומנים ב hepatocytes. מעניין לציין, טיפות שומנים התגלו גם אברונים הסלולר חיוניים כמו שכפול HCV, putatively המשרתים כאתרי הרכבת ויראלי 10, 11.
בתאים נגועים HCV, ליבת החלבון הנגיפית לבין NS5A למקם את טיפות שומנים בתהליך זה תלוי ביוסינתזה טריגליצרידים, כמו מעכבים של diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) לפגוע בסחר טיפות שומנים וייצור חלקיקי HCV עוקבת 12 >, 13, 14, 15. בנוסף, מוטציות תחומי השומנים מחייבים אגל באחת ליבה או NS5A לדכא HCV הרכבה 16, 17. Core ו NS5A אז לגייס את כל החלבונים הנגיפיים אחרים, כמו גם מתחמי שכפול נגיפי RNA, ממברנות קשורים קשר הדוק עם השומנים טיפות 16. פעולה מתואמת של כל החלבונים הנגיפיים נדרשת לייצור המוצלח של צאצאים ויראלית מדבקים 10, 11. החלבונים המבניים הם חלק virions, ואת החלבונים nonstructural לקדם אינטראקציות חלבון-חלבון הדרוש לתהליך הזה. מעניין לגלות חלבון שומנים בתום לב מחייב אגל PLIN3 / TIP47 נדרשת הן שכפול RNA HCV ושחרור virions 18, 19
כאן, אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים. באמצעות שיטה זו, מצאנו שינויים עמוקים proteome אגל השומנים במהלך זיהום HCV ו- A3 Annexin מזוהה חלבון המארח כי שיתוף fractionates עם טיפות השומנים ואת נדרשת הבשלה HCV יעיל 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה עבור תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC)
הערה: הנה, החלבון SILAC קיט כימות - DMEM בתוספת 50 מ"ג של 13 C 6 L- ארגינין-HCl שימש תיוג SILAC. סרום העובר עגל dialyzed (FCS) מסופק עם קיט כימות חלבון SILAC.
- הסר 50 מ"ל מכל בקבוק בינוני DMEM ולהוסיף 50 מ"ל של dialyzed FCS.
- ממיסים 50 מ"ג של 13 C 6 L- ליזין-2HCl ו 50 מ"ג של 13 C 6 L- ארגינין-HCl ב 1 מ"ל של מדיום. מערבבים היטב ומוסיפים את חומצות אמינו למדיום DMEM + FCS.
- להוסיף 1x פן / סטרפטוקוקוס ו תחליף L- גלוטמין 1x. מסנן סטרילי המדיום באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. תווית הבקבוק כמו "כבד" בינוני SILAC.
- כדי להכין את המדיום "אור", חזור על שלבים 1.1 - 1.3 באמצעות 50 מ"ג L- ארגינין-HCl ו 50 מ"ג של L-ליזין-2HCl. תווית הבקבוק כמו "מדיום SILAC אור".
2. SILAC תיוג ובקרת התאגדות חומצת אמינו
- Trypsinize תאים (1x טריפסין-EDTA) ו ספליט 1 x 10 5 Huh7.5 תאים לתוך 2 בארות צלחת תרבות 6 היטב המכיל 2 מ"ל של מדיום, אחד גם עם המדיום SILAC "כבדים" ואחד עם "אור" מדיום SILAC.
- תרבות התאים עבור מעברי 6 לפחות (יחס פיצול: 1: 6); לאחר 6 קטעים, השילוב של חומצות אמינו "הכבדות" צריך להיות יותר מ 95%.
- קציר 1 x 10 6 תאים של "כבדה" - ו "אור" אוכלוסיית תאי שכותרתו לנתח את יעילות ההתאגדות. שוטפים את התאים ב 1x PBS ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 160 XG ו 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend את כדורי תא 150 μL של חיץ MS (150 מ"מ NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, ו 1 mM EDTA בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x) ו דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות. Lyse גאמות ידי sonication ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: להלן ההגדרות sonication משמש כאן: טיימר, להחזיק; בקרת פלט, 8; מחזור העבודה, 80%; ו 2 x 30 פולסים. - הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 11,000 XG ו 4 מעלות צלזיוס. מעביר את supernatant לצינור חדש ולקבוע את ריכוז החלבון עם assay חלבון אבקה תואמת.
- מערבבים 75 מיקרוגרם של חלבון עם חיץ מדגם 6x (375 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 25.8% גליצרול, 123 מ"ג / מ"ל SDS, 600 מיקרוגרם / מ"ל bromophenol כחול, ו 60 μL / מ"ל β-mercaptoethanol), לרתיחה על 95 ° צלזיוס למשך 5 דקות, ולהפריד את החלבונים על ידי SDS-PAGE ב SDS חיץ ריצה (3.02 גר '/ L טריס בסיס, 18.8 גר' / גליצין L, ו 1 גר '/ ל SDS) ב 180 V כ 1 h או לפי יצרנים ' הוראות.
- מעבירים את הג'ל לתוך פתרון מכתים Coomassie קולואידים. ובלו אותה להקת החלבון מן בנתיב אחד. לעכל את החלבונים עם טריפסין ולנתח את יעילות ההתאגדות ידי MS לניתוחים, כמתואר 22.
3. בידוד אגל ליפידים של תאי Huh7.5 שכותרתו SILAC
- להדביק אוכלוסייה אחת של תאים (כלומר אלה שתויגו עם חומצות אמינו "אור") עם וירוס הכתב HCV ידי דוגרים עם מניות וירוס (למשל, JC1 NS5AB-mKO2-BSD, משרד הפנים 1) עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, כמתואר 21 .
הערה: JC1 NS5AB-mKO2-BSD הוא וירוס HCV נושא כתב פלואורסצנטי (monomeric Kusabira אורנג 2, mKO2) לפקח שיעורי זיהום ואחריו Blasticidin התנגדות ג'ין (BSD) בין מחשוף באתר NS5A-NS5B כפול, תאר בעבר 21, 23. עבודה עם HCV דורש BSL2 + (ארה"ב) או S3 ** (גרמניה) בלימה בטיחות ביולוגית ברמה ושיטות עבודה. במקום הדבקה עם HCV, תאים יכולים להיות נגוע פתוגנים שונים. - להרחיב תאים "אור" ו- # noninfected & נגוע-HCV34;. כבד" תאים במהלך passaging של תרבויות, לתקן aliquot עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS ולקבוע את שיעורי זיהום HCV ידי cytometry זרימה של חלבון בסמן פלורסנטי (למשל, mKO2), כמתואר 21, את שיעורי ההדבקה צריך להיות גבוה מ 90% עבור השומנים אגל בידוד הערה:. אם שימוש זן HCV JC1 NS5AB-mKO2-BSD, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin S למדיום "אור" כדי לבחור עבור תאים HCV חיובי.
- 1 ד לפני בידוד אגל שומנים, לשטוף את התאים עם PBS, trypsinize, גלולה ב "אור" ו "כבד" בינוני, ולספור את התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. זרע 7 x 10 6 תאים של כל האוכלוסייה בצלוחית-תרבית 150 ס"מ 2 תאים. הכן לפחות 5 מנות לכל "אור" ואת אוכלוסיית תא "כבדה". התרבות התאים 30 מ"ל של מדיום / צלחת O / N.
- הסר את הבינוני לשטוף את תאי 1X PBS. לנתק את התאים ב 1xPBS באמצעות מגרד תא.
- רוזן הוא אוכלוסיות התאים באמצעות תא ספירה נויבאואר ומכניסים מספרים סלולריים שווים צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 160 XG ו 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את PBS מחדש להשעות את התא גלולה 1 מ"ל של חיץ סוכרוז (0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, ו 1 מ"מ DTT, בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז). מעבירים את ההשעיה לתא homogenizer Dounce צמודה lyse התאים עם 200 חבטות על הקרח.
הערה: ודא תמס תא שלם באמצעות מכתים trypan כחול. - העברת lysate לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge ומסובב את הגרעינים ופסולת התא עבור 10 דקות ב 1000 XG ו 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר צנטריפוגה, לאחסן aliquot של 25 μL של השבר הפוסט-גרעינית (PNS) ב- C ° -20 כפקד קלט.
- מניחים את שאר שבריר PNS בתחתית צינור צנטריפוגות (11 x 60 מ"מ) ולהצליב עם חיץ לשטוף אגל השומנים (~ 3 מ"ל; 4 טוט מ"לאל) (חיץ פוספט אשלגן 50 מ"מ pH 7.4, 100 אשלגן כלורי מ"מ, 1 מ"מ EDTA, ו פלואוריד 1 מ"מ phenylmethanesulfonyl).
- צנטריפוגה 2 שעות ב 100,000 XG ו 4 מעלות צלזיוס. קציר שבריר אגל השומנים צף באמצעות מכופף, צינורית בוטה מהחלק העליון של הצינור (כ 250 - 500 μL, תלוי בכמות של טיפות השומנים). מניחים את שבריר אגל השומנים בתוך צינור צנטריפוגות (11 x 60 מ"מ), עם שכבת חיץ לשטוף אגל השומנים (~ 3.5 מ"ל; 4 סך מ"ל), וחזור על צעד צנטריפוגה.
- קציר שבריר אגל השומנים צף באמצעות מכופף, צינורית בוטה מהחלק העליון של הצינור להעביר את טיפות השומנים לצינור 1.5 מ"ל microfuge חדש. הוספת 500 μL של חיץ לשטוף שומני אגל ספין עבור 20 דקות ב 21,000 XG ו 4 מעלות צלזיוס.
הערה: טיפות שומנים להופיע כלהקה לבנה צפה על גבי החיץ. - הסר את החיץ לשטוף subjacent באמצעות קצה פיפטה ג'ל העמסה לחזור על שלב זה כביסה שלוש פעמים.
- לאחר הסרת הסופי של חיץ הכביסה באמצעות קצה פיפטה טעינת ג'ל, לערבב 5 μL של שברים אגל השומנים עם 10 μL של חיץ תמוגה NP-40 (50 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו 1% NP-40 , בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז). דגירה המדגם על הקרח עבור 1 h להשבית את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומיות. קבע את רמת החלבון עם assay חלבון אבקה תואמת; 35 מיקרוגרם של חלבון לפחות נדרש-ניתוח MS.
- אחסן את שברי אגל שומנים ב -20 מעלות צלזיוס.
- מערבבי נפח מקביל שבר אגל השומנים עם צבע טעינת 4x. לדגור על הקרח במשך 1 h להשבית את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומיות. מרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הפרד את החלבונים באמצעות SDS-PAGE פי פרוטוקול של היצרנים. מעבירים את הג'ל לתוך פתרון מכתים Coomassie קולואידים. ובלו כל להקות החלבון מן הג'ל. לאחר tryptic ב-ג'ל העיכול 24 </ Sup>, להתאדות דגימות וממיסים אותם בחומצה 0.1% פורמית. נתח לפי LC-MS / MS.
הערה: הנה, LC-MS / MS ניתוחים בוצעו על ספקטרומטר מסה Quadrupole-Time-of-Flight (Q-TOF) או על מלכודת לינארי Quadrupole (LTQ) orbitrap ספקטרומטר מסה. מכשירים שניהם היו מצמידים עם ESI-מקור למערכת ננו-UPLC. נתונים מנתחים LC-MS / MS מנתחת על Q-TOF ועל ספקטרומטר מסת orbitrap בוצעה כמתואר 21, 22. קח בזהירות רבה לא לזהם את המדגם עם קרטין האנושי. השתמש תמיד טיפים וצינורות פיפטה קרטין-חינם. כן מאגרים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית עם כימיקלי קרטין-חינם. לפני השימוש, לנקות את כל המשטחים ומכשירים עם מים ואתנול מזוקקים. תמיד ללבוש כפפות וחלוק מעבדה.
4. ניתוח של טוהר אגל ליפידים
- לדלל aliquots של שברי אגל שומנים 1: 2 ו שברי קלט (ראה שלב 3.9) 01:10 עם NP-40 ליסהוא חיץ. דגירה דגימות על הקרח עבור 1 h להשבית את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומיות. קבע את רמת החלבון עם assay חלבון אבקה תואמת.
- מערבבים כמויות שוות של חלבון עם חיץ 6x מדגם דגירה דגימות קרח במשך 1 h להשבית את הנגיף אם עובדים עם חומר זיהומיות. המשך עם SDS-PAGE ולהעביר את החלבונים על גבי קרום nitrocellulose ידי סופג טנקים לעבר 80 V עבור 90 דקות.
הערה: לאחר חסימת קרום בחסימת המאגר (5% אבקת חלב מיובש ללא שומן ב TBS-T (10 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 150 מ"מ NaCl, ו 0.05% Tween20)), דגירה עם נוגדנים המכוונים נגד סמני אגל השומנים (למשל , PLIN1, PLIN2, או PLIN3) וסמנים של תאי subcellular אחרים (למשל, CALR, MnSOD, או טובולין), ואחריו נוגדני HRP מצמיד משניים. השתמש chemiluminescence עבור זיהוי של חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיפות ליפידים חיוניות זיהום HCV כמו באתרים המשוערים של הרכבת virion, אבל המנגנונים המולקולריים של morphogenesis ואת פתח יציאה של virions אינם ידועים ברובם. כדי לזהות גורמי מארח תלות רומן מעורבים בתהליך זה, בצענו ניתוח proteome אגל שומנים כמותי של תאים נגועים HCV 21 (איור 1A). הקמנו פרוטוקול לטיהור טיפות השומנים ואת שגרתי זיהה העשרה חזק של PLIN2 / ADRP חלבונים שומנים מחייב אגל PLIN3 / TIP47 וכן דלדול של סמנים של תאים סלולריים אחרים, כגון β טובולין עבור microtubules, MnSOD עבור המיטוכונדריה, או calreticulin / calnexin עבור ER (איור 1B, C). אספנו רשימה של חלבונים כי cofractionate אמין עם טיפות שומנים בתאי Huh7.5 (איור 1D) ו, באמצעות תיוג איזוטופ, חלבונים זיהו כי מגויסים במיוחדאו שנעקר טיפות שומנים בתאים נגועים HCV (איור 1E). התוצאות שלנו מצביעות על כך HCV מנתק טיפות שומנים מן התפקוד המטבולי הרגיל שלהם ו / או תקנו ולזהות גורמי תלות הגבלת מארח משוערים.
איור 1: (א) תכנית הניסוי. תאי Huh7.5 נאיביים תויגו עם חומצות אמינו "הכבד" או "אור" חומצות אמינו. תאי נושאים "אור" חומצות אמינו נדבקו בוירוס כתב HCV (JC1 NS5AB-mKO2-BSD). "אור" ו "כבדות" אוכלוסיות אמינו שכותרתו חומצה היו מעורבות, ואת טיפות שומנים בודדו על ידי שתי ultracentrifugation עוקבת ושלוש צעדי כביסה, מופרדים על ידי SDS-PAGE, ונותחו על ידי LC-ESI-MS / MS. הערת שבר אגל שומנים הלבן צף (חץ אדום) לאחר ultracentrifugati על הכביסה ב צינורות microfuge. (ב) ניתוח כתם מערבי פוסט-גרעיני שברי אגל שומנים מראה העשרה של חלבונים סמן אגל שומנים שברי אגל שומנים וכן דלדול של סמנים של תאים סלולריים אחרים. (ג) Coomassie מכתים כחול וכסף של supernatant פוסט-גרעיני (PNS) ושברי אגל שומנים מופרדים SDS-PAGE. מכתים כסף מוצג עבור להדמיה בלבד. (ד) מפה חמה של מספר פפטידים ואחוז כיסוי חלבון חלבונים המזוהים שברי אגל שומנים בתאי Huh7.5 (קצוצה: ≥5 פפטידים וכיסוי ≥20%). (ה) מפה חמה מתארת מועשרת או מדולדל חלבוני שומנים בדם הקשורים אגל לאחר הדבקה עם HCV (מנורמל החציון, הפסקת 1.5-פי, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). השתנה מ 21.et = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד טיפות שומנים לניתוח proteome אגל שומנים כמותית להשוות את ההעשרה ודלדול של חלבונים הקשורים טיפות שומנים בתנאי תרבות מגוונות, כגון זיהומים ויראליים. כשיטה חלופית, ניתוח proteome יכול להתבצע עם quantifications ללא תווית מבוססת על עוצמות שיא כוללות. שיטה זו אין הגבלת טווח דינמית ונמנעה בעיות מטבוליות. היתרון של הגישה SILAC הוא כי דגימות ונקווה בידוד אגל השומנים לפני, ולכן התוצאות אינן תלויות טעויות בהכנה מדגם, לעכל, ו LC-MS ניתוח / MS. אנו ממליצים בחום גישה זו לניתוח proteome אגל שומנים כמותית.
ככל העשרה או דלדול של חלבונים שומנים בדם הקשורים אגל שנצפה בניתוח MS יכול להצביע על אינדוקציה או דיכוי של ביטוי חלבון, ניתוח של רמות ביטוי ידי quantitativדואר RT-PCR (רצוי) המערבי סופג מומלץ. בנוסף, שתי שיטות שניתן להשתמש בם כדי לאמת את ההעשרה או דלדול של חלבונים ספציפיים טיפות שומנים: בידוד אגל שומנים ואחריו מערבי סופג וניתוח immunofluorescence עם צבעי lipophilic, כמו BODIPY או LD540, כי טיפות שומנים כתם כמו 21 תארו.
בצע ניסויים עם תנאי תיוג החליפו מנת להבטיח כי התיוג עם חומצות אמינו "כבדות" אינו משפיע לוקליזציה אגל חלבון ביטוי או שומנים ולזהות מזהמי חלבון מן המדיום "האור" ומקורות סביבתיים. לזיהוי חלבונים, החיפוש צריכה להתבצע עם שיעור תגליות שגוי (FDR) של 0.01 הוא על פפטיד ורמת חלבון. כדי להבטיח תוצאות מהימנות גבוהות, אנו ממליצים לבצע לפחות 3 - 4 ניסויים עצמאיים, עם תאים מן הקטעים שונים והכנות מניות וירוס שונות. בהתאם מטרagnitude של שינוי, ניסויים עצמאיים יותר עשוי להידרש.
לנרמול נתוני MS כמותיים כדי לתקן מעט שונה מספרים סלולריים או טיפות שומנים, למרכז את יחסי זיהוי של "האור" על פפטידים "כבדים", או להיפך, בתנאי תיוג החליפו ידי חלוקת דרך החציוני של כל החלבונים שזוהו , כמתואר 25. אם הסכום של טיפות שומנים שונים באופן משמעותי בין הדגימות, נרמול לחלבוני סמן שומני אגל, כגון PLIN2, יכול להיות מומלץ. כאשר אנחנו מנרמלים את הנתונים MS שלנו לרמות PLIN2, אנו מוצאים תוצאות דומות כאשר אנו לנרמל את החציון (ניתוח לא מוצג). מן ראוי לציין כי, בתנאי תרבית תאים אנו משתמשים, לא נזהה הצטברות אגל שומנים משמעותית על זיהום HCV.
טיפות השומנים נמצאים בקשר הדוק עם אברונים תאיים אחרים, בעיקר במיטוכונדריה ואת ER. לכן, חלבונים לטבROM תאים אלה יכולים לחיות בדו-fractionate עם טיפות השומנים במהלך הבידוד. אם חלבון "מזהם" כזה הוא ללא שינוי בשפע בתגובה לזיהום או טיפול, זה לא ישפיע על ניתוח proteome אגל שומנים ההשוואתי. יש לציין, עם זאת, כי בנסיבות מסוימות, הקשר בין טיפות שומנים ואת האברונים אחרים עשוי להשתנות. לדוגמא, בתנאים הליפוליטי, חלבונים המיטוכונדריה מזוהים בתדירויות גבוהות יותר שברי אגל שומנים מן המגורה lipolytically adipocytes 3T3-L1 למול תנאי בסיס 26. מגורה דה נובו lipogenesis, ומצד שני, עלולים להוביל עמותה משופרת עם ER. שינויים אלה אז לשקף שינויים באינטראקציה אברון המושרה על ידי גירויים שונים יכול להיות מעניין, אפילו אם הם אינם משקפים לוקליזציה אגל השומנים טהור.
השתמשנו פרוטוקול זה עבור proteom אגל שומנים כמוני נרחבניתוח דואר של נגועים HCV, לעומת תאים מלאים נגועים לחשוף פרעות הנגרמות על ידי נגיף HCV ו- לזהות רגולטורים של HCV שכפול 21. בשורת תא hepatoma Huh7.5, זיהינו את שגרתי 2900 חלבונים בתוך שברי אגל שומנים, עם ~ 300 חלבונים מזוהים עם פפטידים מרובים בכל ניסוי. בעקבות זיהום עם HCV, צפינו גיוס הדלדול הן של חלבונים מארחים. חלבונים כמה מזוהה מועשר ב טיפות השומנים של תאים נגועים HCV פורסמו בעבר כגורמי המארח HCV (למשל, חלבונים תיבת DEAD 1 ו 3 (DDX1, DDX3) או גורם-II גדילה דמויי אינסולין mRNA מחייב חלבון 1 ( IGF2BP1)), המעיד על האמינות של גישת SILAC 27, 28, 29. בנוסף, חלבוני גייס הם מבוארים קרובים עבור חלבוני קושרי RNA, המדגישים את הקשר ההדוק של replic רנ"א הנגיפימתחמי ation עם שברי אגל שומנים. לעומת זאת, חלבונים מתרוקנים מן טיפות השומנים היו מפורשים בעיקר עבור תהליכים מטבוליים השומנים, המציין כי HCV מדאיג בהרכב החלבון לנתק את טיפות השומנים מפיקוח התפקוד המטבולי הרגיל שלהם.
הפרוטוקול אנו מתארים הוא amendable שורות תאים שונים ותנאי התרבות יכול לעזור בפענוח הפונקציה של טיפות שומנים במחזור החיים של פתוגנים שונים שתלויים טיפות שומנים עבור שכפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ר Bartenschlager (אוניברסיטת היידלברג) עבור המבנים JC1, CM רייס (אוניברסיטת רוקפלר) עבור התאים Huh7.5, ג'יי McLauchlan (המועצה למחקר רפואי יחידת וירולוגיה) עבור לבנות JFH1, ט Wakita (National Institute of מחלות זיהומיות, יפן) עבור JFH1, ו- B וובסטר בב"ש גרין (גלדסטון המכון לווירולוגיה ואימונולוגיה) עבור מבני כתב HCVcc. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, ו INST 337 / 16-1 2013 (HS)). היינריך Pette המכון, מכון לייבניץ עבור וירולוגיה ניסיון נתמך על ידי חינם ו הנזה בעיר המבורג והמשרד הפדרלי בריאות. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
