Summary
تقنية التنميط الجيني هو موضح هنا، والتي الأزواج الفلورسنت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لالشعرية الكهربائي للهلام، ويسمح لالتنميط الجيني الإنتاجية العالية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. انها تلتف القيود من خلال تقنيات التنميط الجيني أخرى واجهت وهو أكثر فعالية من حيث التكلفة من الطرق التسلسل.
Abstract
وقد سهلت تطوير أدوات الجينوم التحرير للبرمجة باستخدام علم الوراثة العكسية لفهم الأدوار تلعب تسلسل الجينوم محددة في عمل الخلايا والكائنات كلها. تم عرض هذه القضية بمساعدة بجسامة الأخذ في الآونة الأخيرة من كريسبر / نظام واحد Cas9 أداة متعددة الاستعمالات التي تسمح للباحثين لمعالجة الجينوم وTranscriptome على ل، من بين أمور أخرى، ضرب بها، تدق إلى أسفل، أو تدق في الجينات في المستهدفة الطريقة. لغرض ضرب الجينات، كريسبر / Cas9 بوساطة فواصل المزدوج حبلا توظيف غير مثلي، الانضمام نهاية DNA إصلاح مسار لتقديم الإدراج يسبب انزياح الإطار أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع الشوط الاول. ومع ذلك، RNA دليل الفردية قد يسبب آثار غير مرغوب فيها بعيدا عن الهدف، وحكم هذه خارج، واستخدام الرنا دليل متعددة ضروري. هذا التعدد من الأهداف يعني أيضا أن هناك حاجة إلى فحص كبيرة الحجم من الحيوانات المستنسخة، وهذا بدوره يطرح استخدام وسيلة EFficient تقنية عالية الإنتاجية إلى التركيب الوراثي استنساخ خروج المغلوب. تقنيات التنميط الجيني الحالية إما تعاني من القيود المتأصلة أو تكبد تكلفة عالية، وبالتالي جعلها غير صالحة للأغراض الإنتاجية العالية. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لاستخدام الفلورسنت PCR، والذي يستخدم الحمض النووي الجيني من الخلايا المحللة الخام كقالب، ومن ثم حل شظايا PCR عن طريق الكهربائي للهلام الشعرية. هذه التقنية دقيقة بما فيه الكفاية للتمييز فارق واحد قاعدة الزوج بين شظايا وكافية في إشارة إلى وجود أو عدم وجود انزياح الإطار في تسلسل ترميز الجين المستهدف بالتالي. هذه المعرفة الدقيقة يستبعد بالفعل الحاجة إلى خطوة تأكيدية التسلسل ويسمح للمستخدمين لتوفير الوقت والتكلفة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت هذه التقنية لتكون مرنة في التنميط الجيني خلايا الثدييات مختلفة من أصول الأنسجة المختلفة التي تستهدفها الرنا دليل ضد العديد من الجينات، كما هو موضح هنا وفي أماكن أخرى.
Introduction
وقد سمحت النهج الوراثية العكسية العلماء لتوضيح آثار التعديلات المحددة في الجينوم على الخلية أو الكائن الحي كله. على سبيل المثال، والتعبير عن جين معين يمكن أن تكون مخففة من الجينات ضربة قاضية 1 و 2 (تخفيض جزئي) أو تعطيل مورثة 3 و 4 (الاجتثاث الكامل) من أجل تحديد تأثير ذلك على وظيفة الخلية أو على تطور الكائن الحي.
أصبحت التجارب الجينات خروج المغلوب من الأسهل منذ بدء nucleases برمجة تسلسل معين، مثل nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs). ومع ذلك، فإن توصيف حديث نسبيا من تجميع تتخللها بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / جعلت نظام Cas9 من السهل للغاية بالنسبة لأي مختبر في جميع أنحاء العالم لأداء جنرالالبريد التجارب خروج المغلوب. في جوهرها، ويتكون النظام / Cas9 كريسبر من عنصرين واحد الأساسية RNA واحد دليل (sgRNA)، الذي يعترف ويربط طريق التكامل قاعدة لتسلسل معين في الجينوم، ونوكلياز داخلية تسمى Cas9. في أعقاب إجراءات محددة ملزمة ومجمع sgRNA-Cas9 على الحمض النووي الجيني هو الانقسام المزدوج حبلا من الحمض النووي. وهذا، بدوره، يؤدي آلية استجابة الحمض النووي من التلف في الخلايا، والتي يتم إصلاح في وقت لاحق عن طريق (HR) مسارات (NHEJ)، الانضمام نهاية أو إعادة التركيب مثلي غير المتجانسة. منذ آلية NHEJ إصلاح (ولكن ليس آلية HR) غالبا ما يؤدي إلى إدخال عشوائي أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع إصلاح، مما أدى إلى إدراج / حذف (INDEL) الطفرات، فإنه قد يتسبب في إطار القراءة من اكسون للتحول. وهذا قد يؤدي ثم في دور الستة عشر من الجينات بسبب الإنهاء المبكر الترجمة وبوساطة هراء تسوس 5، 6،7.
وعلى الرغم من الراحة التي يوفرها تطبيق نظام / Cas9 كريسبر في ضرب الجينات، والتنميط الجيني لاستنساخ الخلايا المستهدفة لا يزال يمثل عنق الزجاجة، وخاصة في تحديد 8 و 9 والإنتاجية العالية. التقنيات الموجودة إما يعانون القيود المتأصلة الكبرى أو هي مكلفة ماليا. على سبيل المثال، مساح أو T7E1 الفحص، وهو فحص الأنزيمية التي يكشف عدم التطابق في DNA دوبلكسات 10، غير قادر على التمييز بين الحيوانات المستنسخة wildtype والمسوخ متماثل (استنساخ الذي الأليلات وتحور مماثل)، لأن هذه الحيوانات المستنسخة لها الأليلات متطابقة وبالتالي لا تقدم عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي (11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام سانجر تسلسل، والتي تعتبر المعيار الذهبي في التنميط الجيني استنساخ متحولة، في إعداد الإنتاجية العالية غير مرغوب فيه بسبب التكلفة العالية. هنا، نقدم ديتبروتوكول ailed تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت، والتي يمكن الالتفاف على القيود المفروضة على تقنيات التنميط الجيني الأخرى القائمة وغير مفيدة بشكل خاص في أداء شاشة عالية الإنتاجية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. وهذه طريقة بسيطة من الناحية الفنية لأداء ويوفر الوقت والتكلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحصول على كريسبر / استهدفت Cas9-النسخ وحيدة الخلية
- خلايا البذور HEPG2 على طبق من 6 جيدا في 500،000 الخلايا لكل بئر في 2 مل من المضادات الحيوية خالية Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- خلايا Transfect مع البلازميد Cas9 وsgRNA محددة ضد الجينات ذات الاهتمام باستخدام كاشف ترنسفكأيشن المناسب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التعبير عن المشترك.
ملاحظة: على سبيل المثال، sgRNA يمكن استنساخ في pSpCas9 (BB) ناقلات -2A GFP، كما هو موضح سابقا 4. - استبدال الثقافة المتوسطة 4-16 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع 2 مل من المتوسط خالية من المضادات الحيوية الطازجة.
- حوالي 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وجمع تعليق وحيد الخلية التي كتبها trypsinizing الخلايا.
- يعرض للتريبسين الخلايا في 0.2 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل من المتوسط وإعادة تعليق thoroughlذ.
- فرز الخلايا لاستنساخ GFP إيجابية، كما هو موضح سابقا 12، وجمع حوالي 3500 الخلايا.
- لوحة الخلايا GFP إيجابية مرتبة على أطباق 10 سم في 500، 1000 و 2000 خلية لكل طبق في 8 مل من البنسلين / الستربتومايسين تستكمل مستنبت. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، ليحل محل المتوسطة كل خمسة أيام، حتى أنها تنمو في المستعمرات وحيدة الخلية كبيرة بما يكفي لتكون مرئية للعين المجردة. بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا السرطانية، وهذا يستغرق حوالي أسبوعين من يوم الطلاء.
- عندما المستعمرات هي من الحجم المناسب (أي يمكن رؤيته بالعين المجردة)، ونقل المستعمرات الفردية إلى آبار لوحة الثقافة 96-جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS.
- نضح المستعمرات وحيدة الخلية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر مع كمية صغيرة من المتوسط. Resuspend الخلايا بدقة في فيآبار dividual بواسطة الطحن عدة مرات.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، ليحل محل المتوسطة كل خمسة أيام، حتى تصل إلى 50-90٪ التقاء. بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا السرطانية، وهذا يستغرق حوالي 24-48 ساعة.
2. استخراج الخام الجينوم DNA باستخدام تحلل الأسلوب المباشر
- وعندما تصل خلايا 50-90٪ التقاء، وإزالة أكبر قدر من مستنبت من آبار ممكن استخدام متعدد القنوات شفط فراغ أو ماصة متعدد القنوات.
- إضافة 25 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA (بدون أحمر الفينول) في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- Resuspend الخلايا trypsinized بشكل دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. التحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها بعيدة عن سطح البلاستيك.
- إنشاء تكرار من الحيوانات المستنسخة الفردية عن طريق تحويل ما يقرب من 5 ميكرولتر من تعليق وحيد الخلية إلى بلات ثقافة 96-جيدا فارغةه. إضافة 200 ميكرولتر من مستنبت إلى كل بئر والحفاظ على الخلايا حتى يتم تحديد استنساخ الإيجابية باستخدام الفلورسنت-PCR الشعرية الكهربائي للهلام (انظر أدناه). متسلسل توسيع الخلايا إلى أطباق 10 سم أو أي نطاق آخر من خيار (انظر المادة 7).
- إضافة 5 ميكرولتر من تعليق وحيد الخلية من الخطوة 2،3 حتي 10 ميكرولتر من العازلة-ليز المباشر محلية الصنع (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 2.5 ملي EDTA، 0.2 M كلوريد الصوديوم، 0.15٪ SDS، و 0.3٪ توين 20) 12 في 96-جيدا PCR لوحة ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. لفترة وجيزة الطرد المركزي (لجلب السائل إلى أسفل من الآبار).
- إضافة 200 ميكرولتر من مستنبت إلى ما تبقى ~ 15 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 2.3 واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، جنبا إلى جنب مع تكرار من الخطوة 2.4.
- تعرض لست] من الخطوة 2.5 إلى البرنامج الدراجات الحرارية التالية للتأكد من تحلل كامل للخلايا، والإفراج عن الحمض النووي الجيني: 65 ° C لمدة 30 ق، 8 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة و 97 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 8 ° C لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 3 دقائق و 97 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. الطرد المركزي لست] لفترة وجيزة.
- تمييع لست] بإضافة 40 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه وتخلط جيدا باستخدام خلاط دوامة. لفترة وجيزة الطرد المركزي. ولست] المخفف يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر دون خسارة كبيرة للجودة.
3. أداء نيون PCR لتضخيم كريسبر / المناطق Cas9 الهدف
- تصميم اثنين الاشعال إلى الأمام المسمى fluorophore (على حد سواء وصفت في نهاية 5 ') لكل / المنطقة المستهدفة Cas9 كريسبر. قطع المواقع التي هي أبعد من 300 نقطة أساس من ينبغي النظر في بعضها البعض كما منطقتين الهدف منفصلة (مثل الأخضر المسمى fluorophore التمهيدي للسيطرة wildtype غير مستهدفة والأزرق المسمى fluorophore التمهيدي لكريسبر / استنساخ المستهدفة Cas9؛ انظر الجدول من المواد ليرة سورية).
- شراء هذه الاشعال المسمى إلى الأمام وعكس التمهيدي الخالي من الملصقات وفقا لذلك. لاحظ أن الاشعال يمكن تصميم باستخدام أي أداة الاختيار وأن amplicons ينبغي أن تكون 200-500 بب لونغ.
- أداء PCR كما هو موضح سابقا 12 لتضخيم المناطق المستهدفة باستخدام بادئات المسمى.
- استخدام 3 ميكرولتر من لست] المخفف من الخطوة 2.8 في رد فعل 20 ميكرولتر (انظر الجدول 1) والحراري برنامج الدراجات التالية: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة)؛ 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 64 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (4 دورات)؛ 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (4 دورات)؛ 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (4 دورات)؛ 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (35 دورات).
- حل 5 ميكرولتر من amplicons PCR على هلام الاغاروز 1٪ للتأكد من حجم وكمية النسبي من ampliconsSS = "XREF"> 12.
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة لجميع العينات وشجع لكن ليس من الضروري. حل عدد مختار من العينات غير كافية لتقدير كمية amplicons الموجودة في عينات بشكل عام.
4. عينات التحضير لشعري جل الكهربائي
- تمييع amplicons من wildtype (خلايا الأبوية غير مستهدفة) وكريسبر / DNA المستهدفة Cas9 في nuclease خالية من المياه إلى ما يقرب من 2.5 نانوغرام / ميكرولتر. تأكد لتمييع ما يكفي من عينة DNA wildtype تضاف إلى كل عينة DNA المستهدفة (ما لا يقل عن 0.5 ميكرولتر من عينة wildtype المخفف للعينة المستهدفة مطلوب).
- خلط wildtype المخفف وعينات من الحمض النووي المستهدفة في نسبة متساوية (على سبيل المثال، مزيج 1 ميكرولتر من عينة wildtype مع 1 ميكرولتر من العينة المستهدفة).
- إضافة 1 ميكرولتر من amplicons المختلطة إلى 8.7 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات و 0.3 ميكرولتر من المسمى صبغ معيار حجم في جيدا 96 لوحة PCR والتي تتوافق مع وراثيةalyzer.
ملاحظة: استخدام مزيج سيد الفورماميد ومعيار الحجم (أي إعداد الخلطة من الفورماميد ومستوى حجم في 29: نسبة 1 قبل إضافة amplicons لضمان كميات موحدة) ويوصى. - بإحكام ختم لوحة وتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق باستخدام thermocycler PCR.
- وضع لوحة على الجليد على الفور بعد الخطوة التدفئة واحتضان لمدة 3 دقائق على الأقل.
5. المسرحية الشعرية جل الكهربائي على محلل الوراثية
- إعداد المعلمات الفحص، بروتوكول الصك، وبروتوكول تدعو حجم على برنامج الكهربائي للهلام الشعرية متصلة محلل وراثي.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة فقط على المدى الكهربائي الأول. يمكن حفظ البرنامج لاستخدامها في المستقبل. لتشغيل اللاحقة، انتقل مباشرة إلى الخطوة 5.2.- انقر على أيقونة "إنشاء لوحة جديدة" على لوحة القيادة البرمجيات.
- إعطاء صالامم المتحدة اسم وهمية وحدد الخيارات التالية: عدد الآبار، 96؛ نوع لوحة، وجزء. طول شعري، 50 سم؛ والبوليمرات، POP7. انقر على زر "تعيين لوحة المحتوى".
- تحت عنوان "فحوصات"، انقر فوق "إنشاء الفحص الجديدة"؛ سوف تظهر لوحة جديدة.
- اسم الفحص "FPCR-CGE الفحص" وتأكد من أن "نوع الطلب" غير مضبوطين بشكل صحيح بأنها "جزء".
- إعداد بروتوكول أداة بالضغط على زر "إنشاء جديد" تحت عنوان "بروتوكول الصك."
- تعيين أو اختيار الخيارات والمعلمات التالية في المجالات المناسبة: نوع التطبيق، جزء. طول شعري، 50 سم؛ البوليمر، POP7. صبغ مجموعة، G5، تشغيل وحدة، FragmentAnalysis. اسم البروتوكول، FPCR-CGE بروتوكول الصك؛ درجة الحرارة الفرن، 60 ° C. تشغيل التيار الكهربائي، و 19.5 كيلو فولت. ما قبل التشغيل الجهد، 15 كيلو فولت. حقن الجهد، 1.6 كيلو فولت. وقت التشغيل، 1330 ق. وقت ما قبل التشغيل، 180 ق. الوقت الحقن، 15 ثانية. وتأخير البيانات، 1 ثانية.
- الكلورينإك على "تطبيق لفحص" الزر ومن ثم على زر "حفظ إلى مكتبة" لحفظ البرنامج. إغلاق لوحة للمتابعة.
- إعداد بروتوكول تدعو حجم بالضغط على زر "إنشاء جديد" تحت عنوان "بروتوكول Sizecalling".
- تعيين أو اختيار الخيارات والمعلمات التالية في المجالات المناسبة: بروتوكول اسم، FPCR-CGE بروتوكول Sizecalling. معيار الحجم، GS500 (-250) ليز. الحجم المتصل، SizeCaller v1.1.0. إعدادات التحليل، -. تحليل المدى، كاملة؛ تحجيم المدى، كاملة؛ حجم استدعاء الأسلوب، جنوب المحلي. قمة التمهيدي والحاضر. الأزرق، الأخضر، البرتقالي القنوات، (تحقق)؛ الحد الأدنى ارتفاع الذروة، و 175 لجميع القنوات. استخدام التنعيم، لاشىء. استخدام لخط الأساس (خط الأساس النافذة (نقط))، (راجع) 51؛ الدنيا بيك نصف العرض، 2، ذروة حجم الإطار، 15؛ متعدد الحدود درجة، 3؛ المنحدر عتبة الذروة ابدأ، 0.0، المنحدر عتبة الذروة النهاية، 0.0، إعدادات QC، -. حجم جودة، -. تفشل إذا القيمة هي <0.25. تمرير إذا القيمة هي <0.75. تحمل الخطية من 0 إلى 80 سنة مضت0 بي بي. وتحفيز العلم سحب ما يصل إذا نسبة سحب ما يصل ≤ 0.1 وسحب ما يصل مسح ≤ 1.
- انقر على "تطبيق لفحص" الزر ومن ثم على زر "حفظ إلى مكتبة" لحفظ البرنامج. إغلاق لوحة للمتابعة.
- تأكد من أن الفحص يتم حفظها عن طريق النقر على زر "حفظ إلى مكتبة" مرة أخرى والخروج من لوحة بالضغط على زر "إغلاق".
- مرة أخرى في "تعيين لوحة المحتويات" الصفحة، انقر على رابط "إنشاء اتفاقية اسم ملف جديد" تحت عنوان "اتفاقيات اسم الملف".
- اسم البرنامج "FPCR-CGE اسم الملف".
- تحت عنوان "السمات المتاحة"، حدد سمات المطلوب الذي سيظهر في اسم الملف (مثل "تاريخ تشغيل"، "وقت تشغيل"، "حسنا الوظيفة"، و "اسم نموذج"). اختيار موقع الملف المطلوب حيث سيتم تخزين نتائج التشغيل.
- انقر على زر "تنطبق على الفحص"، ومن ثم"حفظ إلى مكتبة" لحفظ البرنامج. إغلاق لوحة للمتابعة.
- مرة أخرى في صفحة "تعيين لوحة المحتويات"، انقر على الرابط "إنشاء نتائج جديدة مجموعة" تحت عنوان "المجموعات نتائج".
- اسم البرنامج "FPCR-CGE النتائج المجموعات".
- تحت عنوان "السمات المتاحة"، حدد سمات المطلوب الذي سيظهر في اسم الملف (مثل "اسم الفحص"). اختيار موقع الملف المطلوب حيث سيتم تخزين نتائج التشغيل.
- انقر على "تطبيق لفحص" الزر ومن ثم على زر "حفظ إلى مكتبة" لحفظ البرنامج. إغلاق لوحة للمتابعة.
- إعداد برنامج لتشغيل الكهربائي وذلك باتباع الخطوات التالية.
- انتقل إلى لوحة القيادة وانقر على أيقونة "إنشاء لوحة جديدة".
- اسم على المدى النحو المرغوب فيه (لتسهيل الرجوع إليها، وتشمل التاريخ، خط الخلية، واسم الجين). حدد الخيارات التالية: عدد الآبار، 96؛ نوع لوحة، وجزء. طول شعري، 50 سم؛ والبوليمرات، POP7. انقر على زر "تعيين لوحة المحتوى".
- تسمية كل بئر من العينة كما هو مطلوب (على سبيل المثال، عينة يمكن تسمية "NC" للإشارة إلى أن البئر هو السيطرة السلبية).
- بموجب اتفاقيات "فحوصات"، "اسم الملف"، و "نتائج المجموعات" الصناديق، انقر فوق "وصلة إضافة من مكتبة" وحدد البرامج التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.1.3 إلى 5.1.17.
- تسليط الضوء على جميع الآبار التي سيتم تحليلها وتحديد البرامج ذات الصلة في إطار "فحوصات"، "اتفاقيات اسم الملف"، و "المجموعات نتائج" عن طريق التحقق من المربعات المجاورة لها.
- قبل تحميل لوحة على علبة للمحلل وراثي، وتطبيق الختم المطاطي على لوحة 96-جيدا ووضع لوحة مغلقة في حالة من البلاستيك الذي يأتي مع محلل وراثي.
- تضغط على الزر "صينية" في الجزء الأمامي من محلل وراثي، وعندما إعادة صينيةأوجاع الجبهة المعدات، وفتح الباب وتحميل لوحة المغطى على الدرج. تأكد من أن لوحة مقفل في مكانها ثم يغلق الباب.
- انقر على "لوحة وصلة لتشغيل" الزر.
- في صفحة "لوحات تحميل لتشغيل"، قيام الاختيار النهائي للتأكد من أن جميع الكواشف وشروط صحيحة وسليمة.
- انقر على زر "ابدأ تشغيل". كل شوط من 24 عينة (الآبار 3X8 الأولى من لوحة 96 أيضا) تستغرق أقل من 55 دقيقة لإكمال.
6. تحليل رحلاني تحديد الاختلافات قاعدة الزوج
- عندما الشعرية الكهربائي للهلام المدى كاملة، فتح برامج التحليل لتحليل النتائج.
- انقر على "إضافة عينات إلى مشروع" رمز والبحث عن المجلد الذي يحتوي على ملفات التشغيل. أذكر من الخطوة 5.1.12 الموقع المخصص لملفات النتائج.
- تحديد كافة الملفات نتائج كل حقنة في المدى المنجزة والبنودإك على زر "إضافة إلى قائمة". أسماء هذه الملفات تبدأ "ينج" وتحتوي على تفاصيل المدى.
- انقر على زر "إضافة وتحليل" على المضي قدما في التحليل.
- تحديد جميع العينات في المدى عن طريق النقر على العينة الأولى وسحب المؤشر إلى الأسفل لنموذج آخر ثم انقر فوق "العرض مؤامرات" رمز.
- للتحقق من نوعية معيار الحجم، وفتح قناة البرتقال من نتائج عن طريق التحقق من رمز البرتقال وإلغاء ما تبقى من الرموز الملونة. هذا مهم للتأكد من أن حجم المكالمات دقيقة وموثوق بها.
- لعرض القمم المقابلة لشظايا المستمدة من سيطرة غير مستهدفة واستنساخ المستهدفة، والتحقق من الرموز الزرقاء والخضراء لفتح قراءات من هذه القنوات.
- ضع المؤشر فوق المحور الأفقي أول مؤامرة النتائج وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد "كامل عرض." انتقل لأسفل لعرض كل النتائج في لمحة لتحديدإذا كان هناك أي مشكلة كبيرة مع التشغيل. لزوم في نطاق معين من القيم، بزر الماوس الأيمن فوق الماوس على محور ذي الصلة من المؤامرة، واختيار "تكبير إلى ..."، والمفتاح في مجموعة من القيم من الفائدة.
ملاحظة: واحد مشكلة كبيرة المحتملة هي أن جميع العينات تعطي قمم كثافة منخفضة. هذا عادة ما يكون بسبب التخزين لفترات طويلة من amplicons المسمى fluorophore قبل على المدى الشعرية الكهربائي أو الإفراط في التخفيف من amplicons، والتي يمكن بسهولة أن تصحيح بتكرار الخطوة PCR أو تمييع amplicons باستخدام أقل عامل التخفيف، على التوالي. - لحفظ النتائج، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- ضمان أن يتم اختيار القنوات الأزرق والأخضر وانقر على أيقونة "تحجيم الجدول".
- حفظ الجدول القيم في شكل المفصول نصي (txt) من خلال فتح "ملف" واختيار "تصدير الجدول". اسم الملف وفقا لذلك وحدد موقع الملف في الاختيار.
- لانقاذ مؤامرةالصورة من المدى في شكل PDF، انتقل إلى "ملف" وانقر على خيار "طباعة". اختيار الكاتب PDF ذات الصلة ثم اضغط على "طباعة". اسم الملف وفقا لذلك وحدد موقع الملف في الاختيار.
- لحساب الفرق في حجم الشظايا المستمدة من السيطرة wildtype غير مستهدفة وكريسبر / استنساخ المستهدفة Cas9، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- فتح ملف التبويب نص محدد (النص) من الخطوة 6.9.2 مع برنامج جداول البيانات. وينبغي أن يتضمن الجدول هذه الأعمدة الأربعة الهامة: "صبغ الذروة / عينة" (مما يدل على أن قناة أزرق أو أخضر)، "نموذج اسم الملف" (الأحرف الأولى تشير إلى البئر أو اسم عينة)، "الحجم" (مما يدل على حجم جزء يسمى)، و "الطول" (مما يدل على شدة مضان من الذروة).
- لاستفراد القمم ذات الصلة، واستبعاد تلك التي ليست في نطاق الحجم المتوقع.
ملاحظة: عادة، والطفرات INDEL نادرا ما يؤدي في أكثرمن الفرق 100-BP في الحجم. وبالتالي، يتم استبعاد القمم التي تختلف بأكثر من 100 نقطة أساس من ذروة السيطرة wildtype (الذروة المهيمنة في قناة خضراء) الحجم. ويمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق استخدام "بين" الخيار في إطار مهمة "تنسيق شرطي" في جدول البيانات. - لإزالة قمم غير محددة، والتي لا يمكن تمييزها من مستوى الخلفية، واستخدام "أقل من" الخيار في إطار مهمة "تنسيق شرطي" في برنامج جداول البيانات لاستبعاد القمم التي ارتفاعات تقل عن 2000 وحدة. وقد تم تحديد هذه القيمة قطع تجريبيا، وبالتالي يمكن تعديلها حيث تعتبر مناسبا.
- حساب الفرق في حجم شظية بين كل من القمم مما أدى إلى القناة الزرقاء (كريسبر / استنساخ المستهدفة Cas9) وذروة الوحيدة في (السيطرة wildtype غير مستهدفة) قناة خضراء من خلال طرح هذا الأخير من السابق.
ملاحظة: من المهم استخدام القيم المنسوبة إلى كل electrophor الشعريةESIS عينة، كما قد تكون هناك اختلافات بين عينة في حجم جزء من السيطرة wildtype. - جولة قبالة القيم إلى أقرب عدد صحيح لتحديد عدد من أزواج القواعد التي تم إدراجها أو حذفها منه، إن وجدت، وتسلسل الجيني في السؤال. عندما ضرب جين هو من مصلحة، حدد الحيوانات المستنسخة التي ليست من مضاعفات 3 بي بي الطفرات INDEL لضمان أن هناك انزياح الإطار في تسلسل الترميز.
7. التحقق من حالة خروج المغلوب من النسخ
- توسيع استنساخ خروج المغلوب الفردية من لوحة 96-جيدا (من الخطوات 2.4 و 2.6) إلى 24 لوحة جيدا من قبل trypsinizing الخلايا باستخدام 25 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 125 ميكرولتر من المتوسطة (تستكمل DMEM مع 10٪ FBS) إلى الخلايا trypsinized و resuspend بدقة.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة أكبر قدر من المتوسط ممكن باستخدام شفط فراغ أو ماصة، إعادة تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر من المتوسطة، ونقل تعليق خلية إلى بئر من 24 لوحة جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ حتى تصل خلايا التقاء 80-90٪.
- توسيع الحيوانات المستنسخة الفردية متسلسل من 24 لوحة جيدا لوحة 6 جيدا ومن لوحة 6 جيدا على طبق 10 سم، وعندما تصل إلى 80-90٪ التقاء بتكرار الخطوات 7،1-7،4، وذلك باستخدام وحدات التخزين التالية: 50 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين-EDTA و 150 ميكرولتر من المتوسطة (للتوسع من 24 لوحة جيدا لوحة 6 جيدا) و 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين-EDTA و 1 مل من المتوسط (للتوسع من 6- كذلك لوحة على طبق 10 سم).
- حصاد استنساخ عندما تصل إلى 80-90٪ التقاء كتبها trypsinizing الخلايا باستخدام 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 5 مل من المتوسط (تستكمل DMEM مع 10٪ FBS) إلى الخلايا trypsinized وresuspeالثانية بدقة.
- نقل تعليق خلية بالتساوي إلى أنبوبين 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة المتوسطة قدر الإمكان. جزء واحد من الخلايا غير لاستخراج الحمض النووي الجيني، والآخر هو لمجموع استخراج البروتين.
- للتحقق عبر سانجر تسلسل، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- استخراج الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة كما هو موضح سابقا (12).
- أداء PCR التضخيم من المنطقة التي تمتد الموقع المستهدف كريسبر / Cas9، كما هو موضح في القسم 3.2، ولكن استخدام بادئات غير المسماة. لا تستخدم بادئات المسمى لهذه الخطوة، ومضان من العلامة سوف تتداخل مع خطوة التسلسل سانجر اللاحقة.
- تنقية amplicons باستخدام طقم تنظيف PCR، كما هو موضح سابقا (12).
- تسلسل amplicons النقاء باستخدام بادئات PCR المستخدمة في الخطوة 7.9.2 لتحديد النمط الجيني من الحيوانات المستنسخة، كما وصفها previouslص 12.
- للتحقق عن طريق تحليل لطخة غربية، واستخراج البروتين الكلي من الخلايا wildtype واستنساخ المستهدفة، كما هو موضح سابقا (12).
- إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ضد البروتين من الجين المستهدف، كما هو موضح سابقا 12؛ بالضربة القاضية استنساخ الحقيقي هو خال من التعبير عن بروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن المتوقع تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت وصفها هنا إلى أن تنطبق على أي منطقة يمكن استهدافها في الجينوم في الواقع أي خط الخلية التي هي قابلة للتسليم DNA الأجانب. لقد أثبتنا سابقا تطبيقه من خلال استهداف ثلاثة جينات في خط خلية سرطان القولون والمستقيم 12. هنا، وتبين لنا فعاليته في التنميط الجيني خط خلية سرطان الكبد، HEPG2، مستهدفة مع كريسبر / Cas9 بناء على البروتين الجمعية جسيم نووي 1 هل أعجبتك الجينات 1 (NAP1L1). في الواقع، لقد استخدمت بنجاح الفلورسنت-PCR الشعرية تقنية هلام الكهربائي إلى التركيب الوراثي الخلايا الأخرى المختلفة، بما في ذلك خطوط غير البشرية الثدييات الخلية، والتي تستهدف العديد من الجينات الأخرى 12 و 13.
تجربة-الحكيمة، فلوري-PCR الشعرية الكهربائي للهلام techniqرق سهلة وسريعة لأداء. بعد إدخال Cas9 وsgRNA التعبير يبني في الخلايا، واختيار من الحيوانات المستنسخة إيجابية، وهي lysed الحيوانات المستنسخة الفردية مباشرة من لوحة ثقافة 96-جيدا باستخدام لدينا تحلل العازلة محلية الصنع، مباشرة-ليز الواق 12. في تجربتنا، ولست] الناتج يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية أو أقل لعدة أشهر دون خسائر كبيرة في جودة DNA الجينومية. ويتبع الخطوة تحلل من خطوة التضخيم PCR، الذي ينطوي على إنتاج amplicons الموسومة fluorophore التي تغطي المنطقة كريسبر الهدف. وقد تم تحسين بروتوكول PCR الفلورسنت المقدمة لهذا الغرض، وأنتج باستمرار منتجات PCR وافرة، بغض النظر عن المنطقة التي يجري تضخيمها. ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل هذا القرار من amplicons مشتقة من الخطوة PCR الفلورسنت، مع كل حارة المقابلة لكريسبر الفردية / استنساخ المستهدفة Cas9 ومختلف العصابات الموافقonding إلى المناطق تضخيم الأليلات الفردية في الحيوانات المستنسخة. في تجربتنا، أدى استخدام بلمرة الأخرى وبروتوكولاتها مصاحبة في العائد amplicon أقل. على الرغم من أن هذا يمكن تصحيحه بسهولة عن طريق ضبط عامل التخفيف خلال إعداد نموذج لالكهربائي للهلام الشعرية، الخلفية أو مستوى الضوضاء قد تكون بالتالي أعلى عند استخدام amplicons من انخفاض العائد. بعد الخطوة PCR، وتضعف amplicons، وتلك من العينة wildtype واستنساخ المستهدفة مختلطة في نسبة متساوية قبل إضافتها إلى عازلة الفورماميد منزوع الأيونات ومعيار الحجم، والتشويه والتحريف، وتحل على هلام الشعرية.
بعد الانتهاء من الكهربائي للهلام الشعرية، نتائج التنميط الجيني على استعداد ليتم تحليلها. مطلوبة مجموعتين هامتين من نتائج على المدى الكهربائي: وelectropherograms تحتوي على قمم المقابلة لإشارات مضان الفردية والعشرينالبريد جدول نتيجة تحتوي على جميع القيم الضرورية المطلوبة لحساب. ويبين الشكل 2 النتائج لالتنميط الجيني لاثنين من الحيوانات المستنسخة التي تستهدفها sgRNA ضد الجينات في الخلايا NAP1L1 HEPG2. القمم الخضراء تتوافق مع amplicons من الأليل wildtype تشتته في الخلايا HEPG2 الأبوية، في حين أن القمم الزرقاء تتوافق مع amplicons من INDEL الأليلات التي تحتوي على تحور كريسبر / استنساخ المستهدفة Cas9. كما هو مبين بوضوح، استنساخ هما المسوخ متماثل (المسوخ مع الأليلات تحور مماثل)، مع حذف واحد وعشرة النيوكليوتيدات على كل من الأليلات. ومن المهم أن نلاحظ أن تستخدم لأغراض electropherograms التصور فقط، في حين أن ذروة القيم مهمة في تحديد عدد من الاختلافات زوج قاعدة بين amplicon من الحيوانات المستنسخة المستهدفة وذلك من خلايا wildtype.
للتحقق من صحة صحة الوضع بالضربة القاضية، نوصي أداءسانجر تسلسل وتحليل لطخة غربية لتأكيد إلغاء التعبير الجيني في الخلايا. استنساخ اثنين المحددة أعلاه أعطت نتائج التسلسل سانجر متسقة مع نتائج هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت (الشكل 3A). هم أيضا عرض الاجتثاث الكامل للتعبير البروتين NAP1L1 (الشكل 3B)، كما هو متوقع من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب.
الشكل 1: PCR Amplicons من النسخ HEPG2 المستهدفة من قبل كريسبر / Cas9 ضد NAP1L1 جين. تم حل Amplicons الخطوة PCR الفلورسنت على اثنين من المواد الهلامية الاغاروز منفصلة (العلوي والسفلي)، وكل حارة يناظر استنساخ المستهدفة الفردية. L: سلم DNA (ترد أحجام العصابات الفردية إلى جانب الرسم البياني). الرجاء الضغط عليهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قطع من إشارات مضان من عينتين حل عبر شعري جل الكهربائي. يمثل المحور الأفقي حجم جزء ويمثل المحور الرأسي شدة إشارة مضان. القمم الزرقاء تتوافق مع شظايا المستمدة من كريسبر / استنساخ المستهدفة بوساطة Cas9، في حين تتوافق القمم الخضراء إلى شظايا المشتقة من الخلايا wildtype. خطوط أرجواني تتوافق مع مراكز الدعوة الذروة الآلية التي تحددها برامج التحليل، الذي يصادف المواقف التي تظهر باستمرار قمم عبر العينات. القيم المقدمة بجانب القمم الفردية تتوافق مع أحجام شظايا (في بي بي) ويتم الحصول عليها من برامج التحليل. القيم بين قوسين تصور الفرق المحسوب في الحجم بين FRA الفرديةgments من استنساخ المستهدفة وجزء wildtype. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: نتائج فحوصات للتأكد من خروج المغلوب من الجينات المستهدفة في اثنين من الحيوانات المستنسخة. (A) نتائج التسلسل سانجر و (B) تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين المشار إليه. النيوكليوتيدات باللون الأزرق تمثل تسلسل الهدف sgRNA، منها باللون الأحمر تمثل عزر المجاور protospacer (PAM)، ومنها باللون البني تمثل النيوكليوتيدات استبداله قاعدة، وشرطات تمثل المواقف حيث يتم حذف النوكليوتيدات في أليل. القيم بين قوسين بجوار أسماء استنساخ الفردية تمثل التركيب الوراثي للأليل للاستنساخ. "-1" و "-10 "يعني أن الأليلات تحتوي على حذف واحد وعشرة النيوكليوتيدات، على التوالي حجم تقريبي من البروتينات المكتشفة في طخة غربية يحلل: ~ 54 كيلو دالتون لNAP1L1 و~ 84 كيلو دالتون لP84 (مراقبة التحميل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | حجم رد فعل واحد (ميكرولتر) |
| حل معين كيت | 4 |
| 10X PCR العازلة | 2 |
| 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام (المسمى) | 1 |
| 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي (الخالي من الملصقات) | 1 |
| مزيج 25 ملي dNTP | 0.4 |
| طق البلمرة DNA | 0.2 |
| ماء | 8.4 |
| المحللة المخفف | 3 |
| مجموع | 20 |
الجدول 1: الكواشف لرد الفعل نيون PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح يطرق من جين معين في خط خلية نموذج الاختيار روتين لتوضيح الدور الذي الجين يلعب في هذا السياق الخلوي معين. في الواقع، العديد من الشاشات على نطاق الجينوم متوفرة حاليا التي تستخدم كريسبر / نظام Cas9 لاستهداف الجينات البشرية تقريبا جميع المعروفة في الجينوم 14 و 15 و 16. مع هذه الشاشات على نطاق واسع (أو حتى على نطاق صغير استهداف الجينات الفردية من الفائدة)، فإنه من المهم لتصميم واستخدام sgRNAs تستهدف مواضع مختلفة من نفس الجين. نتائج متسقة عبر sgRNAs المختلفة المستخدمة أن الاستسلام لا لبس فيه تأثير حقيقي للنضوب من الجين. على هذا النحو، فإن استهداف الجين واحد يتطلب خطوة التنميط الجيني كبيرة الحجم إلى التركيب الوراثي بدقة عدد وافر من الحيوانات المستنسخة من كل من sgRNA فرد المستخدمة. ووصفت تقنية الكهربائي للهلام-PCR الشعرية الفلورسنت انهإعادة يمكن أن تؤدي على وجه التحديد هذه المهمة.
بينما معظم أساليب التنميط الجيني الحالية هي قابلة للأغراض الإنتاجية العالية، كل واحد منهم يعاني من بعض القيود المتأصلة التي تجعلها أقل من مثالية. مساح، أو T7E1، الفحص، الذي يكتشف عدم التطابق في DNA دوبلكسات 10، غير قادر على التفريق بين الخلايا wildtype والمسوخ متماثل (استنساخ مع اثنين من الأليلات تحور مماثل) يرجع ذلك إلى حقيقة أن كلا من هذه الحيوانات المستنسخة تسفر الدوبلكس خالية من عدم التطابق 11. طول تقييد جزء تعدد الأشكال (RFLP) الفحص، التي تقدم تقاريرها اختفاء مواقع تقييد بسبب الطفرات INDEL في المنطقة كريسبر الهدف 17، محدودة بسبب توافر تقييد مواقع مناسبة في المنطقة المستهدفة (18). تقنية تحليل الحمض النووي ذوبان، الذي يميز التراكيب الوراثية المختلفة على أساس منحنيات انصهارها 19، 20، يعاني من عدم الاتساق. وبالإضافة إلى ذلك، كل ثلاثة من هذه الأساليب ليست مفيدة بشكل خاص في أنهم لا يبلغون عن حدوث انزياح الإطار في التسلسل الجيني. في المقابل، سانجر تسلسل - الذي هو في الوقت الحاضر تقنية التنميط الجيني الأكثر شعبية - غير مفيدة جدا، لأنه يوفر التسلسل الدقيق للمنطقة الجينومية استهدافهم. ومع ذلك، هذه التقنية مكلفة، خصوصا في التجارب على نطاق واسع. وهكذا، فإن توصيف PCR-الشعرية تقنية هلام الكهربائي الفلورسنت وصفها هنا أمر حيوي لأنه لا يمكن الالتفاف على كل القيود التي غيرها من التقنيات المذكورة أعلاه التي تواجهها.
تقنية الكهربائي للهلام-PCR الشعرية الفلورسنت تمكن المستخدمين من التمييز بين جميع الأنماط الوراثية الممكنة قد تكون موجودة استنساخ في wildtype، متحولة متخالف (تتميز أليل wildtype وأليل متحولة)، متحولة متماثل (يتميز اثنين الرمزالأليلات كال متحولة)، ومتحولة متخالف مركب (تتميز اثنين من الأليلات متحولة غير متطابقة). هذه المورثات هي اختلاف بسهولة عن طريق أنماط قمة في رحلاني. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب التنميط الجيني تقارير الفرق بين حجم جزء من amplicon wildtype وأنه من الحيوانات المستنسخة المستهدفة ودقيقة إلى زوج قاعدة واحدة. هذه التقارير بشكل فعال وجود أو عدم وجود انزياح الإطار في التسلسل الجيني، مما يسمح للمستخدمين للحد من صلاحيتها لعدد قليل من الحيوانات المستنسخة، مما يوفر عليهم الوقت والتكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب يسمح أيضا لمضاعفة الجينات التي تستهدف (أي، يمكن أن الوراثي في وقت واحد أكثر من هدف واحد)، وأنه تمكن من الكشف عن خلية السكان غير متجانسة من وجود أنماط ذروة الشاذة (على سبيل المثال، وجود من ثلاثة أو أكثر من القمم في رحلاني الخلايا مضاعفا). بالإضافة إلى خطوط الخلايا المستخدمة هنا وسابقا 12 </ سوب>، 13، قمنا أيضا مرمزة بنجاح مختلف خطوط الخلايا البشرية وغير البشرية الأخرى، بما في ذلك الخلايا الجذعية والخلايا العصبية (بيانات غير منشورة)، وذلك باستخدام تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت، ونحن نتوقع أن هذه التقنية قابلة للتطبيق إلى أي الخلايا التي هي قابلة للكريسبر / Cas9 الاستهداف. وعلاوة على ذلك، لأن هذا الأسلوب تقارير الوراثي الأليلات الفردية في الخلية، فمن المفيد للغاية في التنميط الجيني خلايا متعددة أليلية، مثل الخلايا السرطانية التي لديها عدم توازن الصبغيات أو التكبير الوراثية.
وصف بروتوكول هنا (بما في ذلك جميع المواد المستخدمة) تم الأمثل لالتنميط الجيني تنوعا وقابلة للتكرار من كريسبر / استنساخ المستهدفة Cas9. ومع ذلك، هناك بعض الأجزاء التي تضمن التعديل. وهي تشمل، ولكنها لا تقتصر على: 1) استخدام ناقلات التعبير sgRNA مختلف (أو استراتيجية استنساخ)، والتي قد تتطلب استخدام استراتيجية اختيار مختلفة(على سبيل المثال، اختيار المضادات الحيوية من الحيوانات المستنسخة بدلا من FACS)؛ 2) استخدام البلمرة مختلفة للخطوة PCR الفلورسنت. و3) استخدام العلامات الفلورية مختلفة. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن اثنين من الخطوات الأساسية في البروتوكول قد يكون مشكلة. لأحد، ويجوز للamplicons PCR الفلورسنت تسفر العصابات غير محددة في رحلاني agarose هلام، أو نمط قمة في رحلاني هلام الشعرية قد تكون "صاخبة". هذا هو الأرجح بسبب نوعية دون المستوى الأمثل من الاشعال PCR، وبالتالي يمكن تصحيحه من خلال إعادة تصميم-هذه الاشعال. نحن ننصح باختبار نوعية الاشعال باستخدام [أليغنوكليوتيد غير المسماة قبل شراء تلك المسمى fluorophore لضمان الاتساق، استنساخ، وخصوصية خطوة التضخيم. العامل الآخر المهم هو أن نلاحظ كفاءة RNA دليل كريسبر، والتي قد تحدد معدل الحصول الحقيقية استنساخ خروج المغلوب إيجابية. لأن أيا من البحث بروغ sgRNAالكباش المتوفرة حاليا هي مضمونة، وفعالية كل فرد sgRNA لا يمكن تحديده إلا تجريبيا. وبالتالي، فمن المهم لتصميم واستخدام أكثر من واحد sgRNA (ويفضل ثلاثة أو أكثر) لكل جينة المستهدفة لتقليل فرصة من عدم الحصول على نسخة خروج المغلوب ناجحة.
في حين أن تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت بالمعلومات وحساسة، وسهلة الاستخدام، لأنه يأتي مع بعض المحاذير. أولا، هذا الأسلوب يتطلب استخدام محلل وراثي، والتي قد لا تكون متاحة بسهولة. ومع ذلك، منذ محلل الوراثية المستخدمة لهذا الغرض هي نفس واحدة تستخدم للتجارب التسلسل سانجر، ويمكن الاستعانة بمصادر خارجية بروتوكول الكهربائي للهلام الشعرية لمقدمي الخدمات التسلسل سانجر القائمة. في الواقع، لقد تم الإعداد لها مسبقا من خلال مزود خدمة التسلسل لأداء بروتوكول الكهربائي للهلام الشعرية في تضاهي عند القيام به في المنزل من حيث التكلفة. الثانية، ودقة techniqرق قد تعاني عندما يتم الطفرات INDEL تشارك أكثر من 30 سنة مضت. في تجربتنا، وتقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورية يميل إلى التقليل من حجم indels عندما لاحظ indels كبيرة (> 30 سنة مضت). ومع ذلك، في تجربتنا، وعرضها على الغالبية العظمى من المسوخ أطوال طفرة قصيرة جدا INDEL (معظمها أقل من 5 بي بي). ومع ذلك، هذا يعتمد إلى حد كبير على الموقع كريسبر الهدف وخط الخلية المستخدمة. ثالثا، تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت ليست قادرة على اكتشاف بدائل قاعدة على إصلاح NHEJ في كريسبر / موقع قطع Cas9. ومع ذلك، فقد ذكر أن استبدال قاعدة نتيجة للإصلاح NHEJ فواصل المزدوج تقطعت بهم السبل هو حدث نادر 21، وأنها لا تغير deleteriously إطار القراءة من الجين. رابعا، هذه التقنية فقط بالكشف عن التغييرات في المنطقة المستهدفة تضخيم في خطوة PCR الفلورسنت، وبالتالي لا الإبلاغ عن أي انحرافات بعيدا عن الهدف (التغيرات الجينية أووtside المنطقة تضخيم). إذا كان مطلوبا مثل مسح شامل للآثار بعيدا عن الهدف من فرد sgRNA كريسبر، نوصي كله تسلسل الجينوم بدقة لكشف أي تغيرات في الجينوم من الحيوانات المستنسخة المستهدفة. ومع ذلك، هذه التجربة مكلفة نوعا ما ليست ضرورية إذا تم استخدام sgRNA أكثر من واحد في الجينات المستهدفة، كما نوقش أعلاه. وأخيرا، وتقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت وصفها هنا لديه الحد الأقصى لحجم جزء من 600 سنة مضت. وهذا قد يشكل مشكلة إذا تتألف المنطقة المستهدفة من سلاسل متكررة أو لديه بشكل استثنائي عالية جوانين-السيتوزين (GC) المحتوى، والتي قد تؤثر على PCR الكفاءة التضخيم وخصوصية. وتؤكد هذه المشكلة يمكن الوقاية منها بسهولة على أهمية الحذر تصميم sgRNA الهدف، الذي يجب أن يتضمن أن يأخذوا بعين الاعتبار التضخيم المناسب من المنطقة المستهدفة. وهكذا، وبالنظر إلى نقاط القوة والمحاذير تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت، وهذه الطريقة سطحي من التنميط الجينيقد تخفف من عبء ارتفاع حجم التنميط الجيني من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب، الذي لا يزال عنق الزجاجة حتى يومنا هذا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة تان شي مين، السيدة هيلين اونج، والدكتور زاو يي لمساعدة مع التجارب الشعرية الكهربائي للهلام. وأيد هذا العمل من قبل NMRC / IRG منح NMRC / 1314/2011 وزارة التربية والتعليم AcRF المستوى 2 منحة صندوق MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
