Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

Published: April 8, 2017 doi: 10.3791/55586
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

Summary

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

Abstract

פיתוחם של כלים הגנום עריכה לתכנות יש להקל את השימוש של גנטיקה הפוכה כדי להבין את תפקידי רצפים גנומיים ספציפיים לשחק בתפקוד של תאים ואורגניזמים כולו. הגורם הזה כבר סייע מאוד על ידי הקדמה האחרונה של קריספר / מערכת-a Cas9 כלי תכליתי המאפשר לחוקרים כדי לתפעל את הגנום transcriptome כדי, בין שאר, לדפוק, להפיל, או לדפוק בגנים בתוך ממוקד דֶרֶך. לצורך לדפוק גן, קריספר / Cas9 בתיווך הפסקות פעמי גדיל לגייס את מסלול תיקון DNA שאינו הומולוגי שהצטרף-סוף להציג החדרה או מחיקת frameshift-גרימת נוקלאוטידים באתר ההפסקה. עם זאת, RNA מדריך פרט עלול לגרום תופעות מחוץ היעד רצויים, ועל מנת לשלול אלה, שימוש RNAs מדריך המרובה הכרחי. ריבוי זה של מטרות גם אומר הקרנה בנפח גבוה של שיבוטים נדרש, אשר בתורו מעלה את השימוש EFficient טכניקת תפוקה גבוהה כדי גנוטיפ השיבוטים בנוקאאוט. טכניקות גנוטיפ נוכחיות או סובלות מגבלות מובנות או לגרום לעלות גבוהה, ולכן טיווחו אותם מתאימים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, פרט לנו את הפרוטוקול לשימוש פלורסנט PCR, אשר משתמש DNA הגנומי של תא lysate הגולמי כתבנית, ולאחר מכן לפתור את שברי PCR באמצעות ג'ל אלקטרופורזה נימים. טכניקה זו היא מדויקת מספיק כדי לבדל הבדל בסיס-זוג אחד בין שבר ולכן היא מתאימה המעידה על הנוכחות או היעדר frameshift ברצף הקידוד של הגנים הממוקדים. ידיעה מדויקת זה מונע את הצורך ביעילות צעד רצף מאשר ומאפשרת למשתמשים לחסוך זמן ועלויות בתהליך. יתר על כן, טכניקה זו הוכיחה להיות תכליתי genotyping בתאי יונקים שונים של מקורות רקמות שונים הממוקדים ידי RNAs מדריך נגד גנים רבים, כפי שמוצג כאן ובמקומות אחרים.

Introduction

גישות גנטיות הפוכות אפשרו למדענים להבהיר את ההשפעות של שינויים ספציפיים בגנום על התא או אורגניזם שלם. לדוגמא, הביטוי של גן מסוים יכול להיות נחלש ידי גן מציאת 1, 2 (הפחתה חלקית) או נוקאאוט גנטי 3, 4 (אבלציה שלם) כדי לקבוע את ההשפעה שיש לכך על הפונקציה של התא או על התפתחות האורגניזם.

ג'ין ניסויים בנוקאאוט הפכו קלים יותר מאז כניסתה של nucleases לתכנות ספציפי ברצף, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs). עם זאת, האפיון היחסי האחרון של התקבץ וביניהם חוזר palindromic קצר בקביעות (קריספר) / מערכת Cas9 עשה את זה קל מאוד עבור כל מעבדה ברחבי העולם לבצע genניסויים בנוקאאוט דואר. בעיקרו של דבר, המערכת קריספר / Cas9 מורכב משני רכיבים-A חיוני RNA מדריך יחיד (sgRNA), אשר מכיר נקשר באמצעות השלמה הבסיס רצף מסוים בגנום, וכן endonuclease שנקרא Cas9. מה שבא אחרי מחייב פעולה מסוימת של מורכבות sgRNA-Cas9 על הדנ"א הגנומי הוא מחשוף פעמיים גדיל של דנ"א. זה, בתורו, מפעיל את מנגנון תגובת ניזק DNA בתא, אשר תוקן לאחר מכן באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) או הומולוגי המסלולים (HR). היות ומנגנון תיקון NHEJ (אבל לא את מנגנון HR) לעתים קרובות תוצאות ההחדרה האקראית או המחיקה של נוקלאוטידים באתר של תיקון, וכתוצאה מכך מוטציות החדרה / מחיקה (indel), הוא עלול לגרום מסגרת הקריאה של אקסון להעביר. מצב זה יכול לגרום נוק אאוט של הגן עקב סיום מוקדם של התרגום וריקבון בתיווך שטויות 5, 6,7.

למרות הנוחות המוענקת על ידי כניסתה של מערכת קריספר / Cas9 ב שחסל גן, גנוטיפ של שיבוטים של תאים ממוקדים נותר צוואר בקבוק, במיוחד תפוקה גבוהה הגדרה 8, 9. טכניקות קיימות או סובלות מגבלות מובנות גדולות או הם יקרים כלכליים. לדוגמה, assay שמאי T7E1, המהווה assay האנזימטית שמזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים 10, הוא לא מסוגל להבחין בין שיבוטים wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים אשר אללים הם מוטציה זהה), שכן יש שיבוטים אלה אללים זהים ובכך לא מציג חוסר התאמה ב- DNA הרצף שלהם 11. בנוסף, שימוש רצף סנגר, הנחשב את תקן זהב genotyping שיבוטי מוטציה, או בהתקנת תפוקה גבוהה אינו רצוי בשל עלותו הגבוהה. כאן, אנו מציגים Detפרוטוקול שמציק של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג'ל ניאון, אשר יכולה לעקוף את המגבלות של הטכניקות גנוטיפ קיימות האחרות, והוא שימושי במיוחד בביצוע מסך תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. שיטה זו היא טכנית פשוטה לביצוע, חוסך זמן ועלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קבלת קריספר / Cas9 במיקוד המשובטים מתא בודד

  1. תאי זרע HEPG2 על צלחת 6-היטב על 500,000 תאים לכל היטב 2 מ"ל של מדיום הנשר ללא אנטיביוטיקה Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). דגירה של 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  2. תאים Transfect עם הפלסמיד שיתוף להביע Cas9 ו sgRNA ספציפי נגד הגן של עניין באמצעות מגיב transfection המתאים לפי הוראות היצרן.
    הערה: לדוגמה, sgRNA ניתן לשכפל לתוך pSpCas9 (BB) -2A-GFP וקטור, כפי שתואר לעיל 4.
  3. החלף את מדיום 4 תרבות - 16 שעות לאחר transfection עם 2 מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה טרי.
  4. אודות 48 שעות לאחר transfection, לאסוף השעית תא בודד על ידי trypsinizing התאים.
    1. Trypsinize התאים 0.2 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להוסיף 1 מ"ל של מדיום מחדש להשעות thoroughly.
  5. מיין את התאים עבור שיבוטים GFP חיובי, כפי שתואר לעיל 12, ולאסוף על 3500 תאים.
  6. פלייט תאים ממוינים GFP חיובי על מנות 10 ס"מ על 500, 1000 ו 2000 תאים לכל צלחת ב 8 מ"ל של מדיום תרבות פניצילין /-בתוספת סטרפטומיצין. דגירה התאים ב C 37 ° ו 5% CO 2.
  7. לשמור על התאים ב- C ° 37 ו 5% CO 2, החלפת בינוני בכל חמישה ימים, עד שהם גדלים לתוך מושבות תא בודד מספיק גדול כדי להיות גלוי לעין בלתי מזוינת. עבור רוב שורות תאים סרטניים, זה לוקח בערך שבועיים מיום ציפוי.
  8. כאשר המושבות הם בגודל המתאים (כלומר, גלוי לעין בלתי מזוינת), להעביר מושבות הפרט בארות צלחת תרבות 96-היטב המכיל 200 μL של DMEM בתוספת 10% FBS.
    1. לשאוב מושבות התא הבודד באמצעות פיפטה 200-μL עם נפח קטן של מדיום. Resuspend התאים ביסודיות בבארות dividual ידי triturating מספר פעמים.
  9. לשמור על התאים ב- C ° 37 ו 5% CO 2, החלפה הבינונית בכל חמישה ימים, עד שהם מגיעים 50 - 90% מפגש. עבור רוב שורות תאים סרטניים, זה לוקח בערך 24 - 48 h.

2. הדנ"א הגנומי חילוץ גולמיים בשיטת תמוגה ישירה

  1. כאשר התאים מגיעים 50 - 90 מפגש%, להסיר כמה שיותר מדיום התרבות המבארת כמו ואקום יניקה רבה ערוצית באמצעות אפשרית או פיפטה רבה ערוצית.
  2. להוסיף 25 μL של 0.05% טריפסין-EDTA (ללא פנול אדום) לתוך כל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  3. Resuspend התאים trypsinized ביסודיות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי הם מנותקים מן השטח פלסטיק.
  4. צור לשכפל של שיבוטים הפרט באמצעות העברת כ 5 μL של ההשעיה תא בודד ל plat תרבות 96-היטב ריקe. הוספת 200 μL של מדיום התרבות היטב כל ולתחזק את התאים עד שיבוטים חיוביים מזוהים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי ניאון (ראה להלן). סדרתי להרחיב את תאי מנות 10 סנטימטרים או כל מידה אחרת של בחירה (ראה סעיף 7).
  5. להוסיף 5 μL של ההשעיה תא בודד מן בשלב 2.3 כדי 10 μL של חיץ ישיר lyse תוצרת בית (10 מ"מ טריס pH 8.0, 2.5 EDTA מ"מ, 0.2 M NaCl, 0.15% SDS, ו 0.3% Tween-20) 12 ב 96 גם צלחת PCR ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. בקצרה צנטריפוגה (להביא את הנוזל אל החלק התחתון של בארות).
  6. הוספת 200 μL של המדיום תרבות ההשעיה ~ 15 μL של תא הנותרים משלב 2.3 ו דגירה 37 ° C ו 5% CO 2, יחד עם לשכפל משלב 2.4.
  7. הנושא את lysates משלב 2.5 לתכנית רכיבת התרמית הבאה כדי להבטיח תמס שלם של התאים ושחרור של הדנ"א הגנומי: 65 מעלות צלזיוס למשך 30 ים, 8 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 65 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דק ', 97 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 8 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה, 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 97 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה, 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, ו 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה בקצרה lysates.
  8. לדלל את lysates על ידי הוספת 40 μL מים nuclease חינם ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגות בקצרה. את lysates בדילול ניתן להשתמש מיד או לאחסן -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ללא אובדן משמעותי של איכות.

3. ביצוע פלורסנט PCR כדי להגביר קריספר / אזורים Cas9 יעד

  1. פריימרים עיצוב שתי קדימה שכותרתו fluorophore (שניהם מסומנים בסוף 5' ) לכל אזור היעד קריספר / Cas9; חיתוך אתרים רחוקים יותר ממרחק 300 נ"ב זה מזה צריך להיחשב שני אזורי היעד נפרדים (למשל, תחל fluorophore שכותרתו ירוקה לשליטת wildtype ממוקדת ו פריימר שכותרתו fluorophore הכחול עבור קריספר / כפילים במיקוד Cas9; ראה הטבלה של מהאטרייה LS).
    1. לרכוש צבעי יסוד אלה שכותרתו קדימה פריימר הפוכה ללא תווית בהתאם. שים לב פריימרים יכול להיות מתוכנן באמצעות כל כלי הבחירה וכי amplicons צריך להיות 200 - 500 נ"ב ארוך.
  2. בצע PCR כפי שתואר לעיל 12 כדי להגביר אזורי היעד באמצעות פריימרים שכותרתו.
    1. השתמש 3 μL של lysates בדילול משלב 2.8 ב תגובת 20-μL (ראה טבלה 1) ואת תכנית רכיבת התרמית הבאה: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (1 מחזור); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 64 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 61 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); 94 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (4 מחזורים); C 94 ° עבור 10 s, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 s, ו 68 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (35 מחזורים).
  3. לפתור 5 μL של amplicons PCR על ג'ל agarose 1% כדי לבדוק הגודל היחסי של ampliconsss = "Xref"> 12.
    הערה: ביצוע שלב זה עבור כל הדגימות מעודדת אך לא הכרחית; פתרון מספר הדוגמות נבחר מספיק כדי להעריך את כמות amplicons נוכח הדגימות בכלל.

4. דוגמאות הכנת ג'ל אלקטרופורזה נימים

  1. לדלל amplicons של wildtype (תאים הוריים לא ממוקדים) ו קריספר / DNA Cas9 במיקוד במי nuclease ללא כ 2.5 ng / μL. הקפד לדלל דגימת DNA wildtype מספיק כדי יתווספו לכל דגימת DNA ממוקד (מינימום של 0.5 μL של המדגם wildtype המדולל מדגם ממוקד נדרש).
  2. מערבבים את wildtype בדילול ודגימות דנ"א ממוקד יחס שווה (למשל, לערבב 1 μL של מדגם wildtype עם 1 μL של מדגם ממוקד).
  3. להוסיף 1 μL של amplicons המעורבת עד 8.7 μL של לפוראמיד deionized ו 0.3 μL של תקן גודל שכותרתו לצבוע צלחת 96-היטב PCR תואמת היווצרותו הגנטיתalyzer.
    הערה: שימוש תערובת הורים של לפוראמיד ואת תקן הגודל (כלומר, הכנה של premix של לפוראמיד ואת תקן הגודל בתוך 29: יחס 1 לפני התוספת של amplicons כדי להבטיח כמויות סטנדרטיות) מומלצת.
  4. בחוזקה לאטום את צלחת ומחממים דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות להשתמש thermocycler PCR.
  5. מניח את הצלחת על קרח מייד אחרי שלב חימום דגירה במשך דקות 3 לפחות.

5. ביצוע נימי ג'ל אלקטרופורזה על נתח גנטי

  1. הגדרת פרמטרי assay, פרוטוקול מכשיר, ואת פרוטוקול קורא בגודל על תוכנת ג'ל אלקטרופורזה נימי מחוברת מנתח גנטי.
    הערה: צעד זה נדרש רק עבור בטווח אלקטרופורזה הראשון; ניתן לשמור את התוכנית לשימוש עתידי. עבור הרץ הבא, ולעבור ישירות אל שלב 5.2.
    1. לחצו על סמל "צור חדש פלייט" על לוח המחוונים תוכנה.
    2. תן rהאו"ם שם דמה ובחר את האפשרויות הבאות: מספר הבארות, 96; סוג פלייט, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; ו פולימר, POP7. לחץ על הכפתור "הקצאת פלייט תוכן".
    3. תחת "מבחנים" לחץ על "צור Assay חדש"; פאנל חדש יופיע.
    4. תן שם assay "Assay FPCR-CGE" ולבדוק כי "סוג יישום" מוגדר כראוי כמו "קטע".
    5. הגדרת פרוטוקול מכשיר על ידי לחיצה על כפתור "צור חדש" תחת "כלי פרוטוקול."
      1. גדר או לבחור באפשרויות והפרמטרים הבאים באיזורים המתאימים: Application סוג, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; פולימר, POP7; סט דיי, G5; Run Module, FragmentAnalysis; שם פרוטוקול, פרוטוקול Instrument FPCR-CGE; טמפרטורת התנור, 60 ° C; הפעל מתח, 19.5 קילו וולט; מתח טרום ריצה, 15 קילו; מתח הזרקה, 1.6 קילו וולט; Run Time, 1330 ים; זמן טרום ריצה, 180 ים; זמן הזרקה, 15 s; נתוני עיכוב, 1 ים.
    6. Clאיכס על הכפתור "החל Assay" ואז "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
    7. הגדרת פרוטוקול קורא בגודל ידי לחיצה על כפתור "צור חדש" תחת "Sizecalling לפרוטוקול."
      1. הגדר או לבחור באפשרויות ופרמטרים הבאים באיזורים המתאימים: פרוטוקול שם, FPCR-CGE Sizecalling לפרוטוקול; גודל סטנדרטי, GS500 (-250) LIZ; גודל-המתקשר, v1.1.0 SizeCaller; הגדרות ניתוח, -; ניתוח טווח, מלא; מדידות טווח, מלא; גודל שיחות שיטה, מקומי דרום; שיא פריימר, הווה; כחול, ירוק, כתום ערוצים, (בדוק); גובה שיא מינימום, 175 עבור כל הערוצים; השתמש החלקה, אין; השתמש Baselining (Baseline חלון (נק ')), (בדוק) 51; מינימום Peak Half רוחב, 2; גודל חלון שיא, 15; פולינום ממעלה, 3; סף מדרון שיא התחל, 0.0; סף מדרון Peak End, 0.0; הגדרות QC, -; איכות גודל, -; להיכשל אם הערך הוא <0.25; Pass אם הערך הוא <0.75; נניח ליניאריות מ 0 נ"ב ל 800 BP; ודגל Pull-Up להניע אם יחס Pull-Up ≤ 0.1 ו- Pull-Up סרוק ≤ 1.
    8. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן על כפתור "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
    9. ודא כי assay נשמר על ידי לחיצה על "שמור לספרייה" כפתור שוב ולצאת הפאנל על ידי לחיצה על כפתור "סגור".
    10. חזרה אל הדף "פלייט תוכן הקצאה", לחץ על "צור חדש שם קובץ אמנה" הקישור תחת "אמנות שם קובץ."
    11. שם התוכנית "FPCR-CGE שם הקובץ."
    12. תחת "תכונות זמינות," לבחור את המאפיינים הרצויים שיופיעו שם הקובץ (כגון "תאריך Run", "זמן של הפעלה," "ובכן עמדה," ו "שם לדוגמא"). בחר את מיקום הקובץ הרצוי שבו התוצאות בטווח תישמרנה.
    13. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן"שמור לספרייה" על הלחצן כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
    14. חזרה על "תוכן הקצאת פלייט" דף, לחץ על הקישור "צור חדש תוצאות הקבוצה" תחת "קבוצות תוצאות."
    15. שם התוכנית "FPCR-CGE תוצאות קבוצות."
    16. תחת "תכונות זמינות," לבחור את המאפיינים הרצויים שיופיעו שם הקובץ (כגון "Assay שם"). בחר את מיקום הקובץ הרצוי שבו התוצאות בטווח תישמרנה.
    17. לחץ על הכפתור "החל Assay" ולאחר מכן על כפתור "שמור לספרייה" כדי לשמור את התוכנית. סגור את הפאנל כדי להמשיך.
  2. הגדרת התוכנית והשג אלקטרופורזה המנוהלים על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. עבור אל מרכז השליטה ולחץ על "פלייט חדש צור" סמל.
    2. שם בטווח כפי רצוי (לעיון קל, לכלול את התאריך, שורת תאים, ואת שם גן). בחר את האפשרויות הבאות: מספר הבארות, 96; סוג פלייט, קטע; אורך נימים, 50 סנטימטרים; ו פולימר, POP7. לחץ על הכפתור "הקצאת פלייט תוכן".
    3. לייבל כל טוב של המדגם על פי הצורך (למשל, מדגם יכול להיקרא בשם "NC" כדי לציין כי גם היא ביקורת שלילית).
    4. פי אמנות שם קובץ " "מבחנים"," ו "קבוצות תוצאות" התיבות, לחץ על "הוסף מספריית הקישור" ובחר את התוכניות שנוצרו בשלב 5.1.3 5.1.17.
    5. הדגש את כל הבארות להיות מנותחות ובחר את התוכניות הרלוונטיות תחת "מבחנים", "אמנות שם קובץ," ו "קבוצות תוצאות" על ידי סימון התיבות לידם.
  3. לפני הטעינה את הצלחת על המגש של המנתח הגנטי, להחיל את הגומייה על הצלחת 96-היטב ולשים את הצלחת האטומה במקרה הפלסטיק שמגיע עם המנתח הגנטי.
  4. לחץ על כפתור "המגש" בחזית של המנתח הגנטי, וכאשר מחדש המגשכואב הקדמי של הציוד, לפתוח את הדלת ואת לטעון את הצלחת העטופה על המגש. ודא כי הצלחת נעולה במקום ולאחר מכן לסגור את הדלת.
  5. לחץ על "פלייט Link עבור Run" כפתור.
  6. ב "טען צלחות עבור Run" הדף, לעשות בדיקה סופית על מנת להבטיח כי כל ריאגנטים בתנאים נכונים וכדי.
  7. לחץ על כפתור "הפעל התחל". כל ריצה של 24 דגימות (בארות 3x8 הראשונות של צלחת 96-היטב) לוקחת פחות מ 55 דקות כדי להשלים.

6. ניתוח של electropherogram לקבוע הבדלים-זוג Base

  1. כאשר בטווח ג'ל אלקטרופורזה הנימים יושלם, לפתוח את תוכנת הניתוח לנתח את התוצאות.
  2. לחץ על "דוגמאות הוסף לפרויקט" סמל ולחפש את התיקייה המכילה את קבצי הריצה. תזכיר משלב 5.1.12 המיקום שהוקצה של קבצי תוצאות.
  3. בחר את כל קבצי התוצאות של כל זריקה בטווח הושלם CLאיכס על הכפתור "הוסף לרשימה"; שמות הקבצים האלה מתחילים עם "inj" ולהכיל את הפרטים של הריצה.
  4. לחץ על "הוסף לנתח" כפתור כדי להמשיך עם הניתוח.
  5. בחר את כל הדגימות בטווח ידי לחיצה על המדגם הראשון וגרירת הסמן למטה כדי המדגם האחרון ולאחר מכן לחץ על הסמל "מגרש תצוגה".
  6. כדי לבדוק את איכות תקן הגודל, לפתוח את הערוץ הכתום של התוצאות על ידי בדיקת הסמל הכתום ביטול סימון שאר הסמלים בצבעים; זה חשוב לוודא כי גנאי הגודל הוא מדויק ואמין.
  7. כדי להציג את הפסגות מתאימות שהברים נגזר משליטתה הממוקדת ואת השיבוטים הממוקדים, לבדוק את הסמלים הכחולים וירוקים לפתוח קריאות מערוצים אלה.
  8. מניח את הסמן מעל הציר האופקי של עלילת התוצאות הראשונה באמצעות לחצן עכבר ימני כדי לבחור "נוף מלא." גלול למטה כדי להציג את כל התוצאות במבט חטוף כדי לקבועאם יש בעיה רצינית עם הריצה. כדי להתמקד בטווח מסוים של ערכים, לחץ לחיצה ימנית על העכבר על הציר הרלוונטי של העלילה, לבחור "התמקד ...," והזין את טווח ערכים של עניין.
    הערה: בעיה עיקרית פוטנציאל אחת היא שכל הדגימות לתת פסגות בעצימות נמוכות. זוהי בדרך כלל עקב האחסון הממושך של amplicons שכותרתו fluorophore לפני ריצת הנימים אלקטרופורזה או יתר הדילול של amplicons, אשר ניתן לתקן בקלות על ידי חזרה על צעד PCR או על ידי דילול amplicons באמצעות גורם לדילול נמוך, בהתאמה.
  9. כדי לשמור את התוצאות, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
    1. ודא כי הערוצים הכחולים וירוקים נבחרים ולחץ על הסמל "לוח מדידות".
    2. שמור טבלת ערכי בפורמט מופרד באמצעות טאבים טקסט (txt) על ידי פתיחת "קובץ" ובחירת "ייצוא טבלה." שם הקובץ בהתאם ובחר את מיקום הקובץ של בחירה.
    3. כדי להציל את העלילהים של ריצה בפורמט PDF, ללכת "קובץ" ולחץ על האפשרות "הדפס". בחר הסופר PDF הרלוונטיים ולחץ על "הדפס". שם הקובץ בהתאם ובחר את מיקום הקובץ של בחירה.
  10. כדי לחשב את ההבדל בגודל של שברי נגזר מלאה wildtype ממוקדות ואת קריספר / כפילים Cas9 במיקוד, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
    1. פתח את הטקסט טאבים (.txt) משלב 6.9.2 באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים. הטבלה צריכה לכלול עמודות חשובות ארבע הבאים: "שיא דיי / מדגם" (מה שמעיד על ערוץ כחול או ירוק), "שם קובץ לדוגמא" (התווים הראשונים מצביעים באר או שם מדגם), "גודל" (המציין את הגודל שבר נקרא), ו "גובה" (המציין את עוצמת הקרינה של שיא).
    2. כדי לייחד את פסגה רלוונטית, להוציא אלה שאינם בטווח הגודל הצפוי.
      הערה: בדרך כלל, מוטציות indel לעתים נדירות לגרום יותרמ הבדל 100-BP בגודלם; וכך, פסגות שגודלם שונים על ידי יותר מ 100 נ"ב מהשיא המלא wildtype (השיא דומיננטי בערוץ הירוק) אינן נכללות. ניתן לעשות זאת בקלות על ידי שימוש "בין" אפשרות תחת פונקציית "עיצוב מותנה" בגיליון האלקטרוני.
    3. כדי להסיר פסגות שאינו ספציפי, אשר הם נבדלים ברמת רקע, השתמש באפשרות "פחות מ-" תחת פונקציית "עיצוב מותנה" בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לשלול פסגות אשר לגבהים נמוכים 2000 יחידות. ערך חיתוך זו נקבע באופן אמפירי ולכן יכול להיות מותאם שבו ראה לנכון.
    4. חשב את ההבדל בגודל מקטעים בין כל אחת הפסגות וכתוצאה מכך את הערוץ הכחול (קריספר / Cas9 במיקוד שיבוטים) ואת השיא הבלעדי בערוץ הירוק (שליטת wildtype הממוקדת) על ידי הפחתת האחרון מהראשון.
      הערה: חשוב להשתמש בערכים המיוחסת לכל נימי electrophorמדגם esis, כפי ייתכנו הבדלים-מדגם הבין את גודל שבר של הבקרה wildtype.
    5. לעגל את הערכים למספר השלם הקרוב ביותר כדי לקבוע את מספר זוגות בסיסים כי הוחדרו או נמחקו מן, אם בכלל, את הרצף הגנומי של השאלה. כאשר לאחר שחיסל הגן הוא עניין, שיבוטים בחר אשר מוטציות indel אינם של בכפולות של 3 נ"ב כדי להבטיח שיש frameshift ברצף קידוד.

אימות 7. מעמד נוק המשובטים

  1. להרחיב שיבוטים בנוקאאוט בודדים מתוך צלחת 96-היטב (מ צעדים 2.4 ו 2.6) לצלחת 24 היטב על ידי trypsinizing התאים באמצעות 25 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. הוספת 125 μL של המדיום (DMEM בתוספת 10% FBS) התאים trypsinized מחדש להשעות באופן יסודי.
  3. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר כמה שיותר הבינוני כמו יניקה אפשרית באמצעות ואקום או טפטפו, להשעות את התא גלול 500 μL של מדיום, ולהעביר את ההשעיה לתא גם צלחת 24-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד התאים מגיעים למפגש 80-90%.
  5. הרחב את שיבוטי הפרט סדר מהצלחת 24-היטב צלחת 6-היטב מהצלחת 6-היטב צלחת 10 סנטימטרים כאשר הם מגיעים 80 - מפגש 90% על ידי צעדים חוזרים 7.1 ל 7.4, באמצעות הכרכים הבאים: 50 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו 150 μL של המדיום (להרחבת מהצלחת 24-היטב צלחת 6-היטב) ו 200 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ו 1 מ"ל של מדיום (להרחבת מן 6- גם צלחת על צלחת 10 ס"מ).
  6. קציר שיבוטים כשהם מגיעים 80 - 90% המפגש ידי trypsinizing התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום (DMEM בתוספת 10% FBS) התאים trypsinized ו resuspeND ביסודיות.
  8. מעבירים את ההשעיה תא באותה מידה לשתי צינורות 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את המדיום ככל האפשר. חלק אחד של התאים הוא להפקת DNA גנומי והשני הוא עבור חילוץ חלבון כולל.
  9. לצורך אימות באמצעות רצף סנגר, בצע את הפעולות המתוארות להלן.
    1. חלץ הדנ"א הגנומי של שיבוטים כפי שתואר לעיל 12.
    2. בצעו הגברה PCR של האזור פורש באתר היעד קריספר / Cas9, כמתואר בסעיף 3.2, אבל להשתמש פריימרים ללא תווית. אין להשתמש פריימרים שכותרתו עבור שלב זה, כמו הקרינה מן התג תפריע צעד הרצף סנגר עוקב.
    3. לטהר את amplicons באמצעות ערכת ניקוי PCR, כפי שתואר לעיל 12.
    4. רצף amplicons מטוהרים באמצעות פריימרים PCR משמש צעד 7.9.2 לקבוע את הגנוטיפ של שיבוטים, כמתואר previously 12.
  10. לצורך האימות באמצעות ניתוח כתם מערבי, לחלץ חלבון הכולל מתאי wildtype ו השיבוטים ממוקדים, כפי שתואר לעיל 12.
    1. ביצוע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כנגד החלבון של גן המטרה, כפי שתואר לעיל 12; שיבוט נוקאאוט אמיתי נטול הביטוי של החלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניאון טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימים המתוארות כאן צפויה לחול בכל אזור ניתן למיקוד בגנום כמעט בכל קו תא ניתן למסירת דנ"א זרה. הוכחנו היישום שלה בעבר על ידי מיקוד שלושה גנים בקו תא סרטן מעי גס 12. הנה, אנחנו מראים את יעילותו genotyping שורת תאי קרצינומה hepatocellular, HEPG2, ממוקדת עם קריספר / Cas9 לבנות כנגד חלבון הנוקלאוזום עצרת 1 כמו 1 (NAP1L1) גן. למעשה, יש לנו בהצלחה ניצלו את הטכניקה ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי ניאון כדי גנוטיפ תאים שונים אחרים, כולל שורות תאים יונקים לא אנושיים, ממוקדות על גנים רבים אחרים 12, 13.

ניסוי חכם, techniq ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנטUE הוא קל ומהיר לביצוע. לאחר כניסתה של ביטוי Cas9 ו sgRNA בונה לתוך התאים ואת הבחירה של שיבוטים חיוביים, השיבוטים הבודדים lysed ישירות מהצלחת התרבות 96-היטב באמצעות חיץ תמוגה תוצרת הבית שלנו, ישיר-Lyse חוצץ 12. מניסיוננו, את lysates וכתוצאה ניתן לאחסן -20 ° C או נמוך מזה מספר חודשים ללא אובדן משמעותי של איכות הדנ"א הגנומי. הצעד ימס ואחריו צעד הגברת PCR, אשר כולל את הייצור של amplicons-tagged fluorophore כי ההיקף באזור יעד קריספר. פרוטוקול PCR פלורסנט סיפקה כבר מותאם למטרה זו הפיק בעקביות מוצרים PCR מספיק, ללא קשר לאזור להיות מוגבר. איור 1 מציג תוצאת נציג ברזולוציה של amplicons נגזר משלב PCR פלורסנט, עם כל נתיב המקביל ל קריספר פרט / שיבוט Cas9 במיקוד ואת הלהקות השונות corresponding לאזורים המוגברים של אללים בודדים השיבוטים. מניסיוננו, שימוש polymerases האחר והפרוטוקולים במקבילים שלהם הניב תשואת amplicon תחתונה. למרות זאת ניתן לתקן בקלות על ידי ההתאמה גורם לדילול במהלך הכנת מדגם עבור ג'ל אלקטרופורזה נימים, ברקע או רמת רעש עלול אפוא להיות גבוה כאשר amplicons של תשואה נמוכה משמש. לאחר שלב PCR, amplicons מדולל, ואלה של מדגם wildtype ואת השיבוטים הממוקדים מעורבבים יחס שווה לפני שהם מתווספים למאגר לפוראמיד deionized ורמת גודל, מפוגל, והחליטו על ג'ל נימים.

לאחר השלמתי ג'ל אלקטרופורזה נימים, התוצאות גנוטיפ מוכנות להיות מנותח. שני סטים חשובים של תוצאות נדרשים מספסרות אלקטרופורזה: את electropherograms המכיל את הפסגות מתאימות אותות ה קרינת פרטלוח ה תוצאה המכיל את כל הערכים הנדרשים לצורך החישוב. איור 2 מראה את התוצאות עבור גנוטיפ של שני שיבוטים ממוקדים ידי sgRNA נגד גן NAP1L1 בתאי HEPG2. הפסגות הירוקות מתאימות amplicons של אלל wildtype הממוקד בתאי HEPG2 ההוריים, ואילו הפסגות הכחולות מתאימות amplicons של אללים מוטציה המכילה indel של קריספר / הכפילים Cas9 במיקוד. כפי שניתן לראות בבירור, שני השיבוטים הם מוטציות הומוזיגוטים (מוטציות עם אללים שעברו מוטציה זהה), עם המחיקה של אחד עשרה נוקלאוטידים משני אללים. חשוב לציין כי electropherograms משמש למטרות להדמיה בלבד, ואילו ערכי השיא חשובים בקביעת מספר הבדלי זוג בסיס בין amplicon של השיבוטים הממוקדים של תאי wildtype.

כדי לאמת את האותנטיות של המעמד בנוקאאוט, אנו ממליצים לבצערצף סנגר וניתוח כתם המערבי כדי לאשר את ביטול ביטוי גנים בתאים. שני השיבוטים שזוהו לעיל נתנו תוצאות רצף סנגר בקנה אחד עם תוצאות ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי ניאון (איור 3 א). הם גם מוצגים אבלציה ביטוי מוחלט חלבון NAP1L1 (איור 3B), כצפוי של שיבוטים בנוקאאוט.

איור 1
איור 1: PCR amplicons של HEPG2 המשובטים ממוקד ידי קריספר / Cas9 נגד NAP1L1 ג'ין. Amplicons של צעד PCR פלורסנט נפתר על שני ג'לי agarose נפרדים (עליון ותחתון), וכל נתיב מקביל שיבוט ממוקד פרט. L: סולם DNA (הגדלים של להקות בודדות מקבלים ליד התרשים). אנא לחץ עליהe-מנת לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מגרשים של אותות קרינה משתי דוגמאות פתרונן באמצעות נימי ג'ל אלקטרופורזה. הציר האופקי מייצג את גודל שהבר והציר האנכי מייצג את עוצמת אות קרינה. בפסגות הכחולות מתאימות שברים נגזרו קריספר / כפילים ממוקדים בתיווך Cas9, בעוד הפסגות הירוקות מתאימות שברים שמקורם בתאי wildtype. קווי מגנט מתאימים עמדות שיא-קורא אוטומטית שקבעו תוכנה לניתוח, אשר מסמנת עמדות כי בעקביות להציג שיאים ברחבי דגימות. הערכים ספקו לצד פסגות בודדות מתאימים הגדלים של שהברים (ב BP) והם מתקבלים תוכנת הניתוח. הערכים בסוגריים מתארים את ההבדל מחושב בגודל בין FRA הפרטgments מ כפיל ממוקד לבין שבר wildtype. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תוצאות המבחנים לאשר את נוק של הגן הממוקד בשני שיבוטים. (א) תוצאות רצף סנגר ו- (ב) ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים כנגד חלבון המצוין. נוקלאוטידים כחולים מייצגים את רצף יעד sgRNA, אלה באדום מייצגים את המוטיב הסמוך protospacer (PAM), אלה חומים מייצגי נוקלאוטידים בסיס להחליף, ואת המקפים לייצג את העמדות שבו נוקלאוטיד נמחק ב האלל. הערכים בסוגריים לצד שמות שיבוט בודדים המייצגים את הגנוטיפ של אללים של שיבוט; "-1" ו- "-10" פירושו כי אללים מכילים מחיקה של נוקלאוטידים אחד ועשרה, בהתאמה גודל מוערך של חלבונים שהתגלו המערבי כתם מנתח:. ~ 54 kDa עבור NAP1L1 ו ~ 84 kDa עבור p84 (טעינה מלאה). אנא לחץ כאן כדי לצפות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מֵגִיב נפח עבור לתגובה אחת (μl)
פתרון ספציפי קיט 4
10x PCR חוצץ 2
פריימר 10 מיקרומטר קדימה (שכותרתו) 1
10 מיקרומטר פריימר הפוכה (ללא תווית) 1
לערבב 25 מ"מ dNTP 0.4
תקי DNA פולימראז 0.2
מַיִם 8.4
lysate מדולל 3
סה"כ 20

טבלה 1: ריאגנטים תגובת PCR פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדפיקות מתוך גן ספציפי בקו תא מודל של בחירה הפכו לשגרת הבהרת התפקיד כי הגן מתנגן כי בהקשר הסלולר בפרט. למעשה, מספר מסכי הגנום זמינים כרגע המשתמשים במערכת קריספר / Cas9 למקד כמעט כל גנים אנושיים הידועים בגנום 14, 15, 16. עם מסכים גדולים בקנה מידה אלה (או אפילו בקנה מידה קטן מיקוד של גנים פרטיים בעלי עניין), חשוב לתכנן ולנצל sgRNAs מיקוד לוקוסים שונים של אותו גן. תוצאות עקביות ברחבי sgRNAs שונים המשמשים היה להיכנע להשפעה אמיתית שאינה משתמעת לשתי פנים של דלדול של הגן. ככזה, המיקוד של גן אחד בודד ידרוש צעד גנוטיפ בנפח גבוה גנוטיפ שפע של שיבוטים במדויק מכל אחד sgRNA הפרט בשימוש. טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט מתוארת היאמחדש יכול לבצע משימה זו בדיוק.

בעוד שרוב השיטות גנוטיפ קיימות ניתנים למטרות תפוקה גבוהה, כל אחד מהם סובל מגבלות מובנות מסוימות ההופכות אותם פחות אידיאלי. המודד, או T7E1, assay, אשר מזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים 10, הוא לא מסוגל להבדיל בין תאי wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים עם שני אללים שעברו מוטציה זהה) בשל העובדה כי הן שיבוטים אלה להניב דופלקסים נטולים mismatches 11. פולימורפיזם אורך קטע הגבלה (RFLP) assay, אשר מדווח על היעלמותם של אתרי הגבלה עקב מוטציות indel באזור היעד קריספר 17, מוגבל על ידי זמינות של אתרי הגבלה מתאים על אזור היעד 18. טכניקת ניתוח היתוך DNA, אשר מבחינה גנוטיפים השונים המבוססים על עקומות ההיתוך שלהם 19, 20, סובל מחוסר עקביות. בנוסף, כל שלוש השיטות אינן אינפורמטיבי במיוחד כי הם לא מדווחים על התרחשות של frameshift ברצף הגנטי. לעומת זאת, רצף סנגר - המהווה כיום את טכניקת גנוטיפ הפופולרית ביותר - הוא אינפורמטיבי מאוד, שכן הוא מספק את הרצף המדויק של האזור הגנומי ממוקד. עם זאת, הטכניקה הזו היא יקרה, במיוחד בניסויים בקנה מידה גדולה. לפיכך, האפיון של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג'ל הניאון המתוארת כאן הוא חיוני משום שהוא יכול לעקוף את כל המגבלות העומדות בפני הטכניקות האחרות שתוארו לעיל.

טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט מאפשרת למשתמשים להבחין בין כל גנוטיפים האפשריים שיבוט יכול להתקיים ב-wildtype, מוטנטיים הטרוזיגוטיים (המאופיינת אלל wildtype ו אלל מוטנטי), מוטציה הומוזיגוטים (מאופיינת שני זיהויאללים מוטנטים iCal), ו מוטציה הטרוזיגוטיים מתחם (מאופיין על ידי שני אללים מוטנטים שאינם זהים). גנוטיפים אלו גזיר בקלות על ידי דפוסי שיא electropherogram. יתר על כן, טכניקה זו גנוטיפ מדווח ההבדל בין גודל שבר של amplicon wildtype וזו של שיבוטים ממוקד מדויק לזוג בסיס יחיד. זה למעשה מדווח על קיומו או אי קיומו של frameshift ברצף הגנטי, המאפשר למשתמשים להפחית האימות שלהם רק קומץ של שיבוטים, שמירתם זמן ועלות. נוסף על כך, טכניקה זו מאפשרת גם עבור הריבוב של גן מיקוד (כלומר, הוא יכול במקביל גנוטיפ יותר ממטרה אחת), והיא מאפשרת זיהוי של אוכלוסיית תא הטרוגנית מן הנוכחות של דפוסי שיא סוטים (למשל, הנוכחות של שלושה או יותר פסגות electropherogram של תאי דיפלואידי). בנוסף לקווי תא בשימוש פה בעבר 12 </ sup>, 13, הצלחנו גם genotyped שורות תאים אנושיים שונות ובלתי אנושיות, כוללים תאי גזע תאים עצביים (נתונים שלא פורסמו), באמצעות טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט, ואנו צופים כי טכניקה זו ישימה לכל התאים ניתנים מיקוד קריספר / Cas9. יתר על כן, מאז הטכניקה הזו מדווחת הגנוטיפ של אללים בודדים בתא, זה מאוד שימושי genotyping תאים רבים-אללים, כגון תאי סרטן שיש aneuploidy או הרחבות גנטיות.

הפרוטוקול המתואר כאן (כולל כל חומר המשמש) עבר אופטימיזציה עבור גנוטיפ תכליתי והדיר של קריספר / כפילים במיקוד Cas9. עם זאת, ישנם כמה חלקים כי להצדיק שינוי. הם כוללים, אך אינם מוגבלים ל: 1) שימוש וקטור ביטוי sgRNA שונה (או אסטרטגית שיבוט), אשר עשוי להצריך שימוש באסטרטגית מבחר שונה(למשל, הבחירה האנטיביוטיה של שיבוטים במקום FACS); 2) שימוש פולימראז שונה עבור צעד PCR פלורסנט; ו 3) השימוש בתוויות ניאון שונה. יתר על כן, ראוי לציין כי כמה צעדים חיוניים בפרוטוקול עלול להיות בעייתי. קודם כל, את amplicons PCR פלורסנט עשוי להניב להקות נוקבות ב electropherogram agarose ג'ל, או דפוס שיא electropherogram ג'ל הנימים עשוי להיות "רועש". זהו ככל הנראה בשל איכות תת-אופטימלית של פריימרים PCR ולכן ניתן לתקן על ידי מחדש בעיצוב פריימרים אלה. אנו ממליצים לבחון את האיכות של פריימרים באמצעות oligonucleotides ללא תווית לפני הרכישה אלה שכותרתו fluorophore כדי להבטיח את העקביות, שחזור, והסגוליות של צעד ההגברה. הגורם החשוב הנוסף שכדאי לציין הוא את היעילות של RNA מדריך קריספר, אשר עשוי לקבוע את שיעור קבלת שיבוטים בנוקאאוט חיובי אמיתיים. מאז אף אחד פרוג חיפוש sgRNAאילים הזמינים כיום הם חסינים תקלות, את היעילות של כל sgRNA פרט יכולה להיקבע רק באופן אמפירי. לכן, חשוב לתכנן ולנצל יותר sgRNA אחד (רצוי שלוש או יותר) עבור כל גן ממוקד כדי להקטין את הסיכוי של לא לקבל שיבוט בנוקאאוט מוצלח.

בעוד טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי הניאון היא אינפורמטיבי, רגישה, וקל לשימוש, הוא מגיע עם כמה אזהרות. ראשית, טכניקה זו דורשת שימוש מנתח גנטי, אשר לא יכול להיות זמינה ונגיש. עם זאת, מאז המנתח הגנטי המשמש למטרה זו הוא אותו אחד המשמש לניסויי רצף סנגר, פרוטוקול אלקטרופורזה הנימים ג'ל ניתן במיקור חוץ לספקי שירות סידור קיים סנגר. למעשה, ערכנו בעבר עם ספק שירות סידור שלנו לבצע את פרוטוקול ג'ל אלקטרופורזה נימים במחיר דומה כאשר נעשה בתוך הבית. שנית, את הדיוק של techniqUE עלול לסבול כאשר מוטציות indel יותר מ 30 נ"ב מעורבות. מניסיוננו, טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט נוטה לזלזל בגודל של indels כאשר indels הגדול (> 30 נ"ב) נבדק. עם זאת, מניסיוננו, רוב המכריע של מוטנטים מוצג אורכי מוטציה indel קצר מאוד (רוב הם פחות מ 5 נ"ב). עם זאת, זה תלוי מאוד באתר קריספר יעד שורת תאים המשמש. שלישית, את טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט אינה מסוגלת לזהות החלפות בסיס על תיקון NHEJ באתר חתך קריספר / Cas9. עם זאת, זה כבר דווח כי החלפת בסיס כתוצאת תיקון NHEJ של הפסקות פעמים התקועות היא אירוע נדיר 21, והם לא deleteriously לשנות את מסגרת הקריאה של הגן. רביעית, טכניקה זו רק מזהה שינויים באזור היעד מוגבר בשלב PCR פלורסנט ולכן אינו לדווח על כל סטיות מחוץ היעד (שינויים גנטיים outside באזור מוגבר). אם סקר כזה מקיף של התופעות מחוץ היעד של sgRNA קריספר פרט נדרש, אנו ממליצים ריצוף הגנום כולו כדי לזהות שינויים במדויק בגנום של השיבוטים הממוקדים. עם זאת, זה ניסוי די יקר אינו הכרחי אם יותר sgRNA אחד משמש לכל גן ממוקד, כפי שפורט לעיל. לאחרונה, טכניקת ג'ל אלקטרופורזה PCR-נימי פלורסנט המתוארת כאן יש מגבלת גודל שבר של 600 נ"ב. זה עלול להוות בעיה אם באזור היעד מורכב רצפים חוזרים או יש גואנין-ציטוזין גבוה במיוחד (GC) תוכן, אשר עשוי להשפיע יעילה וספציפי הגברת PCR. בקלות זה בעיה למניעה מדגישה את החשיבות של עיצוב היעד הזהיר sgRNA, אשר חייב לכלול בחינה נאותה עבור ההגברה המתאימה של אזור המיקוד. לפיכך, בהתחשב החוזק ואזהרות לגבי טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג'ל פלורסנט, שיטה קלילה זו של גנוטיפאולי להקל את הנטל של גנוטיפ בנפח של שיבוטים בנוקאאוט, אשר נותר צוואר בקבוק עד עצם היום הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לגב 'טאן שי מינימום, הגב' הלן אונג, וד"ר זאו יי שעזר עם ניסויי ג'ל אלקטרופורזה נימים. עבודה זו נתמכה על ידי NMRC / IRG להעניק NMRC / 1314/2011 ו מענק קרן Tier 2 משרד החינוך AcRF MOE2011-T2-1-051.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPG2 cells ATCC HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid Addgene PX458
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific 15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade GE Healthcare SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) AITbiotech None Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) AITbiotech None Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer AITbiotech None Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit QIAGEN 201223
Hi-Di Formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard Thermo Fisher Scientific 4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific 4306737
3500xL Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405633
3500 Series 2 program Thermo Fisher Scientific 4476988
Gene Mapper 5 program Thermo Fisher Scientific 4475073
Gentra Puregene Cell Kit QIAGEN 1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
NAP1L1 Antibody (N-term) Abgent AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] GeneTex GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 515-035-003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
  2. O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
  3. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
  6. Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  9. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
  10. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
  11. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
  12. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
  13. Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
  14. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  15. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
  16. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
  17. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
  18. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
  19. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
  20. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
  21. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 122 הגנום עריכה נוקאאוט החדרה / מוטציה מחיקה הקרנת תפוקה גבוהה ימס ישירה multiplexable
באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A.… More

Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M. S., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. J. Vis. Exp. (122), e55586, doi:10.3791/55586 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter