Summary
Den genotyping teknikken beskrevet her, som fluorescerende par polymerase-kjedereaksjon (PCR) for å kapillært gelelektroforese, gjør det mulig for high-throughput genotyping av nuklease-mediert knockout kloner. Det omgår begrensninger overfor andre genotype-teknikker og er mer kostnadseffektivt enn sekvenseringsmetoder.
Abstract
Utviklingen av programmerbare genom-redigeringsverktøy har muliggjort bruk av revers genetikk for å forstå de spesifikke roller genomiske sekvenser spiller i funksjon av celler og hele organismer. Denne årsaken har vært enormt hjulpet av den nylige lanseringen av CRISPR / Cas9 system et allsidig verktøy som lar forskere å manipulere genomet og transkriptomet for å blant annet slå ut, slå ned, eller slå på gener i en målrettet måte. I den hensikt å slå ut et gen, CRISPR / Cas9-medierte dobbel-strengbrudd rekruttere ikke-homologe ende-sammenføyning DNA reparasjon vei for å innføre den rammeskift-forårsaker insersjon eller delesjon av nukleotider ved pause stedet. Imidlertid kan en individuell veiledning RNA føre til uønskede off-target-effekter, og for å utelukke disse ut, er det nødvendig å bruke flere førings-RNA. Denne flerhet av mål betyr også at en høy-volum screening av kloner er nødvendig, som i sin tur ber bruk av en efkelig høy gjennomstrømming teknikk for å genotype knockout kloner. Nåværende teknikker for genotyping enten lider av iboende begrensninger eller medføre høye omkostninger, og dermed gjør dem uegnet for high-throughput formål. Her har vi detalj protokollen for å benytte fluorescens-PCR som anvender genomisk DNA fra rå cellelysat som en mal, og deretter løse de PCR-fragmentene via kapillar-gelelektroforese. Denne teknikken er nøyaktige nok til å skille ett basepar forskjell mellom fragmenter og derfor er tilfredsstillende i å indikere nærvær eller fravær av en rammeskift i den kodende sekvensen til den målsøkte gen. Dette presis kunnskap utelukker effektivt behovet for en bekreftende sekvense trinn, og tillater brukere å spare tid og kostnader i prosessen. Videre har denne teknikk vist seg å være allsidig i genotyping forskjellige pattedyr celler av forskjellige vev opprinnelse rettet av førings RNA mot tallrike gener, slik som vist her og andre steder.
Introduction
Omvendt genetiske metoder har tillatt forskere å belyse effekten av spesifikke endringer i genomet på cellen eller hele organismen. For eksempel kan ekspresjon av et bestemt gen svekkes ved hjelp av gen knockdown 1, 2 (delvis reduksjon) eller gen knockout 3, 4 (fullstendig ablasjon) for å bestemme den virkning dette har på funksjonen av cellen eller på utvikling av organismen.
Gene knockout eksperimenter har blitt lettere siden innføringen av sekvens-spesifikke programmerbare nukleaser, slik som zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjonsaktivator-lignende effektor-nuklease (Talens). Men den relativt nylige karakterisering av gruppert regelmessig ispedd korte palindromisk repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det svært enkelt for alle laboratorie hele verden til å utføre gene knockout eksperimenter. I hovedsak CRISPR / Cas9 system består av to essensielle komponenter et enkelt hjelpe-RNA (sgRNA), som gjenkjenner og binder via base komplementaritet til en spesifikk sekvens i genomet, og en endonuklease som kalles Cas9. Den kjølvannet av den spesifikke binding, og virkningen av sgRNA-Cas9 kompleks på genom-DNA er den dobbelt-tråd spalting av DNA. Dette i sin tur utløser den DNA-skade svar mekanisme i cellen, som deretter reparert via de ikke-homologe ende-sammenføyning (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) veier. Siden NHEJ reparasjonsmekanismen (men ikke den HR-mekanisme) ofte resulterer i tilfeldig innskudd eller delesjon av nukleotider på stedet for reparasjon, noe som resulterer i innsetting / sletting (Indel) mutasjoner, kan det føre til at leserammen til et ekson å skifte. Dette kan da føre til at knockout av genet grunn av for tidlig avslutning av translasjon og nonsense-mediert nedbrytning 5, 6,7.
Til tross for fordelene som oppnås ved innføringen av CRISPR / Cas9 system i å slå ut et gen, den genotyping av kloner av målsøkte celler er fortsatt en flaskehals, spesielt i en high-throughput innstilling 8, 9. Eksisterende teknikker enten lider store iboende begrensninger eller er økonomisk kostbart. For eksempel, er den inspektør eller T7E1 analysen som er en enzymatisk analyse som detekterer feiltilpasninger i DNA-duplekser 10, ikke i stand til å skille mellom villtype-kloner og homozygote mutanter (kloner som alleler er mutert identisk), ettersom disse kloner har identiske alleler og dermed presenterer ikke mistilpasninger i sin DNA-sekvens 11. I tillegg er bruk av Sanger-sekvensering, som regnes som gullstandarden i genotyping mutantkloner, i en high-throughput oppsett uønsket på grunn av sin høye pris. Her presenterer vi en Detailed protokollen av den fluorescerende PCR-kapillar-gel-elektroforese teknikk som kan omgå begrensningene til de andre eksisterende genotyping teknikker, og er spesielt nyttig ved utførelse av en høy gjennomstrøming av nuklease-mediert knockout kloner. Denne metoden er teknisk enkel å utføre og sparer tid og kostnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Innhenting CRISPR / Cas9 målrettede Single-celle kloner
- Seed HepG2-celler i en 6-brønn plate på 500.000 celler per brønn i 2 ml av antibiotika-fritt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Transfektere celler med plasmid samuttrykker Cas9 og spesifikk sgRNA mot genet som er av interesse ved bruk av et passende reagens transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
NB: For eksempel sgRNA kan klones inn i pSpCas9 (BB) -2a-GFP-vektoren som beskrevet tidligere fire. - Sett på kulturmediet 4-16 timer etter transfeksjon med 2 ml nytt antibiotika-fritt medium.
- Omtrent 48 timer etter transfeksjon, samle enkeltcellesuspensjon ved trypsinering av cellene.
- Trypsineres cellene i 0,2 ml av 0,25% trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C i 5 min. Tilsett 1 ml medium og resuspender thoroughly.
- Sortere celler for GFP-positive kloner, som beskrevet tidligere 12, og samle ca 3500-celler.
- Plate GFP-positive celler sortert på 10 cm skåler ved 500, 1000 og 2000 celler pr skål i 8 ml penicillin / streptomycin-supplert kulturmedium. Cellene inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Opprettholdelse av cellene ved 37 ° C og 5% CO2, ved å erstatte mediet hver femte dag, før de vokser inn i kolonier av enkle celler som er store nok til å være synlige for det blotte øye. For de fleste kreftcellelinjer, dette tar ca to uker fra dagen i platekledning.
- Når koloniene er av passende størrelse (dvs. synlig for det blotte øye), overføre individuelle kolonier til brønner i en 96-brønns kulturplate inneholdende 200 ul DMEM supplert med 10% FBS.
- Bortsuging av kolonier av enkle celler ved anvendelse av en 200 ul pipette med et lite volum av mediet. Susp cellene grundig idividual brønner med triturating flere ganger.
- Opprettholde cellene ved 37 ° C og 5% CO 2, og erstatte mediet hver fem dager, før de når 50-90% samløpet. For de fleste kreftcellelinjer, dette tar ca 24-48 timer.
2. Trekke Crude Genomisk DNA ved å bruke et direkte lysemetode
- Når cellene når 50-90% konfluens, fjerne så mye av dyrkningsmediet fra brønnene som mulig ved hjelp av multi-kanal vakuumsug eller en flerkanals pipette.
- Legg 25 ul av 0,05% trypsin-EDTA (uten fenolrødt) til hver brønn og inkuber ved 37 ° C i 7 min.
- Resuspender trypsinerte celler grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Sjekk cellene under et mikroskop for å sørge for at de er løsrevet fra plastoverflaten.
- Skape en gjengivelse av de individuelle kloner ved å overføre omtrent 5 mL av enkeltcellesuspensjonen til en tom 96-brønns kultur plate. Tilsett 200 ul kulturmedium til hver brønn, og opprettholdelse av cellene inntil positive kloner blir identifisert ved hjelp av fluorescerende PCR-kapillær-gel-elektroforese (se nedenfor). Serielt utvide cellene til 10-cm skåler eller andre skala fra valg (se avsnitt 7).
- Tilsett 5 ul av enkeltcellesuspensjonen fra trinn 2,3 til 10 ul av hjemmelaget direkte-lyse-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS, og 0,3% Tween-20) 12 i en 96-brønns PCR plate og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger. Sentrifuger kort (for å bringe væsken ned til bunnen av brønnene).
- Tilsett 200 ul av kulturmediet til den gjenværende ~ 15 ul av cellesuspensjonen fra trinn 2.3 og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2, sammen med den replikere fra trinn 2.4.
- Kaste lysatene fra trinn 2,5 til følgende termiske sykluser program for å sikre fullstendig lysis av cellene og frigjøring av genomisk DNA: 65 ° C i 30 r, 8 ° C i 30 s, 65 ° C i 1,5 minutter, 97 ° C i 3 min, 8 ° C i 1 minutt, 65 ° C i 3 minutter, 97 ° C i 1 minutt, 65 ° C i 1 min, og 80 ° C i 10 min. Sentrifuger lysatene kort.
- Fortynn lysatet ved å tilsette 40 ul av nuklease-fri vann og bland godt ved hjelp av en vortex-blander. Sentrifuger kort. De fortynnede Lysatene kan brukes umiddelbart eller lagres ved -20 ° C i flere måneder uten betydelig tap av kvalitet.
3. Utføre Fluorescent PCR for å amplifisere CRISPR / Cas9 målregioner
- Design to fluoroforen-merkede forover primere (både merket i 5'-enden) for hver CRISPR / Cas9 målregion; skjære steder som ligger lengre enn 300 bp fra hverandre bør betraktes som to separate mål-regioner (for eksempel grønn fluorofor-merket primer for vilkårlige villtypekontroll og blå fluorofor-merket primer for CRISPR / Cas9 rettede kloner; se tabell of Materia vs).
- Skaffe disse merkede forover primere og et ikke-merket revers primer tilsvarende. Merk at primere kan utformes ved hjelp av noen verktøy for valg og at amplikonene bør være 200-500 bp long.
- Utføre PCR som beskrevet tidligere 12 for å amplifisere mål-regioner ved bruk av de merkede primere.
- Bruk 3 pl av fortynnede lysatene fra trinn 2,8 i en 20 ul reaksjon (se tabell 1) og den følgende termiske sykluser program: 94 ° C i 10 minutter (1 syklus); 94 ° C i 10 s, 64 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 minutt (4 sykluser); 94 ° C i 10 s, 61 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 minutt (4 sykluser); 94 ° C i 10 s, 58 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 minutt (4 sykluser); 94 ° C i 10 s, 55 ° C i 30 s, og 68 ° C i 1 min (35 sykluser).
- Løse 5 ul av PCR-amplikoner på en 1% agarosegel for å se etter størrelse og relativ mengde av amplikoneness = "ekstern referanse"> 12.
MERK: Utføre dette trinnet for alle prøvene er oppmuntret, men ikke nødvendig; å løse et valgt antall prøver er tilstrekkelig til å estimere mengden av amplikonene som er tilstede i prøvene generelt.
4. Forberede Prøver for Capillary Gel elektroforese
- Fortynn amplikoner av villtype (ikke-målrettede opphavs-celler) og CRISPR / Cas9-target-DNA i nuklease-fritt vann til omtrent 2,5 ng / pl. Sørge for å fortynne nok villtype DNA-prøve for å bli satt til hver DNA-prøve målrettet (et minimum på 0,5 ul fortynnet villtype-prøve pr målrettet prøven er nødvendig).
- Blande den fortynnede villtype og målrettet DNA-prøver i likt forhold (for eksempel blande 1 pl av villtype-prøven med 1 mL av målrettet prøve).
- Tilsett 1 mL av de blandede amplikonene til 8,7 mL av avionisert formamid og 0,3 ul av fargestoffmerket størrelsesstandard i en 96-brønners PCR-plate som er kompatibel med den genetiske enalyzer.
MERK: Bruken av et konsentrat-blanding av formamidet og størrelsen standard (dvs. en fremstilling av en forblanding av formamidet og størrelsen standard i en 29: 1-forhold før tilsetningen av amplikonene for å sikre standardiserte mengder) anbefales. - Tett forsegling av platen og varme opp prøvene ved 95 ° C i 3 minutter ved anvendelse av en PCR termosykler.
- Sett platen på is umiddelbart etter oppvarmingstrinnet og inkuber i minst 3 min.
5. Gjennomføring Capillary gelelektroforese på en Genetic Analyzer
- Sett opp analyseparametre, instrument-protokoll, og størrelses-ringer protokollen på kapillaret gelelektroforese programvare koblet til en genetisk analysator.
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig for den første elektroforese løp; programmet kan lagres for fremtidig bruk. For påfølgende løp, gå rett til trinn 5.2.- Klikk på "Create New Plate" -ikonet på programvare dashbordet.
- Gi run en dummy navn, og velg følgende alternativer: Antall brønner, 96; Plate Type, Fragment; Capillary Lengde, 50 cm; og Polymer, POP7. Klikk på "Assign Plate innhold" -knappen.
- Under "Analyser," klikk "Opprett ny analyse"; et nytt panel vises.
- Navn analysen "FPCR-CGE-analyse" og sjekk at "Application Type" er riktig innstilt som "Fragment".
- Sett opp instrumentet protokollen ved å klikke på "Opprett ny" knappen under "Instrument Protocol".
- Angi eller velge følgende alternativer og parametere i de aktuelle områdene: Application Type, Fragment; Capillary Lengde, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Protokoll navn, FPCR-CGE Instrument protokollen; Ovnstemperatur, 60 ° C; Kjør Spenning, 19,5 kV; Pre-run Spenning, 15 kV; Injeksjon Spenning, 1,6 kV; Run Time, 1330 s; Pre-kjøring, 180 s; Injeksjon Time, 15 s; og Data Delay, 1 s.
- click på "Bruk på analysen" -knappen og deretter "Lagre til Library" -knappen for å lagre programmet. Lukk panelet for å fortsette.
- Sett opp en størrelse-ringer protokollen ved å klikke på "Opprett ny" knappen under "Sizecalling Protocol".
- Angi eller velge følgende alternativer og parametere i de aktuelle områdene: protokollnavn, FPCR-CGE Sizecalling protokoll; Størrelse standard, GS500 (-250) LIZ; Størrelse-ringer, SizeCaller v1.1.0; Analyse Innstillinger, -; Analyse Range, Full; Dimensjonering Range, Full; Størrelse Calling Method, Lokalt Southern; Primer Peak, nåtid; Blå, grønn, oransje-TV, (Sjekk); Minimum topphøyde, 175 for alle kanalene; Bruk Utjevning, Ingen; Bruk baselining (Baseline Window (PTS)), (sjekk) 51; Minimum Peak halv bredde, 2; Peak vindusstørrelse, 15; Polynom Degree, 3; Slope Threshold Peak Start, 0,0; Slope Threshold Peak End, 0,0; QC Innstillinger, -; Størrelse Kvalitet, -; Mislykket hvis verdi er <0,25; Passere hvis verdi er <0,75; Anta Linearitet fra 0 til 80 bp0 bp; og Betjen Pull-Up flagg hvis Pull-Up Ratio ≤ 0,1 og Pull-Up Scan ≤ 1.
- Klikk på "Bruk på analysen" -knappen og deretter "Lagre til Library" -knappen for å lagre programmet. Lukk panelet for å fortsette.
- Sørg for at analysen er lagret ved å klikke på "Lagre til Library" knappen en gang til og gå ut av panelet ved å klikke på "Close" -knappen.
- Tilbake på "tildele Plate Innhold" -siden, klikk på linken "Create New File Name Convention" under "File navn konvensjonene."
- Navn programmet "FPCR-CGE filnavn."
- Under "Tilgjengelige attributter", velg de ønskede egenskapene som vises i filnavnet (som "Date of Run", "Time of Run", "Vel posisjon," og "Sample Name"). Velg ønsket fil stedet der resultatene fra løp vil bli lagret.
- Klikk på "Bruk på analysen" -knappen og deretter"Lagre til Library" -knappen for å lagre programmet. Lukk panelet for å fortsette.
- Tilbake på "Tilordne Plate Innhold" -siden, klikk på "Create New Resultater gruppe" under "Resultater grupper."
- Navn programmet "FPCR-CGE Resultater grupper."
- Under "Tilgjengelige attributter", velg de ønskede egenskapene som vises i filnavnet (som "analyse navn"). Velg ønsket fil stedet der resultatene fra løp vil bli lagret.
- Klikk på "Bruk på analysen" -knappen og deretter "Lagre til Library" -knappen for å lagre programmet. Lukk panelet for å fortsette.
- Sette opp programmet for en elektroforese kjøres ved å følge trinnene nedenfor.
- Gå til dashbordet og klikk på "Create New Plate" -ikonet.
- Navn kjøringen som ønsket (for enkel referanse, med dato, cellelinje, og genet navn). Velg følgende alternativer: Antall brønner, 96; Plate Type, Fragment; Capillary Lengde, 50 cm; og Polymer, POP7. Klikk på "Assign Plate innhold" -knappen.
- Merk hver brønn av prøven som ønsket (for eksempel en prøve kan bli kalt "NC" for å indikere at brønnen er en negativ kontroll).
- Under "analyser", "filnavn" og "Resultater Grupper" boksene, klikker du på "link til fra Library" og velg programmer laget i trinn 5.1.3 til 5.1.17.
- Marker alle brønnene som skal analyseres, og velg de aktuelle programmene under "Analyser," "filnavn konvensjoner" og "Resultater grupper" ved å sjekke boksene ved siden av dem.
- Før innlasting av platen på brett av den genetiske analysator, anvende gummilisten på den 96-brønns plate og sette den forseglede platen i plastomslaget som følger med den genetiske analysatoren.
- Trykk på "skuff" -knappen på forsiden av genetisk analysator, og når skuffen reverker forsiden av utstyret, åpne døren og laste innkapslet platen på skuffen. Pass på at platen er låst på plass og lukk døren.
- Klikk på "Link Plate for Run" -knappen.
- I "Load Plates for Run" side, gjør en siste sjekk for å sikre at alle reagenser og betingelsene er riktige og i orden.
- Klikk på "Start Run" -knappen. Hver kjøring av 24 prøver (de første 3x8 brønnene i 96-brønns plate) tar mindre enn 55 minutter for å fullføre.
6. Analyse av elektroferogrammet fastslår basepar Forskjeller
- Når det kapillære gelelektroforese løp er fullført, åpner analyse programvare for å analysere resultatene.
- Klikk på "Legg Prøvene til Project" -ikonet og søk etter mappen som inneholder kjøre filer. Husker fra trinn 5.1.12 den tildelte plasseringen av resultatene filer.
- Velg alle resultatene filer av hver injeksjon i ferdig løp og click på "Legg til liste" -knappen; navnene på disse filene begynner med "Inj" og inneholder detaljene i løp.
- Klikk på "Legg til og Analyze" -knappen for å gå videre med analysen.
- Velg alle prøvene i løp ved å klikke på den første prøven og dra markøren ned til den siste prøven, og klikk deretter på "Vis Tomter" -ikonet.
- For å sjekke kvaliteten på størrelse standard, åpne oransje kanal av resultatene ved å sjekke det oransje ikonet og fjerne krysset resten av de fargede ikoner; Dette er viktig for å sikre at størrelsen-ringer er nøyaktig og pålitelig.
- For å vise de topper som svarer til de fragmenter avledet fra den ikke-målrettet kontroll og målrettede klonene, kontrollerer de blå og grønne ikonene for å åpne avlesninger fra disse kanalene.
- Plasser markøren over den horisontale aksen i første resultatene plottet og høyreklikk for å velge "Full View." Bla nedover for å vise alle resultatene på et øyeblikk å bestemmehvis det er noen store problemer med kjøringen. For å zoome inn på et bestemt utvalg av verdier, høyreklikker med musen på den aktuelle aksen av tomten, velge "Zoom til ...", og tast inn verdiområdet av interesse.
MERK: Et potensielt stort problem er at alle prøvene gi lav intensitet topper. Dette er vanligvis på grunn av den langvarige lagring av fluoroforen-merket amplikoner forut for kapillær elektroforese løp eller over-fortynning av amplikonene, som lett kan utbedres ved å gjenta den PCR-trinnet eller ved å fortynne til amplikonene ved anvendelse av en lavere fortynning faktor, henholdsvis. - For å lagre resultatene, følg trinnene beskrevet nedenfor.
- Sørg for at de blå og grønne kanaler er valgt, og klikk på "Dimensjonering Table" ikonet.
- Spar verditabellen i tabulatordelt tekst (.txt) format ved å åpne "File" og velge "Eksporter tabell." Gi filen navnet tilsvarende og velg filen plasseringen av valget.
- For å lagre tomtens av kjøringen i PDF-format, gå til "File" og klikk på "Skriv ut" alternativet. Velg relevant PDF forfatter og trykk "Print". Gi filen navnet tilsvarende og velg filen plasseringen av valget.
- For å beregne forskjell i størrelsen av fragmentene som stammer fra vilkårlige villtype kontroll og CRISPR / Cas9 målrettede kloner ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor.
- Åpne filen tabulatordelt tekst (.txt) fra trinn 6.9.2 med et regnearkprogram. Tabellen skal omfatte disse fire viktige kolonnene: "Dye / prøvetoppen" (som angir en blå eller grønn kanal), "Sample File Name" (de første tegnene indikerer brønn eller prøvenavn), "Size" (som angir størrelsen av fragment heter), og "Høyde" (som viser fluorescens-intensiteten av den topp).
- Å skille ut relevante topper, utelukker de som ikke er i den forventede størrelse.
MERK: Vanligvis Indel mutasjoner sjelden resultere i merenn et 100-bp forskjell i størrelse; således, er toppene hvis størrelse varierer med mer enn 100 bp fra villtype kontroll-toppen (dominant topp i den grønne kanalen) utelukket. Dette kan enkelt gjøres ved å bruke "Between" under "Betinget formatering" -funksjonen i regnearket. - For å fjerne uspesifikke topper, som er umulig å skille fra bakgrunnsnivå, bruk "Less Than" under "Betinget formatering" -funksjonen i regnearkprogram for å utelukke toppene hvis høydene er lavere enn 2000 enheter. Dette cut-off-verdien er blitt bestemt empirisk og kan derfor justeres hvor anses egnet.
- Beregn forskjellen i fragmentstørrelse mellom hver av de resulterende toppene i den blå kanalen (CRISPR / Cas9-målrettede kloner) og den eneste topp i den grønne kanalen (vilkårlige villtype kontroll) ved å trekke den sistnevnte fra førstnevnte.
MERK: Det er viktig å bruke verdier knyttet til hver kapillær electrophoreseESIS prøve, ettersom det kan være inter-prøve forskjeller i fragmentstørrelsen av villtype kontroll. - Avrundes verdien til nærmeste hele tall for å bestemme antall basepar som er blitt satt inn i eller slettet fra, om noen, den genomiske sekvens det gjelder. Ved å slå ut et gen som er av interesse, for å velge kloner som Indel mutasjoner er ikke av multipla av tre bp sikre at det er rammeforskyvning i den kodende sekvens.
7. Verifisering av Knockout Status for Clones
- Utvide individuelle knockout-kloner fra den 96-brønns plate (fra trinn 2,4 og 2,6) til en 24-brønners plate, ved trypsinering av cellene ved anvendelse av 25 ul av 0,25% trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 5 min.
- Legg 125 ul medium (DMEM supplert med 10% FBS) til den trypsinerte cellene og resuspender grundig.
- Overfør cellesuspensjonen til en 15-ml rør og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjerne så mye av det medium som mulig ved hjelp av vakuum-sug eller en pipette, cellepelleten suspenderes i 500 ul medium, og overføre cellesuspensjonen til en brønn av en 24-brønners plate. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 inntil cellene når 80-90% konfluens.
- Utvide de individuelle kloner i serie fra den 24-brønners plate til en 6-brønns plate og fra den 6-brønns plate til en 10-cm skål når de når 80-90% konfluens ved å gjenta trinn 7,1 til 7,4, ved bruk av følgende volumer: 50 ul av 0,25% trypsin-EDTA og 150 ul av medium (for å ekspandere fra den 24-brønners plate til 6-brønn plate) og 200 pl av 0,25% trypsin-EDTA og 1 ml medium (for å ekspandere fra 6- brønners plate til den 10-cm skål).
- Høste klonene når de når 80-90% konfluens, ved trypsinering ble cellene ved anvendelse av 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C i 5 min.
- Tilsett 5 ml av medium (DMEM supplert med 10% FBS) til den trypsinerte celler og resuspend grundig.
- Overfør cellesuspensjonen like inn i to 15-ml rør, sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og fjern mediet så mye som mulig. En porsjon av cellene er for genomisk DNA-ekstraksjon, og den andre er for totalprotein-ekstraksjon.
- For verifisering via Sanger-sekvensering, følg trinnene beskrevet nedenfor.
- Utdrag genomisk DNA fra kloner som beskrevet tidligere 12.
- Utføre PCR-amplifikasjon av den region som spenner over CRISPR / Cas9 målsete, som beskrevet i avsnitt 3.2, men bruker ikke-merkede primere. Bruk ikke merket primere for dette trinnet, som fluorescens fra tag vil forstyrre den påfølgende Sanger-sekvensering trinn.
- Rens amplikonene ved anvendelse av en PCR ren pakke, som tidligere beskrevet 12.
- Sekvensere de rensede amplikonene ved anvendelse av PCR-primere som anvendes i trinn 7.9.2 for å bestemme genotypen til kloner, som beskrevet previously 12.
- For verifisering via Western blot-analyse, ekstrahere total protein fra villtype-celler og målrettede kloner, som beskrevet tidligere 12.
- Utføre Western blot-analyse ved anvendelse av passende antistoffer mot proteinet av målgenet, som beskrevet tidligere 12; en sann knockout klon er blottet for ekspresjon av proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som er beskrevet her, er forventet å være anvendelig for et hvilket som helst kan målrettes region i genomet i praktisk talt en hvilken som helst cellelinje som er mottagelig for fremmed DNA levering. Vi har tidligere demonstrert dens anvendelse ved å målrette tre gener i en kolorektal kreft cellelinje 12. Her viser vi dens effekt i genotyping en leverkreft cellelinje, HepG2, målrettet med en CRISPR / Cas9 konstruere mot nucleosome Assembly Protein 1 Liker 1 (NAP1L1) genet. Faktisk har vi med hell benyttet den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk for å genotype forskjellige andre celler, inkludert ikke-human pattedyrcellelinjer, som er rettet mot en rekke andre gener 12, 13.
Eksperiment-messig, den fluorescerende PCR-kapillar-gelelektroforese technique er enkelt og raskt å utføre. Etter innføringen av Cas9 og sgRNA ekspresjonskonstruksjoner inn i cellene og valg av positive kloner, blir de individuelle kloner lysert direkte fra 96-brønns kulturplate ved hjelp av vår hjemmelagde lyseringsbuffer, Direct-lyseringsbuffer 12. I vår erfaring, kan de resulterende lysatene blir lagret ved -20 ° C eller lavere i flere måneder uten betydelig tap av genomisk DNA kvalitet. Lyseringstrinnet blir etterfulgt av PCR-amplifikasjonstrinnet, som omfatter produksjon av fluoroforen-merket amplikonene som spenner over CRISPR målregionen. Det fluorescerende PCR protokoll som fremlegges er optimalisert for dette formål og har konsekvent produsert rikelig PCR-produktene, uavhengig av det området som skal amplifiseres. Figur 1 viser et representativt resultat av oppløsningen av amplikonene som ble avledet fra den fluoriserende PCR-trinnet, med hver bane svarer til en individuell CRISPR / Cas9 målrettede klon og de forskjellige band CORRESPonding til de forsterkede regionene i de enkelte alleler i klonene. I vår erfaring, bruk av andre polymeraser og deres samtidige protokoller resulterte i et lavere utbytte amplikon. Selv om dette kan lett rettes opp ved å regulere fortynningen under tillagingen for kapillær elektroforese gel, kan bakgrunnen eller støynivået følgelig være høyere når amplikoner med lavere utbytte anvendes. Etter PCR-trinn blir de amplikonene ble fortynnet, og de av villtype-prøven og målrettet klonene blir blandet i likt forhold før de tilsettes til avionisert formamid buffer og en størrelse standard, denaturert, og oppløst på en kapillær gel.
Etter fullførelse av kapillar-gelelektroforese, genotypingen resultatene er klar til å bli analysert. To viktige sett av resultater er nødvendig fra elektroforese løp: de electropherograms inneholder toppene som svarer til de enkelte fluorescenssignaler og the resultattabell som inneholder alle de nødvendige verdier som er nødvendige for beregningen. Figur 2 viser resultatene for genotyping av to kloner målrettet av sgRNA mot NAP1L1 genet i HepG2-celler. De grønne toppene svarer til amplikonene fra den vilkårlige villtype-allelet i de paren HepG2 celler, mens de blå toppene svarer til amplikonene av Indel mutasjonsholdige allel av CRISPR / Cas9-målrettede kloner. Som tydelig vist, er de to kloner er homozygote mutanter (mutanter med identisk muterte alleler), med delesjon av ett og ti nukleotider på begge allelene. Det er viktig å merke seg at electropherograms brukes kun for visualisering, mens toppverdiene er viktig for å bestemme antall basepar store forskjeller mellom den fragment av målrettede klonene og den til villtype-celler.
For å validere ektheten av knockout status, anbefaler vi å utføreSanger-sekvensering og Western blot-analyse for å bekrefte avskaffelse av genekspresjon i cellene. De to kloner som er identifisert ovenfor, gav Sanger-sekvensering resultater i samsvar med resultater som de fluoriserende PCR-kapillar-gel-elektroforese (figur 3A). De viste også fullstendig ablasjon av NAP1L1 proteinekspresjon (figur 3B), som forventet fra knockout kloner.
Figur 1: PCR-amplikoner i HepG2 Clones målrettet ved CRISPR / Cas9 Mot NAP1L1 Gene. Amplikoner i det fluorescerende PCR-trinnet ble løst på to separate agarosegeler (topp og bunn), og hvert felt tilsvarer et individuelt målrettede klon. L: DNA-stige (størrelsene av individuelle bånd er gitt ved siden av diagrammet). Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tomter av fluorescens Signaler fra to prøver spaltet via Kapillær gelelektroforese. Den horisontale aksen representerer fragmentstørrelsen og den vertikale aksen representerer den fluorescens-signalintensiteten. De blå toppene tilsvarer fragmenter avledet fra CRISPR / Cas9-medierte målrettede kloner, mens de grønne toppene svarer til fragmenter avledet fra villtype-celler. Magenta linjer samsvarer med automatiske topp-ringer bestemte posisjoner ved hjelp av dataanalyser, som markerer posisjoner som hele tiden viser topper på tvers av prøver. Verdiene som er angitt ved siden av individuelle topper svarer til størrelsene av fragmentene (i bp) og blir oppnådd fra analyseprogramvare. Verdiene i parentes viser den beregnede forskjell i størrelse mellom individ FRAgments fra en målrettet klon og villtype-fragmentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Resultater av prøver for å bekrefte Knockout på den målrettede genet i to kloner. (A) Sanger-sekvenseringsresultater og (B) Western blot-analyse ved anvendelse av antistoff mot angitte protein. Nukleotider i blått representerer sgRNA målsekvensen, de i rødt representerer protospacer tilstøtende motiv (PAM), som brukes i brun representerer basis-substituerte nukleotider, og strekene representerer posisjonene hvor nukleotidsekvensen er deletert i allelet. Verdiene i parentes ved siden av de enkelte klone navnene representerer genotypen av alleler av klone; "-1" og "-10" betyr at lene inneholder en delesjon av ett og ti nukleotider, henholdsvis Omtrentlig størrelse av proteiner som detekteres i Western blot-analyser.: ~ 54 kDa for NAP1L1 og ~ 84 kDa for p84 (lasting kontroll). Trykk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| reagens | Volum for en reaksjon (il) |
| Kit spesifikk løsning | 4 |
| 10 x PCR-buffer | 2 |
| 10 uM forover primer (merket) | 1 |
| 10 uM revers primer (umerket) | 1 |
| 25 mM dNTP blanding | 0.4 |
| Taq DNA Polymerase | 0.2 |
| Vann | 8.4 |
| fortynnet lysat | 3 |
| Total | 20 |
Tabell 1: Reagenser for det fluoriserende PCR-reaksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Banke ut av et spesifikt gen i en modell cellelinje av valget har blitt rutine for å belyse rollen at genet spiller i den bestemte celle sammenheng. Faktisk er flere genomskjermer er for tiden tilgjengelig som bruker CRISPR / Cas9 system for å føre praktisk talt alle kjente humane gener i genomet 14, 15, 16. Med disse store skjermer (eller til og med små-skala målretting av individuelle gener som er av interesse), er det viktig å utforme og bruke sgRNAs målrettet mot forskjellige loci av det samme gen. Konsistente resultater på tvers av de forskjellige sgRNAs som brukes vil utvetydig capitulate den egentlige effekt av uttømming av genet. Som sådan vil den målsøking av en enkelt gen krever et høyt volum genotyping trinn for nøyaktig å genotype en rekke kloner fra hver av de individuelle sgRNA anvendes. Det fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som er beskrevet hanre nøyaktig kan utføre denne oppgaven.
Mens de fleste av de eksisterende metoder for genotyping er mottagelig for high-throughput formål, hver av dem lider av visse iboende begrensninger som gjør dem mindre enn ideell. Måler, eller T7E1, analyse som detekterer feiltilpasninger i DNA-duplekser 10, er ikke i stand til å skille mellom villtype-celler og som er homozygote mutanter (kloner med to identisk muterte alleler) på grunn av det faktum at begge disse klonene ga dupleksene blottet for mistilpasninger 11. Den rflp (RFLP-analyse), som rapporterer forsvinningen av restriksjonsseter som følge av Indel mutasjoner i CRISPR mål-området 17, er begrenset av tilgjengeligheten av egnede restriksjonsseter ved målområdet 18. DNA-smeltende analyseteknikk, som skjelner de forskjellige genotyper basert på deres smeltekurver 19, 20, lider av en mangel på konsistens. I tillegg har alle disse tre fremgangsmåter er ikke spesielt informative ved at de ikke rapporterer forekomsten av et rammeskift i den genetiske sekvens. I kontrast, Sanger-sekvensering - som er i dag den mest populære genotyping teknikk - er svært informativ, siden det gir nøyaktig sekvens av genomisk region blir målrettet. Imidlertid er denne teknikken kostbart, spesielt i store eksperimenter. Således, karakteriseringen av det fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som er beskrevet her er viktig fordi den kan omgå alle de begrensninger som står overfor de andre teknikkene som er beskrevet ovenfor.
Det fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som gjør det mulig å skjelne mellom alle mulige genotyper en klon som kan forekomme i-villtype, heterozygot mutant (karakterisert ved et villtype-allel og en mutert allel), homozygot mutant (karakterisert ved to identical mutante alleler), og forbindelsen heterozygot mutant (karakterisert av to ikke-identiske mutante alleler). Disse genotypene er lett deriverbar ved rush mønstre i elektroferogrammet. Videre rapporterer dette genotyping teknikken forskjellen mellom fragmentstørrelsen av villtype amplikonet og at de målrettede kloner og er nøyaktig til et enkelt basepar. Dette rapporterer effektivt nærvær eller fravær av en rammeskift i den genetiske sekvensen, slik at brukerne for å redusere deres validering til kun en håndfull av kloner, lagrer dem tid og kostnader. På toppen av det, denne teknikken gjør det også mulig for multipleksing av gen-målsøking (dvs., kan det samtidig genotype mer enn ett mål), og det muliggjør deteksjon av en heterogen cellepopulasjon fra tilstedeværelsen av avvikende topp-mønstre (f.eks nærvær av tre eller flere topper i elektroferogrammet av diploide celler). I tillegg til cellelinjene anvendt her og tidligere 12 </ sup>, 13, har vi også med hell genotypet forskjellige andre humane og ikke-humane cellelinjer, inkludert stamceller og neuronale celler (upubliserte data), ved bruk av det fluorescerende PCR-kapillar-gel-elektroforese teknikk, og vi regner med at denne teknikk er anvendelig til eventuelle celler som kan påvirkes med CRISPR / Cas9 målretting. Dessuten, siden denne teknikk rapporterer genotypen av individuelle lene i cellen, er det svært nyttig i genotyping fler alleliske celler, slik som kreftceller som har Aneuploidy eller genetiske amplifikasjoner.
Protokollen er beskrevet her (inkludert alle materialet som benyttes) er optimalisert for den allsidige og reproduserbar genotyping av CRISPR / Cas9-målrettede kloner. Likevel er det noen deler som garanterer modifisering. De omfatter, men er ikke begrenset til: 1) bruken av et annet sgRNA ekspresjonsvektor (eller kloningsstrategi), noe som kan nødvendiggjøre bruk av et annet alternativ strategi(For eksempel, det antibiotisk utvelgelse av kloner i stedet for FACS); 2) bruk av en annen polymerase for det fluorescerende PCR-trinnet; og 3) bruk av forskjellige fluorescerende markører. Videre er det verdt å merke seg at et par viktige trinn i protokollen kan vise seg problematisk. For det første kan de fluoriserende PCR-amplikoner dannelse av uspesifikke bånd i agarosegelen elektroferogrammet, eller toppen mønster i kapillarrøret gelen elektroferogrammet kan være "støy". Dette er sannsynligvis på grunn av sub-optimal kvalitet av PCR-primerne og kan derfor rettes opp ved re-utforming av disse primere. Det anbefales å teste kvaliteten av primerne under anvendelse av umerkede oligonukleotider forut for å fremskaffe fluoroforen-merket seg for å sikre konsistens, reproduserbarhet, og spesifisiteten til forsterkertrinnet. Den andre viktige faktoren er å merke seg at effektiviteten av CRISPR guide-RNA, som kan bestemme frekvensen av å ta sanne positive knockout kloner. Siden ingen av sgRNA søk progværer som for tiden er tilgjengelige er idiotsikker, var effekten av hver enkelt sgRNA kan bare bestemmes empirisk. Derfor er det viktig å utforme og bruke mer enn ett sgRNA (fortrinnsvis tre eller flere) for hver målrettet gen for å redusere muligheten for ikke å oppnå en vellykket knockout klon.
Mens den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk er informativ, følsom og lett å bruke, den kommer med noen begrensninger. For det første krever denne teknikk bruken av en genetisk analysator, som ikke alltid er lett tilgjengelige. Imidlertid, siden den genetiske analysator anvendt for dette formål er den samme som ble brukt for Sanger-sekvensering eksperimenter, kapillar-gelelektroforese protokollen kan bli satt ut til eksisterende Sanger-sekvensering tjenesteleverandører. Faktisk har vi tidligere arrangert med vår sekvense tjenesteleverandøren for å utføre kapillær gel elektroforese protokoll til en kostnad sammenlignes når det gjøres i huset. For det andre, nøyaktigheten av technique kan lide når Indel mutasjoner lenger enn 30 bp er involvert. I vår erfaring, tenderer den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk for å undervurdere størrelsen på indels når store indels (> 30 bp) ble observert. Men i vår erfaring, vises et stort flertall av mutanter svært kort Indel mutasjonslengder (de fleste er mindre enn 5 bp). Ikke desto mindre er dette svært avhengig av CRISPR målstedet og cellelinje som brukes. For det tredje er den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som ikke er i stand til å gjenkjenne basesubstitusjon ved NHEJ reparasjon på CRISPR / Cas9 snitt området. Ikke desto mindre har det blitt rapportert at basesubstitusjon som et resultat av den NHEJ reparasjon av dobbelt-trådet bryter er en sjelden hendelse 21, og de ikke på skadelig måte forandre leserammen til genet. For det fjerde, denne teknikken bare detekterer endringer i målområdet amplifisert i det fluorescerende PCR-trinnet og således ikke rapportere enhver off-target aberrasjoner (genetiske endringer outside den amplifiserte regionen). Hvis det er nødvendig, for eksempel en omfattende undersøkelse av de off-target effekter av enkelte CRISPR sgRNA, anbefaler vi hele genomsekvense til nøyaktig oppdage eventuelle endringer i genomet til målrettede kloner. Dette er imidlertid ganske kostbare forsøk ikke nødvendig hvis mer enn ett sgRNA anvendes pr målrettet gen, som diskutert ovenfor. Siste, den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk som er beskrevet her har en fragmentstørrelse grense på 600 bp. Dette kan utgjøre et problem hvis målregionen består av gjentatte sekvenser eller har usedvanlig høy guanin-cytosin (GC) innhold, noe som kan påvirke PCR-amplifikasjon effektivitet og spesifisitet. Denne lett forebygges problem understreker viktigheten av nøye sgRNA mål design, som må inneholde riktig behandling for den aktuelle forsterkning av målrettede regionen. Således, tatt i betraktning sterke og begrensninger av den fluorescerende PCR-kapillar-elektroforese teknikk, dette lettvint fremgangsmåte for genotypingkan lette byrden av høy-volum genotyping av knockout-kloner, som fortsatt er en flaskehals på denne dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Ms Tan Shi Min, Ms Helen Ong, og Dr. Zhao Yi for å hjelpe med kapillær gel elektroforese eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NMRC / IRG gi NMRC / 1314/2011 og MOE AcRF Tier 2 Fund bevilgning MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
