Summary
La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.
Abstract
Le développement d'outils d'édition programmables génome a facilité l'utilisation de la génétique inverse pour comprendre les rôles des séquences génomiques spécifiques jouent dans le fonctionnement des cellules et des organismes entiers. Cette cause a été aidé énormément par l'introduction récente du système un CRISPR / cas9 outil polyvalent qui permet aux chercheurs de manipuler le génome et du transcriptome afin, entre autres, assomment, abattre ou frapper dans les gènes dans une cible manière. Dans le but de frapper sur un gène, CRISPR / cas9 médiée cassures double brin recrutent la voie de réparation de l'ADN d'assemblage terminal non homologue pour introduire l'insertion du cadre de lecture à l'origine ou la suppression de nucleotides au niveau du site de coupure. Cependant, un ARN de guidage individuel peut entraîner des effets indésirables hors cible, et pour écarter ces derniers dehors, l'utilisation des ARN guides multiples est nécessaire. Cette multiplicité des cibles signifie également qu'un criblage à haut volume de clones est nécessaire, ce qui soulève l'utilisation d'un efFicient technique à haut débit pour le génotype des clones knock-out. techniques de génotypage actuelles soit souffrent de limitations inhérentes ou entraînent des coûts élevés, les rendant donc impropre à des fins à haut débit. Ici, nous détaillons le protocole pour l'utilisation de la PCR fluorescente qui utilise l'ADN génomique à partir d'un lysat cellulaire brut sous forme d'un gabarit, puis la résolution des fragments de PCR par électrophorèse sur gel capillaire. Cette technique est suffisamment précis pour différencier une différence de paire de bases entre les fragments et est donc suffisante pour indiquer la présence ou l'absence d'un cadre de lecture dans la séquence codante du gène ciblé. Cette connaissance précise empêche effectivement la nécessité d'une étape de séquençage de confirmation et permet aux utilisateurs de gagner du temps et des coûts dans le processus. De plus, cette technique est avérée être polyvalent dans génotypage diverses cellules de mammifères de diverses origines de tissus ciblés par les ARN de guidage contre de nombreux gènes, comme le montre ici et ailleurs.
Introduction
approches de génétique inverse ont permis aux scientifiques d'élucider les effets des altérations spécifiques dans le génome de la cellule ou organisme entier. Par exemple, l'expression d'un gène particulier peut être atténué par le gène knock - down 1, 2 (réduction partielle) ou knock - out de gène 3, 4 (ablation complète) afin de déterminer l'effet que cela a sur la fonction de la cellule ou sur la développement de l'organisme.
expériences de knock-out de gène sont devenues plus faciles depuis l'introduction des nucleases spécifiques de séquences programmables, tels que des nucléases doigt de zinc (ZFN) et la transcription des nucléases effectrices de type activateur (TALENS). Cependant, la caractérisation relativement récente du CLUSTERED régulièrement entrecoupés de courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a rendu extrêmement facile pour tout laboratoire dans le monde entier pour effectuer genexpériences e knock-out. En substance, le CRISPR / système cas9 se compose de deux composants essentiels d'un ARN de guidage unique (ARN sg), qui reconnaît et se lie par l'intermédiaire d'une complémentarité de base à une séquence spécifique dans le génome, et une endonucléase appelé cas9. Le lendemain de la liaison spécifique et de l'action du complexe ARN sg-cas9 sur l'ADN génomique est le clivage double brin de l'ADN. Ceci, à son tour, déclenche le mécanisme de réponse aux dommages de l'ADN dans la cellule, qui est ensuite réparé par l'intermédiaire des voies d'extrémité d'assemblage non homologues (NHEJ) ou la recombinaison homologue (RH). Le mécanisme de réparation NHEJ (mais pas le mécanisme des ressources humaines) se traduit souvent par l'insertion aléatoire ou la suppression des nucléotides sur le site de réparation, ce qui entraîne des mutations d'insertion / délétion (indels), il peut provoquer le cadre de lecture d'un exon à passer. Cela peut alors entraîner le knock - out du gène en raison de la fin prématurée de la traduction et la carie médiation non - sens 5, 6,7.
En dépit de la mise en pratique offerte par l'introduction du CRISPR / système cas9 en assommant un gène, le génotypage des clones de cellules cibles reste un goulot d' étranglement, en particulier dans un haut débit 8, 9. Les techniques existantes, soit souffrent de graves limitations inhérentes ou sont financièrement coûteuses. Par exemple, le géomètre ou un dosage T7E1, qui est un essai enzymatique qui détecte des mésappariements de l'ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de distinguer entre les clones de type sauvage et des mutants homozygotes (clones dont les allèles sont mutés de manière identique), étant donné que ces clones ont des alleles identiques et donc ne présentent pas de mésappariements dans leur séquence d'ADN 11. De plus, l'utilisation du séquençage Sanger, qui est considéré comme l'étalon-or dans le génotypage des clones mutants, dans une configuration à haut débit est indésirable en raison de son coût élevé. Nous présentons ici un detailed protocole de la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, qui peut contourner les limitations des autres techniques de génotypage existantes et est particulièrement utile pour effectuer un criblage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Cette méthode est techniquement simple à réaliser et de gagner du temps et de coût.
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Protocol
1. Obtenir CRISPR / cas9 ciblées Clones unicellulaires
- Graine de cellules HEPG2 sur une plaque à 6 puits à raison de 500.000 cellules par puits dans 2 ml d'antibiotique de Dulbecco sans Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- transfecter des cellules avec un plasmide co-exprimant cas9 et ARN sg spécifique contre le gène d'intérêt en utilisant un réactif de transfection approprié selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: Par exemple, ARNsg peut être cloné dans le vecteur GFP--2A pSpCas9 (BB), comme décrit précédemment 4. - Remplacer le milieu de culture de 4 à 16 h après la transfection avec 2 ml de milieu sans antibiotique frais.
- Environ 48 heures après la transfection, recueillir suspension unicellulaire par trypsinisation les cellules.
- Trypsiniser les cellules dans 0,2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 1 ml de milieu et remettre en suspension thoroughly.
- Trier les cellules pour les clones GFP-positives, comme décrit précédemment 12, et de recueillir environ 3500 cellules.
- Plaque les cellules GFP-positives triées sur des boîtes de 10 cm à 500, 1000 et 2000 cellules par boîte dans 8 ml de pénicilline / streptomycine milieu de culture supplémenté. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en remplaçant le milieu tous les cinq jours, jusqu'à ce qu'elles se développent en colonies unicellulaires assez grandes pour être visibles à l'oeil nu. Pour la plupart des lignées de cellules cancéreuses, cela prend environ deux semaines à partir du jour de placage.
- Lorsque les colonies sont de la taille appropriée ( par exemple, visible à l'oeil nu), le transfert des colonies individuelles à des puits d'une plaque de culture à 96 puits contenant 200 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
- Aspirer les colonies unicellulaires à l'aide d'une pipette de 200 pi avec un petit volume de milieu. Remettre les cellules à fond dans dedividuelle puits en triturant plusieurs fois.
- Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en remplaçant le milieu tous les cinq jours, jusqu'à ce qu'ils atteignent 50-90% de confluence. Pour la plupart des lignées de cellules cancéreuses, cela prend environ 24 - 48 h.
2. ADN génomique brut Extracting L'utilisation d'un Lyse directe Méthode
- Lorsque les cellules atteignent 50-90% de confluence, enlever autant du milieu de culture des puits que possible en utilisant une aspiration sous vide multi-canal ou une pipette à canaux multiples.
- Ajouter 25 pi de 0,05% de trypsine-EDTA (sans rouge de phénol) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min.
- Remettre les cellules trypsinisées à fond par pipetant plusieurs fois. Vérifiez les cellules sous un microscope pour assurer qu'ils sont détachés de la surface en plastique.
- Créer une réplique des clones individuels en transférant environ 5 ul de la suspension à cellule unique à un 96 puits de culture plat videe. Ajouter 200 ul de milieu de culture à chaque puits et maintenir les cellules jusqu'à ce que les clones positifs sont identifiés en utilisant une électrophorèse sur gel de PCR-capillaire fluorescente (voir ci-dessous). Développer les cellules en série à des boîtes de 10 cm ou toute autre échelle de choix (voir la section 7).
- Ajouter 5 ul de la suspension de cellules isolées à partir de l' étape 2.3 à 10 pl de tampon maison-lyse directe (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 2,5 mM, NaCl 0,2 M, 0,15% de SDS et 0,3% de Tween-20) 12 dans un plaque PCR 96 puits et mélanger en pipetant plusieurs fois. Centrifuger brièvement (pour amener le liquide vers le fond du puits).
- Ajouter 200 ul de milieu de culture pour le reste de ~ 15 pi de suspension cellulaire de l' étape 2.3 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2, ainsi que la répétition de l' étape 2.4.
- Soumettre les lysats de l'étape 2.5 pour le programme de cycles thermiques suivant pour assurer une lyse complète des cellules et la libération de l'ADN génomique: 65 ° C pendant 30 s, 8 ° C pendant 30 s, 65 ° C pendant 1,5 min, 97 ° C pendant 3 minutes, 8 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 3 min, 97 ° C pendant 1 min, 65 ° C pendant 1 min, et 80 ° C pendant 10 min. Centrifuger brièvement les lysats.
- Diluer les lysats en ajoutant 40 ul d'eau sans nucléase et mélanger soigneusement à l'aide d'un mélangeur à vortex. centrifuger brièvement. Les lysats dilués peuvent être utilisés immédiatement ou conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois sans perte significative de qualité.
3. Exécution PCR fluorescente à Amplifier CRISPR / cas9 Régions cibles
- Concevoir deux amorces marqué par un fluorophore vers l'avant (à la fois marqué à l'extrémité 5' ) pour chaque CRISPR / cas9 région cible; les sites de coupe qui sont plus de 300 pb de l'autre doivent être considérés comme deux régions cibles séparées (par exemple, vert amorce marqué par un fluorophore pour le contrôle de type sauvage non ciblé et bleu amorce marqué par un fluorophore pour CRISPR / clones cas9 ciblés; voir le Tableau of Materia ls).
- Se procurer ces amorces marquées vers l'avant et une amorce inverse non marqué en conséquence. Notez que les amorces peuvent être conçues en utilisant un outil de choix et que les amplicons doivent être 200 - 500 pb à long.
- Effectuer la PCR comme décrit précédemment 12 pour amplifier les régions cibles en utilisant les amorces marquées.
- Utiliser 3 pl de lysats dilués de l' étape 2.8 dans une réaction de 20 uL (voir le tableau 1) et le programme de cycle thermique suivant: 94 ° C pendant 10 min (1 cycle); 94 ° C pendant 10 s, 64 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 58 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min (4 cycles); 94 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s, et 68 ° C pendant 1 min (35 cycles).
- Résoudre 5 uL des amplicons de PCR sur un gel d'agarose à 1% pour vérifier la taille et la quantité relative d'ampliconsss = "xref"> 12.
REMARQUE: L'exécution de cette étape pour tous les échantillons est encouragée, mais pas nécessaire; la résolution d'un certain nombre d'échantillons suffisant pour estimer la quantité d'amplicons présents dans les échantillons en général.
4. Des échantillons Préparation pour Capillaire Gel Electrophoresis
- Diluer amplicons de type sauvage (cellules parentales non ciblées) et CRISPR / ADN cas9 ciblée dans l'eau exempte de nuclease à environ 2,5 ng / ul. Assurez-vous de diluer l'échantillon suffisamment d'ADN de type sauvage à ajouter à chaque échantillon d'ADN cible (un minimum de 0,5 ul d'échantillon dilué de type sauvage par échantillon ciblé est nécessaire).
- Mélanger le type sauvage et dilué des échantillons d'ADN cibles en proportion égale (par exemple, mélanger 1 pi d'échantillon de type sauvage avec 1 ul de l' échantillon cible).
- Ajouter 1 pi de amplicons mixtes à 8,7 ul de formamide désionisée et 0,3 ul de taille standard marqué par un colorant dans une plaque à 96 puits PCR qui est compatible avec l'un génétiquealyzer.
NOTE: L'utilisation d'un mélange maître du formamide et la taille standard ( par exemple, une préparation d'un pré - mélange de formamide et la taille standard dans un 29 ratio 1 avant l'addition d'amplicons pour assurer des quantités normalisées) est recommandée. - sceller hermétiquement la plaque et on chauffe les échantillons à 95 ° C pendant 3 min en utilisant un thermocycleur PCR.
- Placer la plaque sur de la glace immédiatement après l'étape de chauffage et laisser incuber pendant au moins 3 min.
5. Exécution Capillaire Gel Electrophoresis sur un analyseur génétique
- Mettre en place des paramètres de dosage, le protocole de l'instrument, et le protocole de taille appelant le logiciel d'électrophorèse sur gel capillaire relié à un analyseur génétique.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire que pour le premier essai d'électrophorèse; le programme peut être enregistré pour une utilisation ultérieure. Pour les courses suivantes, passez directement à l'étape 5.2.- Cliquez sur l'icône « Créer une nouvelle plaque » sur le tableau de bord du logiciel.
- Donnez la run nom fictif et sélectionnez les options suivantes: Nombre de puits, 96; Type de plaque, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; et polymère, POP7. Cliquez sur le bouton « Assign du contenu de la plaque ».
- Sous « Assays », cliquez sur « Créer un nouveau test »; un nouveau panneau apparaît.
- Nommez le test « FPCR-EGC dosage » et vérifier que « le type d'application » est correctement défini comme « Fragment ».
- Mettre en place le protocole d'instrument en cliquant sur le bouton « Créer un nouveau » sous « Protocole instrument. »
- Définir ou choisir les options et paramètres suivants dans les domaines appropriés: Type d'application, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; Polymère, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Nom du protocole, FPCR-EGC Protocole instrument; Four Température, 60 ° C; Run tension, 19,5 kV; Tension avant terme, 15 kV; Tension d'injection, de 1,6 kV; Durée, 1,330 s; Temps de pré-course, 180 s; Temps d'injection, 15 s; et retard de données, 1 s.
- Click sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
- Mettre en place un protocole appelant la taille en cliquant sur le bouton « Créer un nouveau » sous « Protocole Sizecalling. »
- Définir ou choisir les options et paramètres suivants dans les domaines appropriés: Nom Protocole, FPCR-EGC Protocole Sizecalling; Taille standard, GS500 (-250) LIZ; Taille-appelant, SizeCaller v1.1.0; Paramètres d'analyse, -; Analyse gamme, complète; Gamme de dimensionnement, pleine; Taille d'appel Méthode, Sud locale; Primaire de pointe, le présent; Bleu, Vert, chaînes d'Orange, (Check); Hauteur de pointe minimum, 175 pour tous les canaux; Utilisez Lissage, Aucun; Utilisez Baselining (Fenêtre de référence (Pts)), (Check) 51; Pic demi-largeur minimum, 2; Taille de la fenêtre de pointe, 15; Polynôme degré, 3; Seuil de pente crête de départ, 0,0; Seuil de pente de pointe End, 0,0; Réglages QC, -; Qualité de taille, -; Échouer si la valeur est <0,25; Passe si la valeur est <0,75; Supposons Linéarité de 0 à 80 pb0 pb; et entraînement Pull-Up drapeau si Pull-Up Ratio ≤ 0,1 et Pull-Up balayage ≤ 1.
- Cliquez sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
- Assurez-vous que le test est enregistré en cliquant sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » une fois et quitter le panneau en cliquant sur le bouton « Fermer ».
- Retour à la « Plate affectation du contenu », cliquez sur « Créer une nouvelle convention Nom de fichier » lien « Conventions Nom du fichier. »
- Nom du programme « FPCR-EGC Nom de fichier. »
- Sous la rubrique « Attributs disponibles », sélectionnez les attributs désirés qui apparaissent dans le nom de fichier (par exemple « Date de Run », « Temps d'exécution », « bien Position » et « Nom de l'échantillon »). Choisissez l'emplacement du fichier désiré où les résultats de l'exécution seront stockés.
- Cliquez sur le bouton « Appliquer à dosage », puisle bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
- Retour à la « affectation du contenu des plaques », cliquez sur le lien « Créer un nouveau groupe Résultats » sous la rubrique « Groupes de résultats. »
- Nom du programme « FPCR-EGC Résultats Groupes. »
- Sous la rubrique « Attributs disponibles », sélectionnez les attributs désirés qui apparaissent dans le nom de fichier (par exemple « Nom du test »). Choisissez l'emplacement du fichier désiré où les résultats de l'exécution seront stockés.
- Cliquez sur le bouton « Appliquer à Assay » puis sur le bouton « Enregistrer dans la bibliothèque » pour enregistrer le programme. Fermez le panneau pour continuer.
- Mettre en place le programme pour une électrophorèse exécuter en suivant les étapes ci-dessous.
- Accédez au tableau de bord et cliquez sur l'icône « Créer une nouvelle plaque ».
- Nom de la course comme on le souhaite (pour faciliter, la date, la lignée cellulaire et le nom du gène). Sélectionnez les options suivantes: Nombre de puits, 96; Type de plaque, Fragment; Longueur Capillaire, 50 cm; et polymère, POP7. Cliquez sur le bouton « Assign du contenu de la plaque ».
- Attribuer chaque puits de l'échantillon désiré (par exemple, un échantillon peut être nommé « NC » pour indiquer que le puits est un témoin négatif).
- Sous les « Assays, » « Conventions Nom du fichier » et « Groupes » Résultats boîtes, cliquez sur le bouton « Ajouter de la bibliothèque » lien et sélectionnez les programmes créés à l'étape 5.1.3 à 5.1.17.
- Mettez en surbrillance tous les puits à analyser et sélectionner les programmes pertinents sous la rubrique « Assays » « Conventions de nom de fichier » et « Groupes » Résultats en cochant les cases à côté d'eux.
- Avant de charger la plaque sur le plateau du dispositif d'analyse génétique, appliquer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la plaque à 96 puits et mettre la plaque étanche dans le boîtier en plastique qui est fourni avec l'analyseur génétique.
- Appuyez sur le bouton « plateau » à l'avant de l'analyseur génétique, et lorsque le plateau remaux de l'avant de l'équipement, ouvrir la porte et charger la plaque enveloppée sur le plateau. Assurez-vous que la plaque est verrouillée en place puis fermez la porte.
- Cliquez sur le bouton « éclisse Run ».
- Dans la page « Plaques de charge pour Run », faire une dernière vérification pour faire en sorte que tous les réactifs et les conditions sont correctes et dans l'ordre.
- Cliquez sur le bouton « Démarrer Exécuter ». Chaque série de 24 échantillons (les premiers puits 3x8 de la plaque à 96 puits) en moins de 55 min pour terminer.
6. Analyse de la Electrophérogramme pour déterminer les différences de paires de bases
- Lorsque la course d'électrophorèse capillaire sur gel est terminé, ouvrez le logiciel d'analyse pour analyser les résultats.
- Cliquez sur « Ajouter des échantillons au projet » icône et rechercher le dossier contenant les fichiers d'exécution. Rappelons de l'étape 5.1.12 l'emplacement attribué des fichiers de résultats.
- Sélectionner tous les fichiers de résultats de chaque injection dans la course et cl terminéick sur le bouton « Ajouter à la liste »; les noms de ces fichiers commencent par « Inj » et contiennent les détails de la course.
- Cliquez sur le bouton « Ajouter et analyser » pour procéder à l'analyse.
- Sélectionnez tous les échantillons dans la course en cliquant sur le premier échantillon et en faisant glisser le curseur vers le bas pour le dernier échantillon, puis cliquez sur l'icône « Afficher Tracés ».
- Pour vérifier la qualité de la taille standard, ouvrez le canal orange des résultats en vérifiant l'icône orange et décochant le reste des icônes colorées; ce qui est important de veiller à ce que la taille appel est précise et fiable.
- Pour voir les pics correspondant aux fragments dérivés du contrôle et les clones untargeted ciblés, vérifiez les icônes bleu et vert pour ouvrir des lectures de ces canaux.
- Placez le curseur sur l'axe horizontal du premier résultat intrigue et faites un clic droit pour sélectionner « Full View ». Faites défiler vers le bas pour afficher tous les résultats en un coup d'oeil pour déterminers'il y a un problème majeur avec la course. Pour zoomer sur une plage de valeurs spécifique, faites un clic droit de la souris sur l'axe concerné de la parcelle, choisissez « Zoom Pour ..., » et la clé dans la gamme des valeurs d'intérêt.
NOTE: Un problème majeur potentiel est que tous les échantillons donnent des pics de faible intensité. Ceci est généralement dû au stockage prolongé des amplicons marqué par un fluorophore avant l'exécution de l'électrophorèse capillaire ou la sur-dilution d'amplicons, qui peut être facilement rectifié en répétant l'étape de PCR, ou en diluant les amplicons en utilisant un facteur de dilution inférieur, respectivement. - Pour enregistrer les résultats, suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Assurez-vous que les canaux bleu et vert sont sélectionnés et cliquez sur l'icône « Tableau des tailles ».
- Enregistrez le tableau des valeurs en format texte délimité par des tabulations (.txt) en ouvrant « Fichier » et choisissez « Exporter la table. » Nommez le fichier en conséquence et sélectionnez l'emplacement du fichier de choix.
- Pour enregistrer l'intrigues de la course au format PDF, allez à l'option « Fichier » et cliquez sur « Imprimer ». Choisissez l'auteur PDF correspondant et appuyez sur « Imprimer ». Nommez le fichier en conséquence et sélectionnez l'emplacement du fichier de choix.
- Pour calculer la différence de la taille des fragments dérivés de contrôle de type sauvage non ciblé et les clones CRISPR / cas9 ciblées, suivre les étapes décrites ci-dessous.
- Ouvrez l'onglet fichier texte délimité (.txt) de l'étape 6.9.2 avec un programme tableur. Le tableau doit inclure ces quatre colonnes importantes: « Colorant / Sample Peak » (indiquant un canal bleu ou vert), « Nom du fichier d'échantillon » (les premiers caractères indiquent le bien ou le nom échantillon), « Taille » (en indiquant la taille de la fragment appelé), et « hauteur » (indiquant l'intensité de fluorescence du pic).
- Pour isoler les pics pertinents, exclure ceux qui ne sont pas dans la gamme de taille attendue.
NOTE: En règle générale, les mutations de indel aboutissent rarement à plusà une différence de 100 pb; Ainsi, des pics dont la taille diffère de plus de 100 pb à partir du pic de commande de type sauvage (pic dominant dans le canal vert) sont exclus. Ceci peut être facilement fait en utilisant la fonction « entre » option sous la « Mise en forme conditionnelle » dans la feuille de calcul. - Pour supprimer des pics non spécifiques, qui sont impossibles à distinguer du niveau d'arrière-plan, utilisez le « Moins » option dans la fonction « Mise en forme conditionnelle » dans le programme tableur pour exclure les pics dont les hauteurs sont inférieures à 2.000 unités. Cette valeur limite a été déterminée de manière empirique et peut donc être ajusté lorsque cela est jugé nécessaire.
- Calculer par soustraction de celui-ci de la première à la différence de taille des fragments entre chacun des pics obtenus dans le canal bleu (CRISPR / clones cas9 ciblés) et la semelle de pointe dans le canal vert (témoin de type sauvage non ciblé).
NOTE: Il est important d'utiliser les valeurs attribuées à chaque electrophor capillaireesis échantillon, comme il peut y avoir des différences inter-échantillon de la taille des fragments de contrôle de type sauvage. - Arrondir les valeurs à l'entier le plus proche pour déterminer le nombre de paires de bases qui ont été insérées dans ou supprimés à partir de, le cas échéant, la séquence génomique en question. Lorsque assommant un gène d'intérêt est, sélectionner des clones dont les mutations indel ne sont pas des multiples de 3 pb pour assurer qu'il ya dans la séquence du cadre de lecture de codage.
7. La vérification de l'état de Knockout de clones
- Développer les clones knock-out individuels de la plaque à 96 puits (à partir des étapes 2.4 et 2.6) sur une plaque à 24 puits par trypsinisation des cellules en utilisant 25 pi de 0,25% de trypsine-EDTA et incubation à 37 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 125 pi de milieu (DMEM additionné de 10% de FBS) aux cellules trypsinisées et remettre en suspension à fond.
- Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et on centrifuge à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
- Enlever autant du milieu que possible en utilisant une aspiration sous vide ou d'une pipette, remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu, et transférer la suspension cellulaire à un puits d'une plaque à 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent 80-90% de confluence.
- Développer les clones individuels en série à partir de la plaque de 24 puits à une plaque à 6 puits et de la plaque à 6 puits dans un plat quand ils atteignent 80 à 10 cm - 90% de confluence en répétant les étapes 7.1 à 7.4, en utilisant les volumes suivants: 50 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et 150 ul de milieu (pour l'expansion de la plaque de 24 puits à la plaque de 6 puits) et 200 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et 1 ml de milieu (pour l'expansion de la 6- puits d'une plaque à la boîte de 10 cm).
- Récolter les clones quand ils atteignent 80 - 90% de confluence par trypsinisation des cellules en utilisant 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 5 ml de milieu (DMEM additionné de 10% de FBS) dans les cellules trypsinisées et resuspend fond.
- Transférer la suspension cellulaire également dans deux tubes de 15 ml, centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et enlever le moyen le plus possible. Une partie des cellules est pour l'extraction de l'ADN génomique et l'autre pour l'extraction de la protéine totale.
- Pour la vérification par séquençage Sanger, suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Extrait l' ADN génomique des clones comme décrit précédemment 12.
- Effectuer une amplification par PCR de la région couvrant le site cible CRISPR / cas9, tel que décrit dans la section 3.2, mais en utilisant des amorces non marquées. Ne pas utiliser des amorces marquées pour cette étape, comme la fluorescence de la balise va interférer avec l'étape de séquençage Sanger ultérieure.
- Purifier les amplicons en utilisant un kit de nettoyage de PCR, comme décrit précédemment 12.
- Séquencer les amplicons purifiés en utilisant les amorces de PCR utilisées dans l'étape 7.9.2 pour déterminer le génotype des clones, comme décrit previously 12.
- Pour la vérification par analyse par transfert de Western, extrait de protéines totales à partir des cellules de type sauvage et des clones ciblés, comme décrit précédemment 12.
- Effectuer une analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps appropriés dirigés contre la protéine du gène cible, comme décrit précédemment 12; un véritable clone de knock-out est dépourvu de l'expression de la protéine.
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Representative Results
La technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent décrit ici est prévu pour être applicable à une région pouvant être ciblé dans le génome de pratiquement toutes les lignées cellulaires qui se prête à la livraison d'ADN étranger. Nous avons déjà démontré son application en ciblant trois gènes dans une lignée cellulaire de cancer colorectal 12. Ici, nous montrons son efficacité dans génotypage d'une lignée de cellules de carcinome hépatocellulaire, HEPG2, ciblé avec un CRISPR / cas9 construction contre l'Assemblée nucléosomes Protein 1 Comme 1 (NAP1L1) gène. En fait, nous avons utilisé avec succès la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent pour génotyper diverses autres cellules, y compris des lignées de cellules de mammifères non humains, ciblés sur de nombreux autres gènes 12, 13.
Expérience-sage, l'électrophorèse sur gel capillaire fluorescent PCR-techniqest facile et ue rapide à effectuer. Après l'introduction de l' expression cas9 et construit ARN sg dans les cellules et la sélection des clones positifs, les clones individuels sont lysées directement à partir de la plaque de culture à 96 puits en utilisant un tampon de lyse notre maison, Direct-Lyse tampon 12. Dans notre expérience, les lysats résultants peuvent être stockés pendant plusieurs mois à -20 ° C ou moins sans perte significative de qualité de l'ADN génomique. L'étape de lyse est suivie par l'étape d'amplification par PCR, ce qui implique la production d'amplicons marqués fluorophore qui couvrent la région cible CRISPR. Le protocole de PCR fluorescent fourni a été optimisé à cet effet et a toujours produit des produits de PCR amples, indépendamment de la région à amplifier. La figure 1 montre un résultat représentatif de la résolution des amplicons issus de l'étape de PCR fluorescent, chaque voie correspondant à un individu CRISPR / clone cas9-cible et les différents groupes corresponding aux régions amplifiées des alleles individuels dans les clones. Dans notre expérience, l'utilisation d'autres polymérases et leurs protocoles concomitantes a donné lieu à un rendement inférieur amplicon. Bien que ceci peut être facilement corrigé en ajustant le facteur de dilution pendant la préparation de l'échantillon pour l'électrophorèse sur gel capillaire, l'arrière-plan ou le niveau de bruit peut par conséquent être plus élevé lorsque amplicons de rendement plus faible sont utilisées. Après l'étape de PCR, les amplicons sont dilués, et celles de l'échantillon de type sauvage et les clones ciblés sont mélangés dans un rapport égal avant d'être ajoutés à un tampon de formamide désionisé et un standard de taille, dénaturé, et résolu sur un gel capillaire.
Après l'achèvement de l'électrophorèse sur gel capillaire, les résultats de génotypage sont prêts à être analysés. Deux ensembles de résultats importants sont nécessaires à partir de la piste d'électrophorèse: les électrophérogrammes contenant des pics correspondant à des signaux de fluorescence individuels et ee table de résultats contenant toutes les valeurs nécessaires pour le calcul. La figure 2 montre les résultats du génotypage de deux clones ciblés par ARNsg contre le gène NAP1L1 dans les cellules HEPG2. Les pics verts correspondent aux amplicons de l'allèle de type sauvage non ciblé dans les cellules HepG2 parentales, alors que les crêtes bleues correspondent à des amplicons des alleles de mutation contenant indel des clones CRISPR / cas9 ciblées. Comme le montre clairement, les deux clones sont des mutants homozygotes (mutants avec allèles identiques mutées), avec la suppression d'un et dix nucléotides sur les deux allèles. Il est important de noter que les électrophérogrammes sont utilisés à des fins de visualisation seulement, alors que les valeurs de crête sont importantes pour déterminer le nombre de différences de paires de bases entre l'amplicon des clones ciblés et que des cellules de type sauvage.
Pour valider l'authenticité du statut de knock-out, nous vous recommandons d'effectuerséquençage Sanger et l'analyse par transfert de Western pour confirmer la suppression de l'expression des gènes dans les cellules. Les deux clones identifiés ci - dessus ont donné des résultats de séquençage de Sanger en accord avec les résultats d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescentes (Figure 3A). Ils ont également affiché une ablation complète de l' expression des protéines NAP1L1 (figure 3B), comme prévu des clones knock - out.
Figure 1: amplicons PCR de clones HEPG2 ciblés par CRISPR / cas9 contre le NAP1L1 gène. Amplicons de l'étape de PCR fluorescent ont été séparés sur des gels d'agarose deux séparés (haut et bas), et chaque ligne correspond à un clone ciblé individuel. L: échelle d'ADN (les tailles des bandes individuelles sont données en regard du diagramme). S'il vous plaît cliquer sur sone pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Emplacements de signaux de fluorescence de deux échantillons résolvaient par Capillaire Gel Electrophoresis. L'axe horizontal représente la taille des fragments et l'axe vertical représente l'intensité du signal de fluorescence. Les pics bleues correspondent à des fragments dérivés de CRISPR / cas9 médiées par des clones ciblés, tandis que les pics verts correspondent à des fragments dérivés de cellules de type sauvage. lignes de Magenta correspondent aux positions de pointe d'appel automatique déterminées par le logiciel d'analyse, qui marque les positions qui montrent constamment des pics à travers des échantillons. Les valeurs fournies à côté de pics individuels correspondent aux tailles des fragments (en pb) et sont obtenues à partir du logiciel d'analyse. Les valeurs entre parenthèses représentent la différence calculée entre la taille individuelle fragments à partir d'un clone ciblé et le fragment de type sauvage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Les résultats des essais pour la confirmation du knock - out du gène ciblé dans deux clones. (A) les résultats de séquençage de Sanger et (B) Analyse par transfert de Western en utilisant des anticorps contre la protéine indiquée. Les nucleotides en bleu représentent la séquence cible ARN sg, ceux en rouge représentent le motif adjacent de protospacer (PAM), ceux de brun représentent des nucleotides substitués par une base, et les tirets représentent les positions dans lesquelles le nucléotide sont supprimés dans l'allèle. Les valeurs entre parenthèses à côté des noms de clones individuels représentent le génotype des allèles du clone; "-1" et « -10" signifie que les allèles contiennent une délétion d'un et dix nucléotides, respectivement la taille approximative des protéines détectées dans les analyses Western Blot:. ~ 54 kDa pour NAP1L1 et ~ 84 kDa pour p84 (contrôle de chargement). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
| Réactif | Volume pour une réaction (ul) |
| solution spécifique Kit | 4 |
| 10x PCR Tampon | 2 |
| 10 uM d'amorce sens (marqué) | 1 |
| 10 uM d'amorce inverse (non marqué) | 1 |
| 25 mM dNTP mix | 0,4 |
| ADN Taq | 0,2 |
| Eau | 8.4 |
| lysat dilué | 3 |
| Total | 20 |
Tableau 1: Les réactifs pour la PCR fluorescente réaction.
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Discussion
Le assommant d'un gène spécifique dans une lignée cellulaire modèle de choix est devenu habituel pour élucider le rôle que le gène joue dans ce contexte cellulaire particulier. En fait, plusieurs écrans à l' échelle du génome sont actuellement disponibles qui utilisent le système de CRISPR / cas9 pour cibler des gènes humains pratiquement tous connus dans le génome 14, 15, 16. Avec ces écrans à grande échelle (ou même à petite échelle ciblant des gènes individuels d'intérêt), il est important de concevoir et d'utiliser sgRNAs ciblant différents lieux du même gène. Des résultats cohérents entre les différents sgRNAs utilisés serait capituler sans ambiguïté le véritable effet de l'épuisement du gène. En tant que tel, le ciblage d'un gène unique nécessiterait une étape de génotypage à haut volume pour le génotype avec précision une multitude de clones provenant de chaque individu de l'ARN sg utilisé. La technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent décrit ilre peut précisément effectuer cette tâche.
Alors que la plupart des méthodes de génotypage existantes se prêtent à des fins à haut débit, chacun d'entre eux souffre de certaines limitations inhérentes qui les rendent moins qu'idéal. Le géomètre, ou T7E1, le dosage, qui détecte des mésappariements de l'ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de faire la différence entre les cellules de type sauvage et des mutants homozygotes (clones avec deux allèles mutés à l' identique) en raison du fait que ces deux clones produisent des duplex dépourvu de mésappariements 11. L'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP), qui signale la disparition de sites de restriction due à des mutations indel dans la région cible de CRISPR 17, est limitée par la disponibilité des sites de restriction appropriés dans la région cible 18. La technique d'analyse d' ADN de fusion, qui discerne les différents génotypes en fonction de leurs courbes de fusion 19, 20, souffre d'un manque de cohérence. En outre, tous les trois de ces méthodes ne sont pas particulièrement instructif en ce sens qu'ils ne signalent pas l'apparition d'un cadre de lecture dans la séquence génétique. En revanche, le séquençage Sanger - qui est actuellement la technique de génotypage les plus populaires - est extrêmement instructif, car il fournit la séquence exacte de la région génomique étant ciblée. Cependant, cette technique est coûteuse, en particulier dans des expériences à grande échelle. Ainsi, la caractérisation de la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent décrit ici est essentiel, car il peut contourner toutes les limitations auxquelles sont confrontés les autres techniques décrites ci-dessus.
La technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent permet aux utilisateurs de faire la distinction entre les génotypes possibles d'un clone peuvent exister sous-type sauvage, le mutant hétérozygote (caractérisé par un allèle de type sauvage et un allele mutant), mutant homozygote (caractérisé par deux identalleles mutants ical) et mutant hétérozygote composé (caractérisé par deux alleles mutants non identiques). Ces génotypes sont facilement différentiables par les modèles de pointe dans le électrophérogramme. De plus, cette technique de génotypage indique la différence entre la taille des fragments de l'amplicon de type sauvage et celle des clones ciblés et précis à une seule paire de base. Cela rend effectivement la présence ou l'absence d'un cadre de lecture dans la séquence génétique, ce qui permet aux utilisateurs de réduire leur validation à une poignée de clones, leur permettant d'économiser du temps et de coût. En plus de cela, cette technique permet également le multiplexage de ciblage génique ( par exemple, il peut génotyper simultanément plus d'une cible), et il permet la détection d'une population hétérogène de cellules de la présence de motifs de pointe aberrantes (par exemple, la présence d'au moins trois pics dans l'électrophorégramme de cellules diploïdes). En plus des lignées cellulaires utilisées ici et précédemment 12 </ sup>, 13, nous avons également génotypés avec succès divers autres lignées de cellules humaines et non humaines, y compris des cellules souches et des cellules neuronales (données non publiées), en utilisant la technique d'électrophorèse sur gel PCR-capillaire fluorescent, et nous prévoyons que cette technique est applicable pour toutes les cellules qui se prêtent à un ciblage CRISPR / cas9. De plus, étant donné que cette technique rapporte le génotype d'allèles individuels dans la cellule, il est extrêmement utile dans génotypage cellules multi-alléliques, telles que les cellules cancéreuses qui ont aneuploïdie ou amplifications génétiques.
Le protocole décrit ici (y compris tout le matériel utilisé) a été optimisé pour le génotypage polyvalent et reproductible de CRISPR / clones cas9 ciblés. Néanmoins, il y a certaines parties qui justifient la modification. Ils comprennent, sans s'y limiter: 1) l'utilisation d'un autre vecteur d'expression de ARNsg (ou stratégie de clonage), ce qui peut nécessiter l'utilisation d'une autre stratégie de sélection(Par exemple, la sélection de clones antibiotique au lieu de FACS); 2) l'utilisation d'une polymérase différente pour l'étape de PCR fluorescent; et 3) l'utilisation de différents marqueurs fluorescents. En outre, il convient de noter que deux étapes essentielles du protocole peut se révéler problématique. D'une part, les amplicons de PCR fluorescents peuvent donner des bandes non spécifiques dans l'électrophorégramme sur gel d'agarose, ou le motif de crête dans l'électrophorégramme sur gel capillaire peuvent être « bruyant ». Cela est probablement dû à la qualité sous-optimale des amorces de PCR et peut donc être rectifié par une nouvelle conception de ces amorces. Nous vous recommandons de tester la qualité des amorces utilisant des oligonucléotides non marqués avant procurer les fluorophores marqué pour assurer la cohérence, la reproductibilité et la spécificité de l'étape d'amplification. L'autre facteur important est de noter l'efficacité de l'ARN guide CRISPR, qui peut déterminer le taux d'obtention de vrais clones positifs knock-out. Étant donné qu'aucun de la recherche ARNsg progbéliers qui sont actuellement disponibles sont à toute épreuve, l'efficacité de chaque ARNsg individuelle ne peut être déterminée de manière empirique. Ainsi, il est important de concevoir et d'utiliser plus d'un ARNsg (de préférence trois ou plus) pour chaque gène ciblé pour réduire le risque de ne pas obtenir un clone de knock-out réussi.
Alors que la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent est informative, sensible et facile à utiliser, il est livré avec quelques mises en garde. Tout d'abord, cette technique nécessite l'utilisation d'un analyseur génétique, qui ne peuvent pas être facilement disponibles. Cependant, étant donné que l'analyseur génétique utilisé à cet effet est le même que celui utilisé pour des expériences de séquençage Sanger, le protocole d'électrophorèse sur gel capillaire peut être confiée à des fournisseurs de services de séquençage Sanger existants. En fait, nous avons déjà organisé avec notre fournisseur de services de séquençage pour exécuter le protocole d'électrophorèse sur gel capillaire à un coût comparable à celui lorsque vous avez terminé en interne. En second lieu, la précision de la techniqpeut souffrir quand UE mutations indel plus de 30 pb sont impliqués. Dans notre expérience, la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescente a tendance à sous-estimer la taille des indels quand un grand indels (> 30 pb) sont observées. Cependant, dans notre expérience, une grande majorité des mutants affichés très courte longueur de mutation indel (la plupart sont à moins de 5 pb). Néanmoins, cela dépend fortement du site cible CRISPR et la lignée cellulaire utilisée. En troisième lieu, la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescente est incapable de détecter des substitutions de bases lors de la réparation NHEJ au niveau du site de coupure CRISPR / cas9. Néanmoins, il a été rapporté que la substitution de base à la suite de la réparation NHEJ des cassures double brin est un événement rare 21, et ils ne modifient pas de manière délétère le cadre de lecture du gène. Quatrièmement, cette technique ne détecte que des changements dans la région cible amplifié dans l'étape de PCR fluorescent et donc ne compte pas les aberrations hors-cible (changements génétiques OÜtside la région amplifiée). Si une telle enquête exhaustive des effets hors cible des différents ARNsg CRISPR est nécessaire, nous recommandons le séquençage complet du génome pour détecter avec précision les changements dans le génome des clones ciblés. Cependant, cette expérience plutôt coûteuse est pas nécessaire si plus d'un ARNsg est utilisé par gène ciblé, comme indiqué plus haut. Enfin, la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescente décrite ici a une limite de taille de fragment de 600 pb. Cela peut poser un problème si la région cible est constituée de séquences répétées ou a un contenu exceptionnellement élevé guanine-cytosine (GC), ce qui peut affecter l'efficacité de l'amplification par PCR et la spécificité. Ce problème facilement évitable souligne l'importance de la conception cible de ARNsg attention, qui doit prendre en considération appropriée pour l'amplification appropriée de la région ciblée. Ainsi, compte tenu des forces et des mises en garde de la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, ce procédé facile de génotypagepeut alléger le fardeau de génotypage à haut volume de clones knock-out, qui reste un goulot d'étranglement à ce jour.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Mme Tan Shi Min, Mme Helen Ong, et le Dr Zhao Yi pour aider avec les expériences d'électrophorèse sur gel capillaire. Ce travail a été soutenu par NMRC / IRG accorder NMRC / 1314/2011 et MOE ACRF Niveau 2 subvention du Fonds MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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